針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞上BDNF表達(dá)的siRNA篩選及其抑制效應(yīng)檢測(cè)

王麗娜，王秀云，左劍玲，許期年，朱衛(wèi)東，賈曉明，楊建平

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，同時(shí)也能維持成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的正常功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［1］，BDNF在脊髓水平傷害感受的調(diào)制中發(fā)揮了重要作用。最近研究更是將疼痛、神經(jīng)元、BDNF和小膠質(zhì)細(xì)胞四者緊密的連接在了一起［2～4］。作為溝通神經(jīng)元－小膠質(zhì)細(xì)胞的重要信息分子，我們已發(fā)現(xiàn)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的BDNF在大鼠骨癌痛痛覺(jué)過(guò)敏中也起著至關(guān)重要的作用(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。為了進(jìn)一步研究BDNF在骨癌痛痛覺(jué)過(guò)敏形成中的作用，本文設(shè)計(jì)了針對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，擬采用經(jīng)典的 LipofectamineTM2000為轉(zhuǎn)染劑，旨在尋找體外可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞源性BDNF表達(dá)的低毒，高效的干擾基因系列，為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。此外，鑒于BDNF與小膠質(zhì)細(xì)胞的功能密切相關(guān)，本文還觀察了應(yīng)用經(jīng)篩選驗(yàn)證的高效低毒的BDNFsiRNA后，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的標(biāo)記物OX-42表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株:HAPI細(xì)胞株，來(lái)源于美國(guó)賓西法尼亞州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室，由南通醫(yī)學(xué)院施建華博士惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 LipofectamineTM2000(批號(hào):11668－019，Invitrogen公司，美國(guó))。兔抗大鼠 BDNF一抗(批號(hào):ab72439，Abcam公司，美國(guó))、小鼠抗大鼠βactin一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司，美國(guó))。小鼠抗大鼠 OX-42/CD11b多克隆抗體(Chemicon/Millipore公司，美國(guó))。Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 、Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG(H+L)和Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(Molecular Probes公司，美國(guó));通用型熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照FAM-siRNA由上海吉瑪制藥有限公司合成。Hoechst 33258(批號(hào):861405，Sigma公司，美國(guó))。定量PCR試劑盒(羅氏公司，美國(guó));PCR引物及內(nèi)參由上海生物工程有限公司合成(HPLC純化)。

1.1.3 基因序列 根據(jù) E1bashir的設(shè)計(jì)原則［5］，查找SD大鼠BDNF基因序列(GenBank accession#NM_012513)并設(shè)計(jì)3個(gè)siRNA序列(根據(jù)靶序列起始位置命名為3對(duì)siRNA1588，siRNA283，siRNA232)及1條帶合成綠色熒光標(biāo)記(FAM)的通用陰性對(duì)照FAM-siRNA，由上海吉瑪制藥有限公司合成，序列經(jīng)BLAST查詢，排除與其他基因同源。所有siRNA均只有21對(duì)堿基，滿足G/C含量＜50，且在正、反義3'端分別有2個(gè)不配對(duì)的TT游離堿基。序列如下:

Tab 1 siRNA oligo

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 永生化大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)蘇后，用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素和1×105U·L－1鏈霉素)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱37℃、5%CO2、95%濕度條件下，每1～2 d換液。轉(zhuǎn)染時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索，約在傳代2～3次后達(dá)到)接種于6孔板(用于檢測(cè)表達(dá)及熒光顯微鏡拍照計(jì)算轉(zhuǎn)染效率)或96孔板(用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))，加入不含抗生素的適量DMEM培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

1.2.2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度的優(yōu)化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別接種于6孔板或96孔板穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后進(jìn)行“偽”轉(zhuǎn)染，即只加入相同容量的細(xì)胞毒性較大的LipofectamineTM2000，分別于轉(zhuǎn)染前即刻及轉(zhuǎn)染24 h后光鏡拍照，以估算最合適的細(xì)胞接種密度。其中24孔板的接種梯度為:0.5×106、1×106、2×106;96 孔板的接種梯度為:3 ×103、1 ×104。每孔梯度組分別重復(fù)4～6復(fù)孔。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)染比例的優(yōu)化 綜合考慮LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染劑要求及我們以往的轉(zhuǎn)染經(jīng)驗(yàn)［6］，分別選擇脂質(zhì)體8 μl與相應(yīng)劑量的siRNA混勻形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，使其終濃度分別為40 μmol·L－1(1∶4)、50 μmol·L－1(1 ∶3)、80 μmol·L－1(1 ∶2);分別按照轉(zhuǎn)染劑說(shuō)明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的時(shí)間，6孔細(xì)胞板于轉(zhuǎn)染時(shí)換液，每孔先加入1 ml培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物0.1 ml單獨(dú)混合孵育30 min(混合時(shí)間已經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索)后，加入6孔板與培養(yǎng)基輕柔混勻，補(bǔ)充培養(yǎng)液至終容積為2 ml/孔，然后放入CO2孵箱中孵育。每孔梯度組分別重復(fù)4～6復(fù)孔。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定 6孔板的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，在培養(yǎng)液中加入Hoechst 33258(終濃度5 mg·L－1)孵育10 min染核，用DPBS洗3遍后，4℃遮光預(yù)冷的丙酮固定10 min，PBS洗3遍，以特制的圓形蓋玻片加抗熒光淬滅封片劑(碧云天公司，江蘇海門)封片。速將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下(OLYMPLUS BX60)觀察轉(zhuǎn)染效率，選擇在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm下觀察FAM的綠色表達(dá)，在594 nm下觀察Hoechest 33258的藍(lán)色表達(dá)，以100倍的視野為標(biāo)準(zhǔn)，兩人同時(shí)獨(dú)立估計(jì)相同視野下綠色熒光細(xì)胞數(shù)與藍(lán)色熒光的總細(xì)胞數(shù)百分比，求FAM表達(dá)率:FAM表達(dá)率(轉(zhuǎn)染效率)=發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)/發(fā)藍(lán)色熒光的細(xì)胞總數(shù)。共計(jì)5個(gè)視野取其平均值作為轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24h后，采用改良的磺基羅丹明 B 法(sulforhodamine B，SRB)［7］進(jìn)行各轉(zhuǎn)染條件下轉(zhuǎn)染復(fù)合物細(xì)胞毒性的測(cè)定。于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(LP400型號(hào)，BioRAD公司，美國(guó))上選擇最適波長(zhǎng)490nm讀數(shù)測(cè)定光吸收值，并重復(fù)3次取平均值。每孔測(cè)量組分別重復(fù)6～8復(fù)孔。計(jì)算公式如下:細(xì)胞存活率/%=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%。

1.2.2.5 BDNFsiRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 選用 siRNA與LipofectamineTM2000最佳轉(zhuǎn)染比例，混勻形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染方法同上。所有的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

1.2.3 Real-Time PCR測(cè)定 采用TRIzol一步法總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA。每份標(biāo)本取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄酶，按試劑盒說(shuō)明操作合成cDNA及PCR擴(kuò)增。BDNF引物序列(134 bp):sense 5'-CTGACACTTTTGAGCACGTGATC-3'，antisense 5'-AGGCTCCAAAGGCACTTGACT-3';18 s內(nèi)參引物(134 bp):sense 5'-AACGAGACTCTCGGCATGCTAA-3'，antisense 5'-CCGGACATCTAAGGGCATCA-3'。采用染料法(SYBR Green I)進(jìn)行Real-Time PCR(MJ Research OpticonTM2熒光定量PCR儀，美國(guó))，使其最終反應(yīng)體系為25 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min后，95℃變性 15 s→58℃退火20 s→72℃延伸45 s，80℃讀板1 s，共45個(gè)循環(huán)后繪制熔解曲線，72℃再延伸5 min。經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合熔解曲線摸索最佳反應(yīng)條件，采集各自的熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)，并至少設(shè)4～6復(fù)孔進(jìn)行重復(fù)，取其平均值，采用2－△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)的變化。

1.2.4 Western blot測(cè)定 常規(guī)ABC法抽提蛋白，變性后經(jīng)10聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至聚乙烯二氟膜上，濾膜封閉2 h，分別加入一抗(BDNF:1∶100;β-actin:1∶5 000)4℃過(guò)夜;洗膜3次;二抗(山羊抗兔:1∶2 000;山羊抗小鼠:1∶10 000)室溫1 h;加發(fā)光劑ECL，曝光壓片、拍照、BIO-ID圖像分析軟件分析，計(jì)算條帶的積分光密度值(ID)，ID值為平均光密度值(D)×面積。用積分光密度值相對(duì)比較蛋白的表達(dá)。

1.2.5 熒光免疫組織化學(xué)測(cè)定 各藥物處理組(溶媒組，陰性對(duì)照組，BDNF siRNA1588組)細(xì)胞經(jīng)固定后，取出6孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片，按照熒光免疫組化流程分別經(jīng)血清室溫孵育后，滴加兔抗大鼠BDNF(1∶50)或小鼠抗大鼠OX-42一抗(1∶200)(如為雙標(biāo)則混合滴加，效價(jià)加倍)，濕盒4℃下過(guò)夜，再滴加二抗(Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG或Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG，雙標(biāo)時(shí)混合滴加，效價(jià)加倍;OX-42單標(biāo)使用 Alexa Fluor 488 goat antimouse IgG)，室溫孵育3 h。切片漂洗數(shù)次后用激光共聚焦熒光顯微鏡(TLS SP2 CLSM型號(hào)，Leica，德國(guó))觀察。每個(gè)藥物組隨機(jī)選取6張爬片進(jìn)行數(shù)碼拍照，由不知情的實(shí)驗(yàn)員應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(Image Pro-plus 6.0，USA)分別對(duì)相同測(cè)量面積內(nèi)的染色進(jìn)行灰度分析，計(jì)算免疫陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度值(IOD/area)，計(jì)算方法為積分光密度(integrated optical density，IOD)除以測(cè)量面積(area)，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立空白和吸附對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化結(jié)果 轉(zhuǎn)染前即刻及轉(zhuǎn)染后24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照發(fā)現(xiàn):6孔板中接種梯度為1×106的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞融合度高(數(shù)據(jù)未顯示)，且轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)仍疏密合適。96孔板的接種梯度為1×104的細(xì)胞密度最合適。此外，本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了部分轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2～3次細(xì)胞傳代，30 min脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物形成時(shí)間，轉(zhuǎn)染效率最高。

此外，從Tab 2中可見(jiàn)轉(zhuǎn)染劑相同劑量8 μl下，與 40 μmol·L－1(1 ∶4)、80 μmol·L－1(1 ∶2)組相比，50 μmol·L－1(1 ∶3)siRNA 的轉(zhuǎn)染效率最高(P＜0.01)，最高可達(dá)到(92.2±8.3)%。而SRB結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染劑相同劑量 8 μl下，40 μmol·L－1和 50 μmol·L－1siRNA組的細(xì)胞存活率均達(dá)到75%以上，細(xì)胞毒性較低。由此可知，應(yīng)選擇LipofectamineTM2000 8 μl復(fù)合 50 μmol·L－1siRNA(脂質(zhì)體與siRNA比例為1∶3)，不僅細(xì)胞毒性低而且轉(zhuǎn)染效率高，為最佳轉(zhuǎn)染條件。詳見(jiàn)Tab 2，F(xiàn)ig 1。

Tab 2 The transfection efficiency and survival rate of transfected cells under different transfection conditions(ˉ±s，n=6)

Tab 2 The transfection efficiency and survival rate of transfected cells under different transfection conditions(ˉ±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs group 50 μmol·L －1

Concentration of siRNA/μmol·L －1 40 50 80 Ratio for siRNA and LipofectamineTM2000(W/V)1∶4 1∶3 1∶2 Transfection efficiency/% 77.3 ±3.3＊＊ 92.2 ±8.3 83.2 ±9.3＊＊Survial rate of transfected cells/% 82.6 ±6.3＊＊ 75.2 ±4.3 61.3 ±9.5＊＊

2.2 Real-Time PCR測(cè)定結(jié)果 轉(zhuǎn)染后24 h，溶媒組(僅加LipofectamineTM2000)和陰性對(duì)照組的BDNF mRNA表達(dá)沒(méi)有差異(P＞0.05);BDNF siRNA 3個(gè)組的BDNF mRNA表達(dá)與陰性對(duì)照組相比均有一定程度的降低，且siRNA1588抑制小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF基因表達(dá)最為明顯(P＜0.01)。詳見(jiàn)Fig 2A。

2.3 Western blot測(cè)定結(jié)果 轉(zhuǎn)染后48 h，溶媒組和陰性對(duì)照組的BDNF蛋白質(zhì)表達(dá)沒(méi)有差異(P＞0.05);BDNF siRNA 3個(gè)組的對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的BDNF蛋白表達(dá)均有不同程度的抑制，siRNA1588抑制程度最大，詳見(jiàn)Fig 2B。

Fig 1 The transfection efficiency after 50 μmol·L －1siRNA treatment

2.4 熒光免疫組化測(cè)定結(jié)果 熒光雙標(biāo)共聚焦顯微成像表明:BNDF和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物OX-42存

在共表達(dá)，該結(jié)果說(shuō)明BNDF和OX-42共存于同一細(xì)胞水平(Fig 3A)，為BNDF干擾小膠質(zhì)細(xì)胞的活性提供了直接的形態(tài)學(xué)證據(jù)。

此外，溶媒組，陰性對(duì)照組以及siRNA1588組的OX-42染色 IOD/area分別為:0.38±0.01，0.32±0.03以及0.15±0.03。與溶媒組，陰性對(duì)照組(兩對(duì)照組間 IOD/area無(wú)差異，P＞0.05)相比，siRNA1588處理組的OX-42染色明顯減淡，IOD/area明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見(jiàn)Fig 3。

Fig 2 Down-regulation of BDNF mRNA andprotein upon treatment with siRNA

3 討論

Fig 3 BDNF/OX-42 expression of cellsby immunohistochemistry staining

siRNA技術(shù)與傳統(tǒng)的反義寡核苷酸技術(shù)相比較，具有嚴(yán)格的序列特異性、高效性，基因抑制效果明確、治療的針對(duì)性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)勢(shì)。然而神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞系，包括神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，相對(duì)于其他細(xì)胞系來(lái)講，是較難轉(zhuǎn)染的一類細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)室雖已有轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)［4］，但針對(duì)不同基因的干擾，要想獲得體內(nèi)外的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，仍舊需要不斷摸索轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染劑的種類。因此，我們同時(shí)研究了細(xì)胞傳代次數(shù)、接種密度、轉(zhuǎn)染復(fù)合物的比例及形成時(shí)間等對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，以優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn):2～3次細(xì)胞傳代，1×106接種密度(6孔板)、1∶3的脂質(zhì)體與siRNA比例、30 min的復(fù)合物形成時(shí)間，轉(zhuǎn)染效率最高。

此外，提高轉(zhuǎn)染效率與降低毒性是兩個(gè)密切相關(guān)的概念，一種基因轉(zhuǎn)染載體真正應(yīng)用于基因治療臨床必須同時(shí)具有這兩個(gè)特性。因此本研究同時(shí)采用了SRB法分析轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性。與傳統(tǒng)的噻唑藍(lán)法(3-4，5 diemethylthiazol-2，5 dipheuyl tetrazolium bromide，MTT)測(cè)量相比，SRB法克服了MTT法成色反應(yīng)的時(shí)間依賴性，同時(shí)SRB法沒(méi)有MTT試驗(yàn)具有的嚴(yán)格時(shí)間窗，從而使大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)變得更加便利［7］。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LipofectamineTM2000 8μl復(fù)合50 μmol·L－1siRNA(脂質(zhì)體與siRNA比例為1∶3)，不僅細(xì)胞毒性低而且轉(zhuǎn)染效率高，為最佳轉(zhuǎn)染條件。

正常情況下，脊髓部位固有的BDNF主要來(lái)源于感覺(jué)神經(jīng)纖維在脊髓的逆行性釋放。在疼痛狀態(tài)下，脊髓部位的小膠質(zhì)細(xì)胞是BDNF分泌的主要來(lái)源。新近研究表明［8～10］，BDNF 是一個(gè)重要的聯(lián)系神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞間信息傳遞和“對(duì)話”(crosstalk)的信號(hào)分子。我們基于BDNF中和抗體鞘內(nèi)給藥的前期研究表明(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，脊髓BDNF在大鼠骨癌痛痛覺(jué)過(guò)敏中起著重要作用。為了進(jìn)一步研究BDNF在骨癌痛中的作用，我們擬采用 BDNF siRNA在體給藥技術(shù)進(jìn)行深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并觀察了針對(duì)BDNF的siRNA對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的干擾效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn):以LipofectamineTM2000為轉(zhuǎn)染試劑，化學(xué)合成的BDNFsiRNA可成功實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染。且結(jié)合于小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF mRNA不同位點(diǎn)上的siRNA對(duì)靶基因表達(dá)的抑制活性不同，其中以siRNA1588的抑制效果最好，為我們進(jìn)一步利用該技術(shù)研究BDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨癌痛中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

此外，本文通過(guò)熒光免疫組化結(jié)合共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，BDNF與小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物OX-42共存，為BDNF干擾提供了直接的解剖學(xué)證據(jù);且與對(duì)照組相比，經(jīng)BDNF siRNA1588處理的小膠質(zhì)細(xì)胞活性明顯降低(OX-42的IOD值降低)。該結(jié)果說(shuō)明BDNF在小膠質(zhì)細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)中具有重要作用，針對(duì)BDNF為靶點(diǎn)進(jìn)行的體內(nèi)外干預(yù)可能可以通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，從而治療痛覺(jué)過(guò)敏。

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