m3AChR-G11α融合蛋白表達(dá)及功能檢測

白立川，郭政東，張雪薇，孫 科，姜愛民

毒蕈堿型乙酰膽堿受體(mAChRs)是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員之一，具有該家族特征性的分子結(jié)構(gòu)及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，由7個跨膜區(qū)，3個膜內(nèi)環(huán)和3個膜外環(huán)以及位于胞外的N端及位于胞內(nèi)的C端構(gòu)成，通過與不同的G蛋白相偶聯(lián)介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。mAChR由5種亞型m1～m5構(gòu)成，經(jīng)激動劑活化后，與異三聚體 G-蛋白(Gα～GDPβγ)形成受體－配體-G蛋白異三聚體復(fù)合物，并使G蛋白活化，即 Gα～GDPβγ解離成 Gα～ GDP 和 Gβγ亞基，同時Gα亞基上的GDP被GTP替換從而興奮下游效應(yīng)器，引起生物學(xué)效應(yīng)。mAChR受體與G蛋白的融合使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子間具有精確的1∶1的化學(xué)定量關(guān)系及相互毗鄰的空間位置，使緊緊錨定在細(xì)胞膜上，且不受內(nèi)源性G蛋白的影響［1］。

本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，將編碼m3AchR與G蛋白G11α亞單位的cDNAs進(jìn)行重組，通過Baculovirus-infected Insect cells在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)m3AChR-G11α融合蛋白［2－3］，利用［3H］QNB 放射性配體飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)和［35S］GTPγS放射性配體競爭替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測這種高效偶聯(lián)的融合蛋白的偶聯(lián)功能，闡明m3AChR-G11α與G蛋白G11α亞單位相互作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及影響因素，鑒別和尋找m3受體亞型特異性配體。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人m3AChR與牛G11，的cDNAs，桿狀病毒載體質(zhì)粒pBacPAK9 cDNAs購于TaKara Co;乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、卡巴膽堿(carbachol，CCh)、匹魯卡品(pilocarpine)、MCN-A-343、4-damp、阿托品(atropine)、GDP、GTPγS 及達(dá)菲那新等藥品受贈于日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部腦生化研究室。PCR反應(yīng)試劑盒購于寶生物公司。BCA法測定膜蛋白濃度試劑盒購于寶信公司。Sf9昆蟲細(xì)胞株由北京大學(xué)生命科學(xué)院陳建國教授所贈;TNM-FH昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購于Sigma公司;胎牛血清購于TBD公司;放射性配體［3H］二苯羥乙酸奎寧酯(［3H］QNB 17.8 PBq·mol－1)購于 Amersham Pharmacia Biotech 公司，［35S］GTPγS(40 TBq·mmol－1)購于中國同位素公司。

1.2 構(gòu)建重組 pBacPAK9-M3-G11α的表達(dá)載體通過兩步PCR方法構(gòu)建的m3AChR-G11α的cDNAs的融合，第1步PCR方法分別應(yīng)用m3和G11，的擴(kuò)增引物，94℃ 30 s，55℃ 30 s，74℃ 60 s，30 個循環(huán)。第2步PCR:取 m3AChR 與 G11α的 cDNAs片段各6 μl，加入緩沖液、dNTPs、聚合酶，94℃ 30 s，60℃ 30 s，74℃ 60 s，5 個循環(huán)后加入引物(M3BamH1、G11αsalⅠ)，94℃ 30 s，55℃ 30 s，74℃ 60 s，20 個循環(huán)。T4連接酶的作用下，通過應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BamH1、salⅠ將外源性 m3AChR-G11α的 cDNAs 插入到pBacPAK9的 cDNAs載體中，形成重組的pBacPAK9-m3AChR-G11α的表達(dá)載體 m3的擴(kuò)增引物:m3-BamHⅠ5'-GGATCCATCACCTTGCACAATAAC-3'，m3-C 末端 5'-CAAGGCCTGCTCGGTGCGCGC TT-3'，G11α的 擴(kuò) 增 引 物:m3-G11α5'-GCAGGCCTTGATGCGCATCATCCA-3'，G11α-Sal Ⅰ 5'-CCTCAGGCGTCGACAAAATATGAA-3'

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒轉(zhuǎn)染 從冷凍冰箱中取出凍存的Sf9細(xì)胞，在室溫下快速復(fù)蘇，而后使其附壁生長于含有8%胎牛血清的TNM-FH昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶放于27℃ ±1℃培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)Sf9細(xì)胞生長至50%融合時，轉(zhuǎn)染重組的pBacPAK9-m3AChR-G11α表達(dá)載體，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，收集Sf9細(xì)胞，置于－70℃冰箱中備用。

1.4 膜蛋白的制備及BCA法測定膜蛋白濃度取－70℃凍存的Sf9細(xì)胞沉淀，放于冰盒中，用預(yù)冷的勻漿緩沖液重懸起Sf9細(xì)胞沉淀，倒入Dounce勻漿器中，冰浴中勻漿20次，在低溫(4℃)下，15 000×g離心30 min，重復(fù)1次，棄上清，收集沉淀，取部分沉淀用BCA蛋白測定法測定蛋白含量，其余沉淀分裝后置于－70℃冰箱中凍存?zhèn)溆茫?］。

1.5 ［3H］QNB放射性配體飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)和［35S］GTPγS放射性配體競爭替代結(jié)合實(shí)驗(yàn) 取10 μl膜蛋白樣品，分別加入(1～6)×10－9mol·L－1的［3H］QNB放射性配體10－5L進(jìn)行放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，檢測融合蛋白的活性及表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分兩組系列管，即總結(jié)合管(TB)及非特異性結(jié)合管(NB)，在非特異性結(jié)合反應(yīng)管中加入10－5mol·L－1阿托品(atropine)。特異性結(jié)合的放射性配體數(shù)量等于總結(jié)合管結(jié)合的放射性配體數(shù)減去非特性結(jié)合管結(jié)合的放射性配體數(shù)，依據(jù)張幼怡主編的《受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方法》一書中的計算公式，計算出表達(dá)的融合蛋白的含量。在［35S］GTPγS放射性配體競爭替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中，依次加入用HEN緩沖液稀釋的膜蛋白，藥品(10－3mol·L－1ACh、10－3mol·L－1Pilo、10－3mol·L－1CCh、10－3mol·L－1MCN-A-343、10－6mol·L－1Atro、10－6mol·L－14-Damp、10－6mol·L－1Dafi)進(jìn)行功能檢測。

1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 10.0及Excel軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建重組的融合蛋白m3AChR-G11αcDNAs

2.1.1 分別擴(kuò)增 m3AChR 與的 G11αcDNAs 通過PCR的方法分別擴(kuò)增 m3AChR與的 G11αcDNA，50 μl L l反應(yīng)體系經(jīng)30個循環(huán)后，分別取出5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳，電泳圖片如圖Fig 1A、Fig 1B所示，F(xiàn)ig 1A為G11αcDNA，片段長度為1 065 bp;Fig 1B為m3cDNA，片讀長度為1 773 bp。

Fig 1A The PCR product of G11αcDNA. The right lane was G11α(1 065 bp)，and the left lane was DNA marker.Fig 1B The PCR product of m3cDNA. The right lane was m3(1 773 bp)，and the left lane was DNA marker

2.1.2 通過 2步 PCR 實(shí)現(xiàn) G11αcDNA 與 m3cDNA的連接 通過第二次PCR，使m3AChR 3'端與 G11α5'端連接，得到連接的 m3AChR-G11α的 cDNAs，電泳結(jié)果如Fig 2所示，右側(cè)的條帶為m3AChR-G11α的目的條帶，片段長度為2 835 bp。

2.2 將病毒重組體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞 從深凍冰箱中取出凍存的Sf9細(xì)胞，在37℃水浴中迅速融化，復(fù)蘇后放入27℃ ±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)換液、傳代穩(wěn)定后在倒置顯微鏡(×400倍)下觀察細(xì)胞形態(tài)。正常的Sf9細(xì)胞小而圓，半貼壁生長，3～4 d后可長成單層，局部生長呈蜂窩狀(Fig 3A)。當(dāng)傳代細(xì)胞生長至50%融合時，轉(zhuǎn)入重組的病毒載體，72 h后觀察接種病毒重組體的細(xì)胞，鏡下可見細(xì)胞腫脹，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，脫落，大量脹大、破碎細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中(Fig 3B)。

Fig 3A Normal Sf9 cells Fig 3B The Sf9 cells infected by recombinant virus

2.3 用BCA法測定Sf9細(xì)胞膜蛋白的濃度 收集Sf9細(xì)胞沉淀、經(jīng)勻漿離心后制得膜蛋白，適量稀釋，取部分膜蛋白溶液用BCA蛋白測定法測定膜總蛋白的含量。將其測得的光密度值用Excel軟件處理后，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，并可得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線方程為^Y=0.931 8X －0.098 9，r2=0.099 1，以此方程可計算出樣本中的蛋白濃度為2.86 g·L－1。

2.4 ［3H］QNB放射性配體飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn) Fig 4顯示m3AChR-G11α融合蛋白與［3H］QNB放射性配體具有高特異性的結(jié)合位點(diǎn)，隨著［3H］QNB放射性配體濃度的不斷升高，融合蛋白與［3H］QNB的結(jié)合量隨著增加，當(dāng)［3H］QNB濃度為約6×10－9mol·L－1時，基本達(dá)到飽和，表達(dá)水平為 7.76 ×10－9mol·g－1，融合蛋白具有m受體與配體高度親和力的特性，可用于檢測m3與G11α相互作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及影響因素的研究。在10－5mol·L－1GTPγS存在的條件下，融合蛋白與［3H］QNB放射性配體結(jié)合的飽和結(jié)合曲線明顯下移，此時在達(dá)到飽和時測得的融合蛋白表達(dá)水平為 3.92 ×10－9mol·g－1，提示GTPγS通過與G蛋白的α亞單位結(jié)合，降低了非選擇性m受體阻斷劑QNB與m3受體的親和力，反映出融合蛋白兩組分間的偶聯(lián)能力。從而為進(jìn)行［35S］GTPγS放射性配體競爭替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選m3受體亞型特異性藥物提供了有利的依據(jù)。

Fig 4 ［3H］QNB binding studies on stable expressed m3AChR-G11αfusion protein in Sf9 cells withor without GTPγS(n=5)

2.5 不同配體作用下，GDP 對［35S］GTPγS競爭替代結(jié)合曲線的影響 Fig 5顯示不同種類配體對GDP 替代［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合產(chǎn)生不同的影響。在各種不同配體存在的作用下，［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白結(jié)合量不同。在 10－9～10－3mol·L－1GDP 存在時，ACh、Pilo使［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合量明顯增多，使［35S］GTPγS放射性配體競爭替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)明顯右移;CCh、MCN-A-343 使［35S］GTPγS 與m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合量增加，但程度不及ACh、Pilo 使［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合的增加量;Atro、4-Damp、Dafi存在的情況下與無配體時［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合量相似;結(jié)果顯示不同配體對 GDP替代［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合產(chǎn)生不同的影響，ACh、Pilo、CCh、MCN-A-343、Atro、4-Damp、Dafi的 IC50值分別為:82.2，93.70，12.10，14.30，1.93，1.37，0.72 ×10－6mol·L－1，無配體存在時其 IC50為 1.99 ×10－6mol·L－1。與無配體存在時相比，激動劑(ACh、Pilo、CCh、MCN-A343)使GDP與融合蛋白中的G11α亞單位親和力下降;而拮抗劑(Atro、4-Damp、Dafi)使 GDP與融合蛋白中的G11α亞單位親和力增加。

Fig 5 Displacement by GDP of［35S］GTPγS binding to m3AChRG11αfusion protein expressed in Sf9 cells in the presence of ligands:10 －3ACh，10 －3Pilo，10 －3CCh，10 －3MCN-A343，10 －6Atro，10 －64-Damp，10 －6Dafi(n=5，there is a significant difference between all ligand groups and corresponding points of ligand-free group，when GDP at concentration 10－9～10 －3mol·L－1，P ＜0.05)

3 討論

本研究以高效偶聯(lián)的m3AChR-G11α融合蛋白為研究對象，檢測在配體作用下，m3AChR-G11α融合蛋白的表達(dá)和功能的變化，探討信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中分子間相互作用的機(jī)制和影響因素，篩選m3受體亞型特異性藥物。

在［3H］QNB放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，融合蛋白表現(xiàn)出m受體與非特異拮抗劑QNB的結(jié)合能力，并且GTPγS可以抑制融合蛋白與QNB的結(jié)合，說明Sf9細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白兩組分間能發(fā)生相互作用，且具有與m受體配體結(jié)合的特性。

在［35S］GTPγS放射性配體替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，［35S］GTPγS競爭性結(jié)合作用的變化表明不同配體可以引起替代結(jié)合曲線偏移的方向和幅度不同，這種偏移代表了 m3AChR-G11α融合蛋白中的 G11α與GDP親和力的大小，ACh、Pilo使［35S］GTPγS與m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合量明顯增多，使［35S］GTPγS放射性配體競爭替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)明顯右移;CCh、MCN-A-343 使［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合量增加，但程度不及 ACh、Pilo使［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合的增加量量，使［35S］GTPγS放射性配體競爭替代結(jié)合實(shí)驗(yàn)右移;Atro、4-Damp、Dafi存在的情況下與無配體時［35S］GTPγS 與 m3AChR-G11α融合蛋白的結(jié)合量相似。也就是說，GDP與G11α的親和力越低，m3受體催化GDP由G11α上解離下來的能力越高，即激動劑作用時親和力減小，拮抗劑則使親和力增強(qiáng)。因此，通過分析GDP與m3AChR-G11α融合蛋白親和力的大小可以篩選和鑒定m3受體未知的特異性配體。

m3AChR-G11α融合蛋白成功表達(dá)為研究m3受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供了便利條件，同時也為篩選m3受體亞型特異性配體提供了可能性，為m3受體亞型特異性新藥開發(fā)和研制提供了有力的實(shí)驗(yàn)手段。融合蛋白技術(shù)也可用于為其它m受體亞型尋找亞型特異性的激動劑與拮抗劑，這些選擇性配體，也可在某些疾病中起到潛在的治療作用，如阿爾采末病、膀胱過度活動癥、心律失常、哮喘、胃腸道疾病等等，具有重要的理論價值和應(yīng)用前景［5］。

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