托吡酯對(duì)遺傳性癲癇大鼠腦內(nèi)GAT-1和GAT-3表達(dá)的影響

毛小元，程振國(guó)，俞軍齡，閔冬雨，郭 鳳，劉 睿，吳坤燦，張宇軒，謝 妮，蔡際群

癲癇的發(fā)生是由于腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量的失衡引起的，γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［1］，目前已發(fā)現(xiàn)［2］，GABA 介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞作用的降低是導(dǎo)致癲癇發(fā)生過(guò)程中神經(jīng)元過(guò)高興奮性的一個(gè)重要原因。

在突觸間隙中，GABA清除的唯一途徑就是通過(guò)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體(GATs)來(lái)實(shí)現(xiàn)的［3］。分子克隆技術(shù)表明［4］，大鼠腦中 GATs包括4種亞型，即 GAT-1、GAT-2、GAT-3 和 BGT-1。目前研究表明，GAT-1和GAT-3是腦中表達(dá)最豐富的兩種亞型，且與癲癇的發(fā)生最為密切［5］。

托吡酯是治療癲癇的良好藥物，其藥理作用表明托吡酯能阻斷興奮性氨基酸受體，增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的抑制性作用，從而起到穩(wěn)定細(xì)胞膜，抑制興奮性氨基酸毒性的作用，但是關(guān)于托吡酯對(duì)GATs表達(dá)的影響，目前僅發(fā)現(xiàn)一篇文獻(xiàn)報(bào)道［6］。此外，本研究中采用一種遺傳性癲癇大鼠模型——tremor大鼠(TRM)，它是自發(fā)性癲癇大鼠(SER:zi/zi，tm/tm)親代之一，由Wistar大鼠敲除tm基因而獲得，出生8周后出現(xiàn)癲癇小發(fā)作［7－8］，我們前期工作中，在此大鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)均記錄到陣發(fā)性的5～7 Hz的棘－慢復(fù)合波［9］(如Fig 1所示)，它的發(fā)作無(wú)需外加物理化學(xué)因素刺激，是研究遺傳性癲癇的理想動(dòng)物模型。目前關(guān)于托吡酯對(duì)TRM大鼠腦組織內(nèi)GATs表達(dá)的影響也未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)幾種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)托吡酯對(duì)TRM腦內(nèi)GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步揭示托吡酯抗癲癇的作用機(jī)制及尋找新的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 主要試劑和儀器 TRM大鼠(tm)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2000年從日本京都大學(xué)引進(jìn)的模型種鼠自行繁殖，Wistar大鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。TRM大鼠、Wistar大鼠均為9～12 wk，♀、♂不限。TRIzol(TaKaRa)，GAT-1、GAT-3 和β-actin引物由 TaKaRa公司合成，托吡酯(topiramate，TPM)購(gòu)自 Sigma Aldrich公司，SYBR Prime-Script RT-PCR KitⅡ(Perfect Real Time)試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］，兔抗鼠GAT-1和βactin多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗鼠GAT-3多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，Real Time PCR儀(ABI 7500 Fast Real-Time PCR System)，DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器)，GDS-8000型凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)UVP公司)，Hoefer miniVE垂直電泳，印跡系統(tǒng)(美國(guó) Amersham Biosciences公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 取9～12 wk的Wistar大鼠5只和TRM大鼠15只，然后將15只TRM大鼠隨機(jī)分成3組，每組各5只。一共分為4組:陰性對(duì)照組;TRM組;40 mg·kg－1TPM組(TPM40);80 mg·kg－1TPM 組(TPM80)，TPM40 組和 TPM80 組分別腹腔注射給予相應(yīng)劑量新鮮配置的托吡酯藥物，陰性對(duì)照組和TRM組分別在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射生理鹽水(10 ml·kg－1)，動(dòng)物每次給藥前皆稱體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，每天早晨10點(diǎn)給藥一次，按此方法連續(xù)給藥2周，動(dòng)物給藥后觀察2 h，以驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間和驚厥發(fā)作次數(shù)進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)，以全身強(qiáng)直－陣攣?zhàn)鳛轶@厥發(fā)作的表現(xiàn)。

1.3 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)海馬內(nèi)GAT-1和GAT-3 mRNA表達(dá) 給藥2 wk后，各組的TRM大鼠和Wistar大鼠在麻醉狀態(tài)下斷頭，迅速取出海馬。參照TRIzol試劑說(shuō)明書，提取海馬的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的濃度和純度。取5 × Prime ScriptTMBuffer 2 μl，每一標(biāo)本取總RNA 500 ng，Prime Script TMRT Enzyme MixⅠ，Oligo dT Primer和 Random 6 mers各 0.5 μl，加入去 RNA酶的水至 10 μl。37℃，15 min;85℃，5 s 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將cDNA標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)5倍稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板，同時(shí)進(jìn)行PCR。將不同濃度的定量模板的對(duì)數(shù)和相應(yīng)的Ct(threshold cycle，Ct)值作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)總體積為25 μl，含cDNA 模板(1 ∶5 稀釋)2 μl，上、下游引物各 1 μl，SYBR Premix ExTaqTMⅡ(內(nèi)含 ExTaq 酶、dNTPs、Mg2+和 SYBR Green Ⅰ)12.5 μl，其余的用水補(bǔ)齊。PCR 反應(yīng)條件為 95℃，30 s;95℃，5 s;62℃，34 s共40個(gè)循環(huán)，各組都設(shè)2個(gè)平行重復(fù)。PCR反應(yīng)在ABI 7500 Real Time PCR儀上進(jìn)行，采用β-actin作為內(nèi)參(各引物序列如Tab 1所示)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線進(jìn)行確定分析。

Tab 1 Primer sequences used for GABA transportersdetection by real time PCR

1.4 Western blot檢測(cè)海馬突觸膜成分中GAT-1和GAT-3蛋白表達(dá) 各組大鼠麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，參照Danbolt等［10］的方法提取海馬突觸膜成分的蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，以牛血清蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)。60 μg的蛋白樣品與等體積的RIPA裂解液混合煮沸變性5 min后，采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓為180 V。轉(zhuǎn)印至PVDF膜(200 mA，2 h)，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入GAT-1一抗(1∶600)或 GAT-3一抗(1∶600)或β-actin一抗(1∶1 000)室溫孵育過(guò)夜，次日加入相應(yīng)的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集，測(cè)定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TRM大鼠癲癇小發(fā)作的腦電圖與行為學(xué)表現(xiàn)

2.1.1 TRM大鼠癲癇小發(fā)作的腦電圖 TRM大鼠強(qiáng)直痙攣發(fā)作時(shí)腦電圖呈現(xiàn)低電壓高頻率的快反應(yīng)波(Fig 1)。

Fig 1 The electroencephalograms(EEGs)recording of TRM(♂，250 g，9 weeks)in cerebral cortex(Cx)and hippocampus(HPC)

2.1.2 行為學(xué)觀察 陰性對(duì)照組無(wú)驚厥發(fā)作。與TRM組比較，TPM40組驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間和驚厥發(fā)作次數(shù)均明顯縮短，差異有顯著性(P＜0.05);TPM80組驚厥發(fā)作持續(xù)時(shí)間和驚厥發(fā)作次數(shù)也明顯縮短，差異有顯著性(P＜0.01)，Tab 2。

Tab 2 The comparison of behavioral findings among groups in the experiment(ˉ±s，n=5)

Tab 2 The comparison of behavioral findings among groups in the experiment(ˉ±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs TRM.

Group Duration of seicure/h Number of attack Wistar－ －－TRM 1.65 ±0.12 11.5 ±0.93 TPM40 1.46 ±0.07* 9.88 ±0.83*TPM80 0.91 ±0.15＊＊ 7.5 ±1.20＊＊

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)Fig 2，GAT-1、GAT-3 和 β-actin 的 斜 率 分 別 為－3.495 9、－3.430 2和 －3.439 1，均接近 －3.322。GAT-1、GAT-3和β-actin的相關(guān)系數(shù)分別為0.997 2、0.999 6和 0.996 3。GAT-1，GAT-3 和 β-actin基因的線性范圍均為101～104。

Fig 2 Quantitative real-time PCR standard curve of β-actin，GAT-1 and GAT-3 standard templates

2.3 PCR產(chǎn)物的確定分析 GAT-1、GAT-3和 βactin基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得目的條帶，沒(méi)有出現(xiàn)非特異性條帶(Fig 3A);熔解曲線分析顯示，GAT-1、GAT-3和β-actin基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值分別為85.1℃、86.0℃和86.4℃，熔解溫度均一，峰的形狀也比較銳利(Fig 3B、C)。

2.4 GAT-1和GAT-3在腦組織中的定量分析所有標(biāo)本均重復(fù)2次檢測(cè)。為了校正標(biāo)本之間RNA的質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率的差異，將每一標(biāo)本檢測(cè)所得GAT-1和GAT-3基因的拷貝數(shù)均和相對(duì)應(yīng)的β-actin基因的拷貝數(shù)相比來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。GAT-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在TRM大鼠的海馬(1.58±0.42)中高于 Wistar正常鼠(0.45±0.33)，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4A)，同時(shí)，與TRM組(1.58±0.42)比較，TPM80組海馬中GAT-1 mRNA(0.86±0.39)的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TPM40組海馬GAT-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量與TRM組比較沒(méi)有變化(Fig 4A);GAT-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在TRM大鼠海馬(1.40±0.13)中高于 Wistar正常鼠(0.77±0.29)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4B)。

Fig 3 Agarose gel electrophoresis results and melting curvesanalysis of GAT-1，GAT-3 and β-actin genes

2.5 托吡酯對(duì)TRM腦內(nèi)GAT-1和GAT-3蛋白表達(dá)的影響 TRM大鼠海馬中GAT-1蛋白(0.61±0.07)的表達(dá)高于正常Wistar大鼠(0.34±0.06)，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 5A);同時(shí)，與TRM組(0.61±0.07)比較，TPM80組海馬中GAT-1蛋白(0.17±0.05)的表達(dá)明顯降低，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TPM40組海馬中GAT-1蛋白(0.56±0.10)的表達(dá)與TRM組比較沒(méi)有變化。TRM大鼠海馬中GAT-3蛋白(0.76±0.07)的表達(dá)高于正常Wistar大鼠(0.46±0.05)，P ＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 5B)。

Fig 4 The effects of topiramate on GAT-1 and GAT-3 geneexpressions in the hippocampus of TRM(ˉ±s，n=5)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用的癲癇模型鼠為遺傳性癲癇大鼠(TRM)，腦電圖顯示，在出生后8周能自發(fā)地出現(xiàn)低電壓高頻率的快反應(yīng)波，并且其對(duì)抗癲癇藥物的反應(yīng)與人類十分相似［11］，是評(píng)價(jià)抗癲癇藥的極好動(dòng)物模型。而與TRM同窩的野生型WTC鼠無(wú)癲癇相關(guān)的突變基因，在腦內(nèi)未記錄到癲癇相關(guān)的腦電波，我們認(rèn)為其與正常Wistar大鼠無(wú)差異，由于WTC鼠數(shù)量很少，故本實(shí)驗(yàn)采用Wistar鼠作對(duì)照。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TRM大鼠海馬內(nèi)GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白均上調(diào)［12］，這與現(xiàn)在的研究結(jié)果是一致的。

Fig 5 The effects of topiramate on GAT-1 and GAT-3 proteinexpressions in the hippocampus of TRM(ˉ±s，n=5)

腦內(nèi)GATs的改變與癲癇的發(fā)生之間的關(guān)系越來(lái)越引起廣大研究者的關(guān)注，目前研究發(fā)現(xiàn)許多抗癲癇藥物的作用機(jī)制都與調(diào)節(jié)GATs密切相關(guān)［13－14］。托吡酯是一種具有多種作用機(jī)制的新型抗癲癇藥，易于透過(guò)血－腦屏障。主要藥理機(jī)制有:①阻斷電壓依賴性鈉通道;② 激活 γ-氨基丁酸(GABA)引發(fā)的Cl－內(nèi)流，增強(qiáng)GABA的活性;③ 阻滯KA/AMPA型谷氨酸受體。Poulsen等［15］研究發(fā)現(xiàn)托吡酯還可以通過(guò)增加谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)來(lái)減少海馬胞外谷氨酸水平從而發(fā)揮抗癲癇的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)托吡酯對(duì)TRM的發(fā)作癥狀具有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)在驚厥持續(xù)時(shí)間和驚厥發(fā)作的次數(shù)上。此外，托吡酯可以降低 TRM大鼠海馬內(nèi)GAT-1mRNA和蛋白的表達(dá)，并且這種調(diào)節(jié)存在劑量依賴性，但是它對(duì)GAT-3mRNA和蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響，推測(cè)托吡酯發(fā)揮抗癲癇作用的機(jī)制可能也是通過(guò)調(diào)節(jié)GAT-1來(lái)實(shí)現(xiàn)的，至于具體的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

(致謝:感謝日本京都大學(xué)芹川忠夫教授友情贈(zèng)送TRM種鼠。)

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