靶向 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、A1 反義核酸抑制消化系腫瘤細胞增殖效果的差異

蔣建偉，吳風(fēng)云，2，何金花，3，廖曉莉，王 威，吳志慧

線粒體相關(guān)的細胞凋亡途徑通過Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)。Bcl-2家族是一個多基因家族，目前在哺乳動物中至少發(fā)現(xiàn)25個家族成員，包括3個亞家族:如Bcl-2亞家族(anti-apoptotic family)，抑制細胞凋亡發(fā)生，成員有 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、A1、Bcl-w，(近年來還有報道有 Boo、NR-13)等;Bax亞家族(pro-apoptotic family)，促進細胞凋亡發(fā)生，成員有Bax、Bak，(近年來還有報道有 Bok/Mtd、Bcl-xs);BH3-only蛋白家族，促進細胞凋亡，成員有 Bid、Bad、Bik/Nbk、Blk、Hrk，Bim/Bod、Nip3、Nix/BNIP3等［1－2］。Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1 等抗凋亡成員主要定位在核膜的胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的外膜上，維持膜的完整性。它們可通過其BH3結(jié)構(gòu)域與Bax亞家族成員形成異二聚體，從而維持促凋亡蛋白成員在細胞內(nèi)的定位分布，保護細胞不進入凋亡程序，并可將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮致凋亡作用。

Bcl-2家族基因是腫瘤基因治療的分子靶點，例靶向Bcl-2基因的反義核酸G3139(Genta公司，美國)已進行了Ⅱ/Ⅲ期臨床研究，靶向Bax的抑制蛋白Clusterin的反義核酸OGX-011(Vancouver公司，加拿大)已進行了Ⅱ期臨床研究，同時靶向Bcl-2、Bcl-xl的反義核酸oligonucleotide 4625、靶向Mcl-1的反義核酸ISIS 20408(ISIS公司)已進入臨床前研究［1］。我們也發(fā)現(xiàn)，靶向bcl-2的反義核酸、siRNA可有效抑制結(jié)腸癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，靶向mcl-1的反義核酸可有效抑制肝癌、結(jié)腸癌細胞增殖。但是Bcl-2家族有多個基因，功能有所差異，究竟阻斷那個基因的表達，反義作用效果更好呢，尚無此方面的報道。為此，本文擬分別合成靶向Bcl-2家族的 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、bcl-w、A1 等 5 種基因的反義核酸，在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染下，分別作用于肝癌、結(jié)腸癌、胃癌細胞，比較它們對細胞的增殖與凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和主要試劑 人肝癌HepG2細胞、胃癌MGC-803細胞、結(jié)腸癌Lovo細胞由本實驗室提供。DMEM/F12培養(yǎng)基購自 Gibco公司，LipofectamineTM2000，Annexin V-PI雙染試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)公司，CCK-8(Cell Count Kit-8，CCK-8細胞計數(shù)試劑盒)購自日本同仁化學(xué)研究所。

1.1.2 Bcl-2家族成員反義核酸 5條反義核酸序列均是文獻中已經(jīng)證實能高效特異性抑制靶基因表達，由賽百盛生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代修飾，PAGE純化，凍存于－20℃，使用前用無血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)液配制成 100 μmol·L－1的濃度備用。反義核酸及隨機寡核苷酸序列如下，見Tab 1。

Tab 1 Sequence of antisense oligodeoxynucleotide of targeting gene

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細胞、胃癌MGC-803細胞和結(jié)腸癌Lovo細胞培養(yǎng)體系:DMEM/F12培養(yǎng)液含10%新生牛血清，置37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。實驗選用對數(shù)生長期、0.2%臺盼藍拒染率＞95%的細胞。

1.2.2 反義核酸的轉(zhuǎn)染 按照脂質(zhì)體lipofectamineTM2000(μl):ASO(μg)為2.5 ∶1的比例配制，先用Opti-MEM液分別將脂質(zhì)體lipofectamineTM2000和ASO稀釋至等體積，室溫孵育5 min，然后將脂質(zhì)體與ASO在室溫下混合20 min，再將混合物逐滴加入細胞培養(yǎng)板中。

1.2.3 WST法檢測細胞增殖抑制 取對數(shù)生長期的HepG2、MGC-803和Lovo細胞，用含10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度為6×107個·L－1，每孔100 μl，接種到 96 孔板。12 h 后，吸盡培養(yǎng)液上清，更換為60 μl/孔無血清OPTI-MEM培養(yǎng)液。將配好的脂質(zhì)體與ASO混合物逐滴加入到孔板中，每孔終體積為100 μl，每種細胞的ASO作用濃度分別設(shè)為 0.1，0.2 μmol·L－1。將細胞培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后，每孔加入100 μl含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。另設(shè)細胞對照組(control)、RODN組(終濃度為0.2 μmol·L－1)。轉(zhuǎn)染時間達到48 h后，每孔加入 CCK-8 試劑10 μl，室溫孵育90 min，多功能酶標儀(Bio-Rad)測定吸光度A450nm(激發(fā)波長450 nm，參比波長655 nm)，計算細胞的增殖抑制率。增殖抑制率/%=(對照組吸光度－實驗組吸光度)/對照組吸光度×100% 。

1.2.4 PI-Annexin V雙染檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)細胞濃度為1×108·L－1，接種于12孔板，總體積1 ml，12 h后加入藥物，設(shè)3組，control組、RODN 組(終濃度為 0.1 μmol·L－1)、ASO 組(終濃度為0.1 μmol·L－1)，培養(yǎng)48 h 后，消化收集細胞，離心 1 000 r·min－1，6 min，棄上清。PBS 重懸細胞，離心、洗滌2次。以染色緩沖液(binding buffer)重懸，加入FITC標記的AnnexinV試劑和PI試劑，混勻后避光孵育15 min，加入200 μl染色緩沖液，立即使用流式細胞儀檢測，AnnexinV-FITC(+)，PI(–)的細胞群(即LR細胞群)為早期凋亡細胞。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2家族成員ASOs對肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用 在Bcl-2家族ASOs 5個成員中，Bcl-xl ASO與Mcl-1 ASO對肝癌HepG2細胞均有明顯的增殖抑制作用，與RODN組相比，低濃度組與高濃度組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);0.1 μmol·L－1Bcl-xl ASO與Mcl-1 ASO組之間抑制率無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.29)，而 0.2 μmol·L－1Bcl-xl ASO與Mcl-1 ASO組之間抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)。與 RODN 組相比，0.2 μmol·L－1A1 ASO對細胞也有一定的增殖抑制作用(P=0.04)，bcl-2 ASO與bcl-w ASO無論是低濃度組還是高濃度組對細胞增殖均無抑制作用(P＞0.05)，各組的增殖抑制率見Fig 1A.

2.2 Bcl-2家族成員ASOs對胃癌MGC-803細胞的增殖抑制作用 在胃癌 MGC-803細胞中，與RODN組相比，低濃度與高濃度的Bcl-xl ASO和Mcl-1 ASO對細胞增殖均有明顯的抑制作用(P＜0.01)，且同濃度之間相比，Bcl-xl ASO作用強于Mcl-1 ASO(P ＜0.05);另外 0.2 μmol·L－1的 Bcl-2 ASO、Bcl-w ASO和A1 ASO也能抑制細胞的增殖(P＜0.05)，與Bcl-xl ASO和Mcl-1 ASO組相比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，各組細胞增抑制率見Fig 1B。

2.3 Bcl-2家族成員ASOs對結(jié)腸癌Lovo細胞的增殖抑制作用 在Lovo細胞中，與RODN組相比，Bcl-2 ASO、Bcl-xl ASO以及Mcl-1 ASO均能有效抑制細胞增殖;其中以Bcl-xl ASO和Mcl-1 ASO作用效果最好(P=0.00)，且兩者相同濃度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Bcl-2 ASO作用次之(P＜0.05或 P＜0.01)，且與相同濃度 Bcl-xl ASO和Mcl-1 ASO作用相比，差異有顯著性(P=0.00)，各組細胞的增殖抑制率見Fig 1C。

2.4 五種ASOs對肝癌HepG2細胞凋亡的影響各組藥物作用肝癌HepG2細胞48 h后，利用PI-Annexin V雙染流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡率，左下限(LL)為正常細胞群，右下限(LR)為早期凋亡細胞群，右上限(UR)為晚期凋亡細胞及壞死細胞群。與control和 RODN組相比，Bcl-xl ASO和 Mcl-1 ASO組細胞早期凋亡率大幅度增加，凋亡率分別為19.1%、19.7%，A1 ASO組早期凋亡率也稍有增加，凋亡率為10.8%，而Bcl-2 ASO和Bcl-w ASO組未見增加(Fig 2)。

Fig 1 Effect of the 5 ASOs on the proliferation inhibition of HepG2 cells(A)，MGC-803 cells(B)and Lovo cells(C)(%±s，n=3)

Fig 2 Effects of 5 ASOs on the inductionof apoptosis in HepG2 cells

2.5 5種ASOs對結(jié)腸癌Lovo細胞凋亡的影響各組藥物作用于結(jié)腸癌Lovo細胞48 h后，利用PIAnnexin V雙染流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡率，與control和 RODN組相比，Bcl-xl ASO和 Mcl-1 ASO組細胞早期凋亡率大幅度增加，細胞凋亡率分別為40.8%、25.5%，Bcl-2 ASO組也有輕度的促凋亡作用，凋亡率為10.6%，而Bcl-w ASO和A1 ASO組凋亡率未見增加(Fig 3)。

Fig 3 Effects of 5 ASOs on the induction of apoptosis in Lovo cells

3 討論

本實驗選用的靶基因 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bclw、A1均為Bcl-2亞家族成員，具有抑制細胞凋亡、維持細胞生存的作用，這5種基因的反義核酸則具有抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。一般認為，某基因的ASO抑制某種腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡與下列3個因素有關(guān):(1)該ASO序列是否是該基因ASO的最佳序列;(2)該基因在該腫瘤細胞中是否高表達;(3)該基因產(chǎn)物(蛋白)是否對細胞存活、細胞凋亡產(chǎn)生重要的影響。本實驗選用的反義序列均為 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、A1 等 5 個基因的最佳序列。因此，這5個基因的ASO對肝癌、結(jié)腸癌、胃癌細胞產(chǎn)生的細胞增殖抑制、細胞凋亡水平的差異，主要與該基因在這些腫瘤細胞中的表達水平、該基因表達的蛋白在細胞中的作用有關(guān)。

Bcl-2 家族的 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、A1 蛋白在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌細胞中表達水平不同。如在肝癌中，Luo等［3］發(fā)現(xiàn) HepG2細胞既不表達 Bcl-2，也不表達Bcl-xs和Bax，在凋亡過程中表達Bcl-xl、Bak和 Bad。Takehara 等［4］研究發(fā)現(xiàn)在 HepG2、Hep3B和 Huh7 3種肝癌細胞中高表達Bcl-xl，不表達Bcl-2，Bcl-xl在所有的20例肝癌組織中表達高于癌旁組織和正常組織。Sieghart等［5］檢測了149例肝癌組織，發(fā)現(xiàn)51%的病人高表達Mcl-1。在胃癌細胞中，Maeta等［6］通過免疫組化發(fā)現(xiàn)69.8%的胃癌病人Mcl-1陽性表達，Mcl-1陽性表達的腫瘤病人預(yù)后比陰性者差。Bae等［7］發(fā)現(xiàn)Bcl-w在胃癌細胞中過表達且能提高它們的轉(zhuǎn)移和侵襲力，而Bcl-2無此作用。趙瀅等［8］發(fā)現(xiàn)Bcl-xl在胃癌中的表達53.7%，在不同的組織學(xué)分級、Laurren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組、TNM分期間差異有顯著性。在結(jié)腸癌中，Wacheck等［9］發(fā)現(xiàn)約60%的結(jié)腸癌表達Bcl-xl，利用反義核酸下調(diào)結(jié)腸癌細胞中Bcl-xl的表達后，分別與電離輻射和順鉑聯(lián)用，可以使凋亡率增加300%，增殖率減少60%。唐永松等［10］發(fā)現(xiàn)Bcl-2反義核酸能明顯抑制結(jié)腸癌caco-2細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡。

本實驗選取了文獻中已證實對靶基因有確切抑制作用的ASO序列，觀察它們對消化系腫瘤細胞增殖和凋亡的影響。在對3種消化系腫瘤細胞增殖抑制實驗中，Bcl-xl ASO和Mcl-1 ASO的反義作用效果最好，另外對肝癌HepG2細胞，A1 ASO有一定的增殖抑制作用，對胃癌MGC-803細胞，Bcl-2 ASO、bcl-w ASO、A1 ASO均有一定的增殖抑制作用，對結(jié)腸癌Lovo細胞，Bcl-2 ASO有一定的增殖抑制作用。對HepG2細胞和Lovo細胞致凋亡實驗，Bcl-xl ASO和Mcl-1 ASO的致凋亡效果最好;另外對于HepG2細胞，A1 ASO組有一定的致凋亡作用，對于Lovo細胞，Bcl-2 ASO組也有一定的致凋亡作用，以上結(jié)論與細胞增殖抑制的結(jié)果相一致。

Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1 能與 Bax，Bak 蛋白結(jié)合，抑制 Bax，Bak 的功能，一旦 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1 表達受到抑制(如ASO或siRNA)或被小分子抑制劑(如ABT-737或ApoG2等)結(jié)合，Bax或Bak游離，就會啟動線粒體細胞凋亡途徑［11－12］。同時，Bcl-2、Bclxl、Mcl-1也可能與自噬相關(guān)蛋白Beclin 1結(jié)合，一旦Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的蛋白表達或蛋白功能受抑制，Beclin 1游離，就會啟動細胞自噬性死亡途徑［13］。如本實驗中對于肝癌HepG2細胞，濃度為0.1 μmol·L－1的 Bcl-xl ASO 和 Mcl-1 ASO 均能明顯抑制細胞增殖，增殖抑制率分別是(68.38±0.64)%和(56.09±2.47)%;對HepG2細胞的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)分別為29.8%和32.9%，細胞凋亡率遠低于細胞死亡率，推測反義抑制Bclxl或Mcl-1蛋白后，還啟動了細胞自噬性死亡途徑。

Bcl-2亞家族成員可以作為消化系腫瘤基因治療的靶點，對肝癌 HepG2細胞，可將 Bcl-xl、Mcl-1、A1作為靶點;對胃癌 MGC-803細胞，可將 Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-2、Bcl-w、A1 作為作用靶點;對結(jié)腸癌 Lovo細胞，Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-2 作為靶點。對這 3 種消化系腫瘤細胞，在Bcl-2亞家族成員中，采取反義抑制Bcl-xl、Mcl-1蛋白的表達，抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用更為明顯。

［1］ Marzo I，Naval J.Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy［J］.Biochem Pharmacol，2008，76(8):939 －46.

［2］ Willis S N，Chen L，Dewson G，et al.Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xl，but not Bcl-2，until displaced by BH3-only proteins［J］.Genes Dev，2005，19(11):1294 －305.

［3］ Luo D，Cheng S C，Xie Y.Expression of Bcl-2 family proteins during chemotherapeutic agents induced apoptosis in the hepatoblastoma HepG2 cell line［J］.Br J Biomed Sci，1999，56(2):114 －22.

［4］ Takehara T，Liu X L，F(xiàn)ujimoto J，et al.Expression and role of BclxL in human hepatocellular carcinomas［J］.Hepatol，2003，34(1):55－61.

［5］ Sieghart W，Losert D，Strommer S，et al.Mcl-1 overexpression in hepatocellular carcinoma:A potential target for antisense therapy［J］.J Hepatol，2006，44(10):151 －7.

［6］ Maeta Y，Tsujitani S，Matsumoto S，et al.Expression of Mcl-1 and p53 proteins predicts the survival of patients with T3 gastric carcinoma［J］.Gastric Cancer，2004，7(2)，78 －84.

［7］ Bae I H，Park M J，Yoon S H，et al.Bcl-w promotes gastric cancer cell invasion by inducing matrix metalloproteinase-F expression via phosphoinositide 3-kinase，Akt，and Sp1［J］.Cancer Res，2006，66(10):4991－5.

［8］ 趙 瀅，張?zhí)毂?，?強.胃癌組織caspase-3、Bcl-xl和Cox-2表達與臨床病理行為的關(guān)系［J］.世界華人消化雜志，2005，13(6):711－5.

［8］ Zhao Y，Zhang T B，Wang Q.Expression and clinicopathological relationship of caspase-3，Bcl-xl and Cox-2 in gastric cancer tissue［J］.World Chin J Digestol，2005，13(6):711 －5.

［9］ Wacheck V，Selzer E，Günsberg P，et al.Bcl-xL antisense oligonucleotides radiosensitise colon cancer cells［J］.Br J Cancer，2003，89(7)，1352 －7.

［10］唐永松，蔣建偉，張 洹.聚乙烯亞胺-整合素配體復(fù)合物介導(dǎo)bcl-2反義核酸對結(jié)腸癌細胞的作用［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2005，26(2):145 －50.

［10］Tang Y S，Jiang J W，Zhang Y.Effect of bcl-2 antisense oligodeoxynucleotide mediated by jetPEI-RGD on colon carcinoma cell line caco-2［J］.J Jinan Univ(Nat Sci＆ Med Ed)，2005，26(2):145－50.

［11］張春玲，吳立軍，左海軍，等.冬凌草甲素通過改變Bax/Bcl-xL表達激活caspase-3誘導(dǎo)A375-S2細胞凋亡［J］.中國藥理學(xué)通報，2004，20(6):669 －72.

［11］Zhang C L，Wu L J，Zuo H J，et al.Oridonin induced A375-S2 cell apoptosis through caspase-3 pathway after altered expression of Bax/Bcl-xL［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(6):669 －72.

［12］張 瓊，劉德育.蛇葡萄素改變Bcl-2/Bax表達和激活caspase-3誘導(dǎo)人肝癌細胞Bel-7402凋亡［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(11):1502－6.

［12］Zhang Q，Liu D Y.Ampelopsin induces apoptosis via altering expression of Bcl-2/Bax and activating caspase-3 in human hepatoma cell line Bel-7402［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(11):1502－6.

［13］Adams J M，Cory S.The Bcl-2-rugulated apoptosis switch:Mechanism and therapeutic potential［J］.Curr Opin Immunol，2007，19(5):488－96.