中華眼鏡蛇毒活性組分抑制微血管形成研究

朱 柳,余清聲,劉新艷,余紅娥、3,袁 牧,王桂平,樓曉華,滕脈坤

(1.廣州醫(yī)學(xué)院藥物研究中心,廣東 廣州 510182;2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽 合肥 230026;3.廣東藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

血管生成是體內(nèi)一種重要的生理和病理過(guò)程,許多疾病的發(fā)生與血管的異常增生緊密相關(guān),如慢性炎性反應(yīng)、糖尿病性視網(wǎng)膜病和腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等,尋找有效抑制血管生成的藥物是防治腫瘤及腫瘤擴(kuò)散等血管生成性疾病的研究熱點(diǎn)[1]。中華眼鏡蛇毒活性組分(China cobra venom active factor,CCVAF)是從中國(guó)安徽南部眼鏡蛇毒中分離純化的活性組分,為一新型類心臟毒素堿性蛋白[2]。本課題組前期的研究顯示,CCVAF能選擇性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[3-5],可能通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞的活性而潛在地抑制血管生成。本文通過(guò)觀察CCVAF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞集落(克隆)形成、細(xì)胞遷移及微血管形成的影響,探討CCVAF的抗血管生成作用,為CCVAF可能應(yīng)用于抗血管生成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

CCVAF,質(zhì)譜分析其相對(duì)分子質(zhì)量為7005,中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院滕脈坤教授提供;新生牛肺主動(dòng)脈,取自廣州市奶牛研究所;人宮頸腺癌細(xì)胞株 Hela,由廣州醫(yī)學(xué)院李冰教授惠贈(zèng);RPMI1640培養(yǎng)基、膠原酶、胰蛋白酶購(gòu)自 Gibco公司;MCDB 131無(wú)血清培養(yǎng)基及ε-氨基已酸(纖維蛋白水解抑制劑)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF均為Sigma公司產(chǎn)品;牛纖維蛋白原 (fibrinogen)和牛凝血酶(Thrombin)為中國(guó)藥品生物制品檢定檢驗(yàn)所產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SPF級(jí) SD雄性大鼠,(200±10)g,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):No.0017132,SCXK(粵)2003-0002,粵監(jiān)證字 2006A01。

一次性培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、24孔板及Transwell共培養(yǎng)板均為Corning Corstar產(chǎn)品;組織解剖顯微鏡,日本 Nikon;倒置顯微鏡,重慶光學(xué)儀器廠;二氧化碳培養(yǎng)箱,美國(guó) Quene;圖像采集儀,德國(guó)Leica MD20型。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 按文獻(xiàn)[5]培養(yǎng)新生牛肺主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(BAVEC)并鑒定(細(xì)胞Ⅷ因子染色呈陽(yáng)性,證明為內(nèi)皮細(xì)胞),取生長(zhǎng)良好、培養(yǎng)至3～4代的內(nèi)皮細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),稀釋,以200細(xì)胞/平皿的密度分別接種于60 mm的培養(yǎng)皿,置37℃、含95%O2及5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后吸棄上清,CCVAF組每皿分別加入由含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制的CCVAF液(1.25,2.5,5.0 μg/mL)4mL,溶劑對(duì)照組加入不含CCVAF的培養(yǎng)液。每組設(shè)5個(gè)平行樣本,每3天換液1次,培養(yǎng)14天肉眼可見(jiàn)克隆時(shí),Giemsa染色,低倍鏡下計(jì)數(shù)等于或超過(guò) 50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù),計(jì)算克隆形成率及抑制率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)×100%?？寺⌒纬梢种坡?%)=(克隆形成率溶劑對(duì)照-克隆形成率CCVAF)/克隆形成率溶劑對(duì)照×100%。

1.2.2 雙室聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)參照Murohara等[6]的方法進(jìn)行。分別培養(yǎng)Hela細(xì)胞及BAVEC,取生長(zhǎng)良好的融合近80%的Hela細(xì)胞消化計(jì)數(shù),調(diào)整密度為1×108/L,按600μL/孔接種于Transwell雙室培養(yǎng)板的下室。待細(xì)胞貼壁后吸棄上清,實(shí)驗(yàn)組各孔加入由含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制的CCVAF(1.25,2.5,5.0μg/mL),溶劑對(duì)照組加不含CCVAF的培養(yǎng)液,以下室不接種Hela細(xì)胞的孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組。另取培養(yǎng)3～4代生長(zhǎng)良好的BAVEC,調(diào)細(xì)胞密度為1×108/L,按 600μL/孔均勻接種于帶8μm聚碳酸酯微孔濾膜的Transwell培養(yǎng)板上室每組各孔,每組設(shè)2個(gè)平行孔,共重復(fù) 3次。置37℃、含95%O2及5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)行Hela-BAVEC共培養(yǎng)6h。小心取出共培養(yǎng)板,取出 Transwell上室,用棉簽小心拭去上室膜上未遷移的內(nèi)皮細(xì)胞,翻轉(zhuǎn)膜的另一面用D-Hanks液小心清洗,95%乙醇固定,D-Hanks液沖洗,行蘇木素染色,伊紅復(fù)染。將 Transwell上室倒置于顯微鏡下觀察,隨機(jī)取上下左右4個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(20×),計(jì)算細(xì)胞遷移抑制率。遷移抑制率(%)=(遷移細(xì)胞數(shù)溶劑對(duì)照-遷移細(xì)胞數(shù)CCVAF)/遷移細(xì)胞數(shù)溶劑對(duì)照×100%。

1.2.3 大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)微血管形成實(shí)驗(yàn) 參照Nicosia等[7]的方法改良進(jìn)行。大鼠脫臼處死,無(wú)菌操作下迅速取出胸主動(dòng)脈,置MCDB 131無(wú)血清培養(yǎng)液中漂洗,在組織解剖顯微鏡下小心去除血管外脂肪、黏附組織及血管分支,截?cái)喑扇舾?mm長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán),用MCDB131培養(yǎng)液沖洗10次待用。將纖維蛋白原用MCDB131無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋成3g/L,并于每1mL纖維蛋白原溶液中添加牛凝血酶溶液(50NIHu/mL)20μL,混勻后迅速在24孔板內(nèi)各加入5滴凝成纖維蛋白膠做鋪墊;之后每孔添加正在凝結(jié)的纖維蛋白溶液8滴,立即將準(zhǔn)備好的動(dòng)脈環(huán)平放沉于蛋白膠孔正中部位;待完全凝成膠后,CCVAF組為加入培養(yǎng)液配制的CCVAF(2.5μg/mL);(VEGF+CCVAF)組為加入培養(yǎng)液配制的含VEGF(20ng/mL)及CCVAF(2.5μg/mL);溶劑對(duì)照組加MCDB131無(wú)血清培養(yǎng)液;VEGF對(duì)照組加培養(yǎng)液配制的VEGF(20ng/mL);每孔加入量為1mL,每組設(shè)6個(gè)平行樣本。置于37℃、飽和濕度、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中在培養(yǎng)最初3天,每天在培養(yǎng)液中添加ε-氨基已酸(300mg/L,抑制纖維蛋白水解),之后每隔1天改成加100mg/L,每2天換液1次。并于倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察并計(jì)數(shù)動(dòng)脈環(huán)斷面附近內(nèi)皮細(xì)胞和新生血管的生成情況,記錄新生血管數(shù)目。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo),微血管數(shù)為縱坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)曲線,并計(jì)算第13天時(shí)的CCVAF組及(VEGF+CCVAF)組相對(duì)于溶劑對(duì)照組及VEGF對(duì)照組的微血管生成抑制率。微血管生成抑制率CCVAF/13d(%)=(微血管生成數(shù)溶劑對(duì)照/13d-微血管生成數(shù)CCVAF/13d)/微血管生成數(shù)溶劑對(duì)照/13d×100%。微血管生成抑制率(VEGF+CCVAF)/13d(%)=(微血管生成數(shù)VEGF/13d-微血管生成數(shù)(VEGF+CCVAF)/13d)/微血管生成數(shù)VEGF/13d×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 CCVAF對(duì)BAVEC克隆形成的影響

細(xì)胞培養(yǎng)14天后各組都形成了數(shù)量不等和(或)大小不等的集落。溶劑對(duì)照組形成的集落大小較均勻,且集落細(xì)胞團(tuán)較大;而CCVAF組形成的集落細(xì)胞團(tuán)隨濃度增大(1.25,2.5,5.0μg/mL)而依次變小,5.0μg/mL組中有的僅見(jiàn)一些散在的細(xì)胞,或細(xì)胞零散聚在一起不成集落。從表1中可見(jiàn),CCVAF(1.25,2.5,5.0μg/mL)各組與溶劑對(duì)照組間的克隆形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨 CCVAF濃度的增大,細(xì)胞克隆形成率減少;即 CCVAF能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的克隆形成,并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系,克隆形成抑制率與CCVAF濃度呈正相關(guān)(r=0.982,P＜0.05)。

表1 CCVAF對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響(±s,n=5)Tab.1 Effects of CCVAF on BAVEC colony formation(±s,n=5)

表1 CCVAF對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響(±s,n=5)Tab.1 Effects of CCVAF on BAVEC colony formation(±s,n=5)

與溶劑對(duì)照組比較:1P＜0.05,2 P＜0.0011 P＜0.05,2 P＜0.001 vs solvent control group

?

2.2 CCVAF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

利用Transwell雙室細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移模型,空白對(duì)照組(下室不含Hela細(xì)胞)的內(nèi)皮細(xì)胞有少量的細(xì)胞自主遷移,但與溶劑對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),表明空白對(duì)照組的細(xì)胞自主遷移可忽略。當(dāng) Hela細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)6 h后,與溶劑對(duì)照組比較,CCVAF組的內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)減少,隨 CCVAF濃度增大其細(xì)胞遷移數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。當(dāng) CCVAF濃度為1.25,2.5,5.0μg/mL時(shí),其對(duì)細(xì)胞遷移抑制率分別為20.5%,59.0%,73.5%,呈劑量依賴性(r=0.902,P＜0.05)。

表2 CCVAF對(duì)細(xì)胞遷移的影響(±s,n=6)Tab.2 Effects of CCVAF on BAVEC migration(±s,n=6)

表2 CCVAF對(duì)細(xì)胞遷移的影響(±s,n=6)Tab.2 Effects of CCVAF on BAVEC migration(±s,n=6)

與空白對(duì)照組比較:1P＜0.001;與溶劑對(duì)照組比較:2P＜0.0011P＜0.001 vs blank control group;2 P＜0.001 vs solvent control group

?

2.3 CCVAF對(duì)動(dòng)脈微血管形成的影響

動(dòng)脈環(huán)在不同的生長(zhǎng)條件下形成的微血管數(shù)量不同,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),溶劑對(duì)照組微血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量逐漸增多,而VEGF對(duì)照組生成的微血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量比溶劑對(duì)照組的增多,(CCVAF+VEGF)組及CCVAF組生成的微血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量相對(duì)較少,見(jiàn)圖1。培養(yǎng)后第4天開(kāi)始,即有內(nèi)皮細(xì)胞從動(dòng)脈橫斷面切口處逐漸向外生長(zhǎng)出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu),其中比較了各組在培養(yǎng)至第5,9及13天的微血管生成狀況,結(jié)果顯示與溶劑對(duì)照組比較,VEGF對(duì)照組、(CCVAF+VEGF)組及CCVAF組形成的微血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而與VEGF對(duì)照組比較,(CCVAF+VEGF)組及CCVAF組形成的微血管管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表3。從第13天結(jié)果看,溶劑對(duì)照組微血管管腔樣結(jié)構(gòu)新生微血管數(shù)達(dá) 30多條,VEGF對(duì)照組新生微血管數(shù)量則多達(dá)近60條;而CCVAF組及(CCVAF+VEGF)組僅見(jiàn)少數(shù)幾條新生血管芽出,周圍僅見(jiàn)一些散在分布的細(xì)胞,其中CCVAF組相對(duì)于溶劑對(duì)照組的微血管生成抑制率達(dá) 86.5%,而(VEGF+CCVAF)組相對(duì)于VEGF對(duì)照組的微血管生成抑制率達(dá)88.1%,見(jiàn)表3及圖2。

3 討 論

血管生成是指在生理和病理情況下機(jī)體在原有血管的基礎(chǔ)上形成新血管的過(guò)程,而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是新生血管形成的重要環(huán)節(jié)。本研究從內(nèi)皮細(xì)胞體外大量擴(kuò)增形成集落的方法觀察CCVAF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞克隆的影響,結(jié)果表明,CCVAF能夠劑量依賴性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞體外克隆的形成,與本課題組前期研究得到的CCVAF選擇性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[3]、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[4]、通過(guò)抑制胞內(nèi) c-myc、c-fos、PCNA的表達(dá)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[5]的結(jié)果一致。

圖1 大鼠動(dòng)脈環(huán)無(wú)血清培養(yǎng)血管生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of neovascularization of rat aortic ring of groups

表3 CCVAF對(duì)動(dòng)脈微血管形成的影響(±s,n=6)Tab.3 Effects of CCVAF on neovascularization of rat aortic ring(±s,n=6)

表3 CCVAF對(duì)動(dòng)脈微血管形成的影響(±s,n=6)Tab.3 Effects of CCVAF on neovascularization of rat aortic ring(±s,n=6)

與溶劑對(duì)照組比較:1P＜0.05;與VEGF對(duì)照組比較:2 P＜0.05;*.相對(duì)于溶劑對(duì)照組;#.相對(duì)于VEGF對(duì)照組1 P＜0.05 vs solvent control group;2P＜0.05vs VEGF control group;*was the inhibition rate of CCVAF group vs Solvent control groups 13th;#was the inhibition rate of(VEGF+CCVAF)group vs VEGF control group 13th

組別 微血管生成數(shù)第5天第9天第13天第13天血管生成抑制率/%溶劑對(duì)照 3±1 18±3 37±3 VEGF對(duì)照(20 ng/mL) 7±21 37±21 59±31 CCVAF(2.5μg/mL) 01,2 3±11,2 5±11,2 86.5*VEGF+CCVAF(20ng/mL+2.5μg/mL) 1±11,2 5±11,2 7±21,2 88.1#

圖2 動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)至第13天各組微血管生成的典型生長(zhǎng)圖像(40×)Fig.2 Neovascularization of rat aortic ring of groups on 13th day(40×)

腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤內(nèi)新生血管形成,而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性則是腫瘤血管生成的重要一環(huán)。腫瘤細(xì)胞本身可以自分泌或旁分泌的途徑分泌 VEGF等細(xì)胞促進(jìn)因子,通過(guò)與受體結(jié)合激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖、遷移,促進(jìn)新血管的形成[8]。腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過(guò)程密切相關(guān)。為了考察 CCVAF是否能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,實(shí)驗(yàn)中采用了Transwell雙室細(xì)胞共生培養(yǎng)模型來(lái)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)方法是模擬腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞在共生環(huán)境作用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。這樣培養(yǎng)于下室的腫瘤細(xì)胞所分泌的細(xì)胞促進(jìn)因子等滲至培養(yǎng)上清液中,促使種植于上室的內(nèi)皮細(xì)胞(在相同的培養(yǎng)上清液的作用下),穿過(guò)聚碳酸酯濾膜的微孔到達(dá)膜的下面,計(jì)算濾膜下的細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞的遷移情況。本課題組曾報(bào)道 CCVAF能抑制肺癌細(xì)胞H1299誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移[9],本文證明 CCVAF能夠劑量依賴地抑制人宮頸腺癌 Hela細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移,為考察 CCVAF抑制微血管的生成提供了依據(jù)。

CCVAF能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,其最終能否抑制血管的生成是最關(guān)鍵的。用于評(píng)價(jià)血管生成的體內(nèi)方法有多種,如利用兔耳槽、基質(zhì)膠種植和雞胚絨毛尿囊膜等[10]。由于血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,體內(nèi)過(guò)程中其生物化學(xué)機(jī)制受到血管生成因子與抑制因子之間的調(diào)節(jié)的影響。本研究采用動(dòng)脈環(huán)外植體(aorta ring explant)培養(yǎng)技術(shù),使血管生成的研究能在體外可控環(huán)境下進(jìn)行,從而排除體內(nèi)因素的干擾。本研究參照 Nicosia等[7]的方法進(jìn)行并作了一些改進(jìn):選用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板替代替代傳統(tǒng)的瓊脂環(huán)的固定作用,簡(jiǎn)化了操作步驟,也便于無(wú)菌操作,且節(jié)省了大量培養(yǎng)液(若用10 cm內(nèi)徑的培養(yǎng)皿固定3個(gè)瓊脂環(huán),則 MCDB 131每次需用30mL)。改良后的動(dòng)脈環(huán)無(wú)血清培養(yǎng)方法材料易得,操作簡(jiǎn)便,排除了體內(nèi)研究多因素的影響,并能隨時(shí)觀察血管生成不同階段的情況,條件可控且能模擬體內(nèi)環(huán)境,能相對(duì)客觀評(píng)價(jià)藥效。研究結(jié)果顯示,兩個(gè)對(duì)照組動(dòng)脈環(huán)周圍微血管生長(zhǎng)良好,尤其是VEGF組,微血管生長(zhǎng)數(shù)量、狀態(tài)明顯高于不含VEGF對(duì)照組,說(shuō)明 VEGF促進(jìn)了微血管的生長(zhǎng)和生成;而含CCVAF的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組,微血管芽生大大減少,甚至僅見(jiàn)一些散在的內(nèi)皮細(xì)胞,表明 CCVAF對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)微血管生成具有顯著的抑制作用,且這種作用與拮抗 VEGF的促血管生成作用是相關(guān)的,其抗血管生成的作用首先抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,從而抑制管腔樣結(jié)構(gòu)的形成。

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