匙吻鱘軟骨蛋白酶解工藝優(yōu)化

吳 越，沈 碩，熊善柏，趙思明，黃琪琳,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家大宗淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢430070；3.湖北省水產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

匙吻鱘軟骨蛋白酶解工藝優(yōu)化

吳 越1,2,3，沈 碩1,3，熊善柏1,2,3，趙思明1,2,3，黃琪琳1,2,3,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家大宗淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢430070；3.湖北省水產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

為提高匙吻鱘軟骨蛋白的利用價(jià)值和生物活性，以匙吻鱘軟骨為原料，經(jīng)微波-堿法提取軟骨蛋白，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定堿性蛋白酶酶解軟骨蛋白的關(guān)鍵因素為酶解溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和酶的用量。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定了酶解的最佳工藝條件。結(jié)果表明：最佳酶解工藝條件為酶解溫度50℃、軟骨蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH7.5、酶用量9000U、酶解時(shí)間5h，在此條件下氨基酸態(tài)氮生成率最高，達(dá)到21.89%。

匙吻鱘；軟骨蛋白；酶解

Abstract：In order to improve the utilization value and biological activity of cartilage protein,Polyodon spathulacartilage was used as the material to extract cartilage protein by microwave-alkali extraction method. The optimal enzymatic hydrolysis conditions of cartilage protein were explored by single factor and orthogonal experiments to be enzymatic hydrolysis temperature of 50 ℃, cartilage protein concentration of 1%, hydrolysis pH of 7.5, alkaline protease amount of 9000 U, and hydrolysis time of 5 h. The yield of amino nitrogen was 21.89% under the optimal conditions.

Key words：Polyodon spathula；cartilage protein；enzymatic hydrolysis

匙吻鱘是地球上最古老和最原始的軟骨魚(yú)種之一[1]，屬于鱘形目(Acipenserifomes)匙鱘科(Polyodon)。匙吻鱘通體為軟骨，素來(lái)有“鯊魚(yú)翅、鱘魚(yú)骨，食之明目壯陽(yáng)，延年益壽”之說(shuō)[2]。我國(guó)匙吻鱘大量養(yǎng)殖，產(chǎn)量增加，軟骨也隨之增多[3]。從鯊魚(yú)軟骨中提取得到對(duì)腫瘤和胚胎的新生血管生長(zhǎng)具有抑制作用的活性因子，并證實(shí)它是一種蛋白質(zhì)[4-7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]，匙吻鱘軟骨中含有抗癌、降血脂、降膽固醇、增加人體免疫力以及美容保健等功效成分。其中主要的功效成分為蛋白和多糖，而軟骨蛋白具有較大的分子質(zhì)量，利用生物方法或堿對(duì)蛋白進(jìn)行處理，可以降低其分子質(zhì)量，從而提高軟骨蛋白的利用價(jià)值和生物活性[11]。因此本研究采用微波-堿法提取軟骨蛋白，以堿性蛋白酶酶解軟骨蛋白，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定酶解的最佳工藝，為今后匙吻鱘功效成分的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

匙吻鱘軟骨：由仙桃水產(chǎn)品推廣中心提供活魚(yú)，本實(shí)驗(yàn)室制備，并粉碎至1～2mm備用；堿性蛋白酶(酶活12000U/g) 廣西龐博生物工程有限公司。

AC2IOS型電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司；HH-6型電子恒溫水浴鍋 江蘇省常州市國(guó)華電器有限公司；818型pH計(jì) 美國(guó)奧立龍公司；TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器；UV265FW型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 軟骨蛋白的制備

稱取一定量的軟骨加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的稀堿溶液[液料比為15:1(mL/g)]，置于小燒杯中，用玻璃蓋好，在360W條件下，采用間歇式微波加熱，然后取出冷卻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，離心(3000r/min，10min)取上清液，加入等體積的95%乙醇，4℃放置過(guò)夜，離心后取沉淀，用少量蒸餾水溶解，冷凍干燥，得軟骨蛋白。

1.2.2 測(cè)定方法

蛋白酶活力測(cè)定用Folin-酚法[12]；氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定用茚三酮法[13]；總氮含量測(cè)定用微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》)。氨基酸態(tài)氮生成率的計(jì)算：DH=AN/TN×100(式中：DH為氨基酸態(tài)氮生成率/%；AN為氨基酸態(tài)氮含量/%；TN為總氮含量/%)。

1.3 酶解軟骨蛋白的單因素試驗(yàn)

1.3.1 溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

配制一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，加入堿性蛋白酶9000U，分別在30、35、40、45、50、55、60、65℃條件下保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測(cè)氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.2 酶用量對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

配制一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，分別加入250、750、1000、2000、3000、6000、9000、12000U的堿性蛋白酶，于50℃保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測(cè)氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、l%、2%、3%、4%、5%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，加入堿性蛋白酶9000U，50℃保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測(cè)氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.4 pH值對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

分別選擇體系pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，加入堿性蛋白酶9000U，50℃保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測(cè)氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.5 酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮生成率的影響

配制一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，加入堿性蛋白酶9000U，于50℃分別保溫1、2、3、4、5、6、7 h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測(cè)氨基酸態(tài)氮生成率。

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)酶解pH值、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酶用量進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示，以氨基酸態(tài)氮生成率為指標(biāo)確定酶解最佳工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.1和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖1 溫度對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖1可知，隨溫度的升高，氨基酸態(tài)氮生成率增加，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率最高，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率反而下降；其原因是酶有其最適的反應(yīng)溫度，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高酶促反應(yīng)的速度會(huì)增加，但溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)引起酶變性而喪失其催化活性，當(dāng)酶達(dá)到最適的反應(yīng)溫度時(shí)，酶的活力最大，水解蛋白質(zhì)的量越多[15-16]。

2.2 酶用量對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖2 酶用量對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖2可知，隨酶用量的增加，氨基酸態(tài)氮生成率逐漸提高，在250～6000U范圍內(nèi)，氨基酸態(tài)氮生成率增加較快，在達(dá)到9000U時(shí)，繼續(xù)增加酶的用量，氨基酸態(tài)氮生成率的變化不大。根據(jù)酶的酶解特性，酶的用量過(guò)多會(huì)造成浪費(fèi)，過(guò)少會(huì)使水解不徹底[17]，故綜合分析后選擇酶的用量為9000U。

2.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖3可知，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的情況下，氨基酸態(tài)氮生成率隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.0%時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率最高，而底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，黏度太大，阻礙了酶和底物充分接觸，不利于酶解的進(jìn)行，氨基酸態(tài)氮生成率反而降低，這和李秀霞等[18]在研究雞骨蛋白酶解工藝中的結(jié)果一致。

2.4 pH值對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖4 pH值對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖4可知，開(kāi)始時(shí)，隨著pH值的升高，氨基酸態(tài)氮生成率逐漸增大，當(dāng)pH值達(dá)到8.0時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率達(dá)到最大值，當(dāng)pH＞8.0時(shí)氨基酸態(tài)氮生成率開(kāi)始下降，因此酶解的最適pH值為8.0。酶活力對(duì)其環(huán)境pH值十分敏感，因?yàn)榄h(huán)境的pH值直接影響著酶及蛋白質(zhì)分子某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，只有在特定的pH值條件下，解離基團(tuán)處于特定的解離狀態(tài)時(shí)，酶分子與底物蛋白分子才會(huì)結(jié)合得更快更好，酶解速度也就更快[19]，即單位時(shí)間內(nèi)的生成率就高。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率逐漸增加，在1～5h時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率增加較快，但反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5h后增加的速度較慢，因此，選擇酶解時(shí)間為5h。

2.6 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，確立了各個(gè)單因素酶解的最佳水平值。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化考察范圍，以便確立最佳的工藝水平條件。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

極值R越大，說(shuō)明該因素的影響效應(yīng)越大，從表2中可以看出，影響匙吻鱘魚(yú)酶解的因素依次為溫度＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞酶用量，即溫度的影響最大，其他因素較小。從試驗(yàn)結(jié)果得出，最佳酶解工藝條件為A1B2C2D2，即酶解溫度50℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH7.5、酶用量9000U，此時(shí)氨基酸態(tài)氮生成率為21.89%。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)影響堿性蛋白酶酶解匙吻鱘軟骨蛋白的幾個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行考察，在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳酶解工藝條件為酶解溫度50℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH7.5、酶用量9000U。在此條件下酶解5h，氨基酸態(tài)氮生成率最高，達(dá)到21.89%。

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Optimal Enzymatic Degradation of Cartilage Protein fromPolyodon spathula

WU Yue1,2,3，SHEN Shuo1,3，XIONG Shan-bai1,2,3，ZHAO Si-ming1,2,3，HUANG Qi-lin1,2,3,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. National R & D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing, Wuhan 430070, China；3. Aquatic Product Engineering and Technology Research Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China)

TS254.4

A

1002-6630(2010)22-0160-04

2010-06-30

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD30B01)

吳越(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：warden1987210@yahoo.com.cn

*通信作者：黃琪琳(1974—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称反蠓肿咏Y(jié)構(gòu)及功能特性。E-mail：hql@mail.hzau.edu.cn