響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取山毛豆抑菌物質(zhì)條件研究

胡林子，蔣 雨，馬永全，于 新,*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取山毛豆抑菌物質(zhì)條件研究

胡林子1,2，蔣 雨3，馬永全2，于 新2,*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

考察料液比、提取時(shí)間、提取溶劑對(duì)超聲波法提取山毛豆種子中抑菌物質(zhì)的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)山毛豆抑菌物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果得到山毛豆抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為液料比12:1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、超聲波提取52min。該條件下質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的山毛豆提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為20.24mm，與理論最優(yōu)值20.70mm接近。

山毛豆種子；超聲波提??；抑菌活性；響應(yīng)面法；工藝條件

Abstract：Ultrasonic wave was applied for extraction of effective component fromTephrosia vogeliiHook f. seeds. Effects of liquid/material ratio, extraction time and ethanol concentration on the antimicrobial effect of the extract were investigated. On the basis of single factor tests, the method of response surface analysis (RSA) with three factors and three levels was adopted.Results showed that the optimum conditions were as follows:liquid-to-material ratio 12:1 mL/g, the ethanol concentration 55%and the ultrasonic processing time 52 min. Under these conditions, the inhibition zone of 20% original concentrated extract forStaphlococcus aureusreached up to 20.24 mm, which was in close agreement of the predicted value(20.70 mm).

Key words：Tephrosia vogeliiHook f. seeds；ultrasound-assisted extraction；antimicrobial activity；response surface methodology；technological conditions

非洲山毛豆(Tephrosia vogeliiHook f.)又稱福氏灰毛豆、窩氏灰葉，屬豆科，蝶形花亞科，灰葉屬，多年生灌木，是一種優(yōu)良的水土保持、荒坡綠化、土壤改良植物[1-3]。非洲山毛豆種子含有粗脂肪13.47%(m/m)，其中，不飽和脂肪酸的含量達(dá)66.94%(m/m)，粗蛋白含量38.73%(m/m)，是潛在的食品與飼料優(yōu)質(zhì)資源[4]。非洲山毛豆含有魚藤酮類化合物，是一種優(yōu)良的殺蟲植物，其殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)、研究和應(yīng)用在國(guó)內(nèi)外已有70多年歷史[5]，前人研究了非洲山毛豆葉、莖提取魚藤酮類物質(zhì)作為生物殺蟲劑使用，效果良好，但是對(duì)于山毛豆種子、葉莖提取物的抑菌作用的研究尚未見研究報(bào)道。應(yīng)用超聲技術(shù)來強(qiáng)化提取過程，可有效提高提取效率，縮短提取時(shí)間，節(jié)約成本，甚至還可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。目前超聲提取技術(shù)己在對(duì)某些天然植物的提取中得到了工業(yè)化應(yīng)用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化超聲波輔助提取非洲山毛豆種子的抑菌活性物質(zhì)的工藝條件，旨在為山毛豆資源的利用及天然抑菌劑的開發(fā)提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山毛豆種子，采自廣州市花都區(qū)北興鎮(zhèn)山坡(北緯23°27′，東經(jīng)113°26′)；大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室；乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphiB. CMCC50094) 廣東省微生物研究所；培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

無水乙醇、N a O H、H C l、瓊脂、N a2HPO4、NaH2PO4、NaCl(均為分析純)；牛肉膏、蛋白胨(均為生化試劑)。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-176NR型多功能粉碎機(jī) 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；R系列旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀 無錫星海生化設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海索普儀器有限公司；SW-CJ-IF型無菌超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；KQ5200型超聲波清洗器 廈門中村光學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 提取物的制備

除去雜質(zhì)的山毛豆，粉碎過40目篩，取100g。稱樣置于燒杯中，加入提取劑，于50W的超聲條件下輔助浸提，4層紗布過濾，真空抽濾，用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀在60℃減壓濃縮，得黑紅色黏稠物10mL，0～4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試驗(yàn)方案

以不同液料比、超聲波處理時(shí)間、提取劑濃度為因素，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，根據(jù)單因素確定顯著水平，在此基礎(chǔ)上，選擇一種菌作為指示菌，采用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以獲取最適工藝參數(shù)[8]。

1.3.3 抑菌效力的測(cè)定

1.3.3.1 菌懸液制備

在無菌條件下，將供試菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，挑取菌落，用無菌生理鹽水稀釋，獲得1.0×106～1.0×107CFU/mL的菌懸液，備用[9]。

1.3.3.2 提取物抑菌作用的測(cè)定

用無菌水將山毛豆提取物稀釋至20%(V/V)。采用管碟法[10]，取無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm、高18mm)，每皿加入2%的瓊脂作底層。在培養(yǎng)基內(nèi)等距離分散放置兩個(gè)牛津杯(內(nèi)徑6mm，外徑8mm，高10mm)，將菌懸液加入到溫度適宜的培養(yǎng)基中，混勻后迅速倒入培養(yǎng)皿，每皿約倒培養(yǎng)基15mL，靜置20min后待培養(yǎng)基凝固取出牛津杯，用移液槍分別移取樣品溶液150μL加入到平板杯孔中，每個(gè)菌種每種提取物做4組平行，以與稀釋試樣含同樣濃度的乙醇為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)12h，用直尺以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)提取物抑菌效果的影響

以50%乙醇為溶劑，一次性提取，液料比分別為5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL/g)，超聲提取40min，結(jié)果見圖1。在液料比5:1～15:1(mL/g)范圍內(nèi)，山毛豆提取物抑菌作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)；當(dāng)液料比大于15:1(mL/g)時(shí)，呈緩慢減弱的趨勢(shì)。因此，較佳的液料比介于10:1～15:1(mL/g)。

圖1 液料比對(duì)抑菌效果的影響Fig.1 Effects of liquid-to-material ratio on antibacterial activity of extract

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取物抑菌效果的影響

在提取劑為50%乙醇，液料比10:1(mL/g)的條件下，超聲提取20、40、60、80、100、120min，提取液抑菌結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波提取時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響Fig.2 Effects of ultrasound processing time on antibacterial activity of extract

山毛豆提取物的抑菌效果隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，這主要是由于開始時(shí)原料和溶劑之間的濃度差比較大，擴(kuò)散速度快，有效抑菌成分浸出速度也快，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，一方面溶劑的揮發(fā)，另一方面非抑菌成分的溶出，造成了山毛豆提取物抑菌效果的下降。因此，選取40min為最佳超聲波提取時(shí)間。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物抑菌效果的影響

液料比10:1(mL/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，超聲提取40min。提取物抑菌效果見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌效果的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on antibacterial activity of extract

在其他條件相同的情況下，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)介于30%～50%時(shí)，山毛豆提取物的抑菌效果隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而明顯增強(qiáng)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí)，抑菌效果隨體積分?jǐn)?shù)的增加而顯著減弱。因此，選取50%左右為提取溶劑的最佳體積分?jǐn)?shù)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及模型分析

依據(jù)Design Expert 7.0軟件，采用Central Composite Design建立數(shù)學(xué)模型[11]，以液料比(X1)、浸提時(shí)間(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)值為自變量，以+1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，ΔX為自變量的變化步長(zhǎng)，因子編碼及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of RAS test

以金黃色葡萄球菌為指示菌，測(cè)定抑菌圈直徑，重復(fù)3次，取平均值為響應(yīng)值(Y)，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2給出了山毛豆提取物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果及其預(yù)測(cè)值。依據(jù)Design Expert 7.0軟件中的Central Composite Design方法，以液料比、超聲提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各組提取物的抑菌效果進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：

式中：Y為抑菌圈的預(yù)測(cè)值；x1～x3分別為上述3個(gè)自變量的編碼值。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

對(duì)模型進(jìn)行方差分析(表3)、模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表 4)。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

從該方程的方差分析(表3)可知，本試驗(yàn)所選模型不同處理間差異極顯著(P＜0.0001)，說明回歸方程應(yīng)變量與全體自變量之間的相關(guān)關(guān)系是顯著的，即這種試驗(yàn)方法是可靠的；失擬項(xiàng)P=0.3767＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小，可以用該方程對(duì)不同提取條件下的抑菌效果進(jìn)行預(yù)測(cè)。本試驗(yàn)中，變異系數(shù)較低(2.78%)，說明了試驗(yàn)可靠性強(qiáng)；模型的校正決定系數(shù)，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。該模型的信噪比(RSN)為16.094，遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對(duì)提取物的抑菌效力進(jìn)行預(yù)測(cè)?？梢杂么四Ｐ蛯?duì)超聲波提取山毛豆抑菌成分的工藝進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測(cè)。

表4 回歸方程模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of regression coefficient

由表4可知，模型一次項(xiàng)x2(P＜0.0001)差異極顯著，x3(P=0.0232)差異顯著，x1(P=0.1320)差異不顯著；二次項(xiàng)差異極顯著；交互項(xiàng)x1x2(P=0.0161)差異顯著，x1x3(P=0.0021)差異極顯著，x2x3(P=0.2960)差異不顯著。表明超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山毛豆提取物抑菌效應(yīng)影響顯著，且在液料比與超聲時(shí)間、液料比與乙醇濃度之間存在交互作用。x1、x2、x3系數(shù)估計(jì)值分別為－0.23、1.27、0.37，影響因素主次順序?yàn)闀r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖4 液料比、時(shí)間對(duì)抑菌效力影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface showing the effect of liquid/material ratio and time on antibacterial effect of the extract

模型的響應(yīng)面圖解結(jié)果見圖4～6。各圖表示Xl、X2、X3中任意一個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)提取物抑菌能力的影響[12-13]。從圖中可知，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用相對(duì)其他因素之間的交互作用最大，而時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的交互作用最小。

圖5 液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌效力影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface showing the effect of liquid-to-material ratio and ethanol concentration on antibacterial effect of the extract

圖6 時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌效力影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface showing the effect of time and ethanol concentration on antibacterial effect of the extract

用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，以獲得最優(yōu)的提取條件。經(jīng)分析，X1、X2、X3最適值分別為12.08mL/g、52.18min、55.05%，理論抑菌圈直徑為20.7014mm。

2.3 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

將提取條件修正為液料比12:1(mL/g)、提取時(shí)間52min、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，以驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化條件的可靠性。在優(yōu)化條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，取平均值。實(shí)驗(yàn)測(cè)得抑菌圈直徑為20.24mm，與模型預(yù)測(cè)值相差2.23%。證明該模型具有一定的可靠性。

3 結(jié) 論

采用超聲波提取技術(shù)對(duì)山毛豆抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合實(shí)際可操作性得出較優(yōu)工藝條件為液料比12:1(mL/g)，提取時(shí)間52min、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%。該條件下的山毛豆提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為20.24mm，與模型預(yù)測(cè)值接近。

[1] MANSON A. The action of certain assamese plant as larvicides[J].Journal of the Malaria Institute of India, 1939, 2(1):85-93.

[2] GACHENE C K K, WORTMANN C S. Green manure/cover crop technology in eastern and central Uganda:development and dissemination[M]. Netherlands:Kluwer Academic Publishers, 2004:219-236.

[3] KWESIGA F, AKINNIFESI F K, MAFONGOYA P L, et al. Agroforestry research and development in southern Africa during the 1990s:Review and challenges ahead[J]. Agroforestry Systems, 2003, 59(3):173-186.

[4] 于新, 嚴(yán)卓勤, 李小華, 等. 非洲山毛豆種子物理特征、成分分析與油脂組成的研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2009, 48(1):37-41.

[5] 張業(yè)光, 徐漢虹, 黃繼光, 等. 非洲山毛豆的主要?dú)⑾x活性成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2000, 12(6):6-11.

[6] 雷德柱, 高大維, 于淑娟. 超聲波在食品技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 應(yīng)用聲學(xué),2000, 19(5):44-48.

[7] 胡愛軍, 鄭捷. 食品工業(yè)中的超聲提取技術(shù)[J]. 食品與機(jī)械, 2004,20(4):57-60.

[8] 郭宇星, 潘道東. 超聲波破碎法提取瑞士乳桿菌氨肽酶條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8):140-144.

[9] 李云雁, 宋光森. 板栗殼提取物抑茵作用研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2004, 24(4):61-64.

[10] 曾超珍, 劉志祥, 吳耀輝, 等. 超聲波提取甘草黃酮及其抑菌活性研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2007, 18(10):2402-2403.

[11] AHMADI M, VAHABZADEH F, BONAKDARPOUR B, et al. Application of the central composite design and response surface methodology to the advanced treatment of olive oil processing wastewater using Fenton’s peroxidation[J]. Journal of Hazardous Materials, 2005, 123(1/3):187-195.

[12] 張永軍, 劉曉宇, 黃惠華. 響應(yīng)面法優(yōu)化葛根多糖提取工藝的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(7):678-682.

[13] 易軍鵬, 朱文學(xué), 馬海樂, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取牡丹籽油的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(14):99-104.

Ultrasound-assisted Extraction of Antimicrobial Substances fromTephrosia vogeliiHook f. Seeds

HU Lin-zi1,2，JIANG Yu3，MA Yong-quan2，YU Xin2,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)22-0091-05

2010-01-11

胡林子(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白質(zhì)工程。E-mail：hulinzi-lny@163.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn