骨膠原蛋白的酶解工藝條件

趙妍嫣，胡林林，方 芳，姜紹通

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

骨膠原蛋白的酶解工藝條件

趙妍嫣，胡林林，方 芳，姜紹通

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

采用胰蛋白酶酶解骨膠原蛋白制備膠原多肽，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，以水解度為指標(biāo)，確定胰蛋白酶酶解膠原蛋白的最佳工藝條件。結(jié)果表明：最優(yōu)工藝條件為pH6.91、反應(yīng)溫度60℃、酶添加量200mg/g膠原蛋白、底物水平0.1/61.5(g/mL)、水解時(shí)間為4h；此條件下的膠原蛋白水解度達(dá)到29.36%。酶解后膠原蛋白的溶解性及乳化性均顯著提高。

骨膠原蛋白；胰蛋白酶；水解度；酶解工藝

Abstract：Collagen was used as the material to prepare collagen polypeptide through enzymatic hydrolysis by trypsin. The optimal hydrolysis conditions were explored by single factor and response surface experiments on the basis of hydrolysis degree. Results indicated that the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis pH of 6.91, hydrolysis temperature of 60 ℃,enzyme dosage of 200 mg per 1 g collagen, material-liquid ratio of 1:615 (g/mL), and hydrolysis time of 4 h. Under the optimal hydrolysis conditions, the hydrolysis degree of collagen was 29.36%. The solubility and emulsification capability of hydrolyzed collagen were significantly improved.

Key words：bone collagen；trypsin；the degree of hydrolysis；enzymatic hydrolysis processing

我國是畜牧和漁業(yè)養(yǎng)殖大國，其加工的副產(chǎn)物——鮮骨[1]逐年增加，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[2]。新鮮的畜骨含有20%～30%的蛋白質(zhì)，其中90%為膠原[3]及軟骨素，是優(yōu)良的蛋白源。膠原多肽是膠原經(jīng)蛋白酶降解后得到的分子量約為3～20kD的具有特殊生理活性的生物活性肽[4]。它不僅提高了蛋白質(zhì)類食品的價(jià)值[5]而且使一些從前難以開發(fā)的蛋白質(zhì)資源以多肽類食品的形式得以利用。由于膠原多肽的高功能性、無害性、綠色性，其發(fā)展前景被看好[6]。目前關(guān)于采用蛋白酶解牛骨蛋白[7]、魚骨蛋白[8]等制備生物活性水解物的研究較多，但有關(guān)采用酶法制備豬骨蛋白活性肽的研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)先從豬骨中提取骨膠原蛋白，利用胰蛋白酶的酶解作用將其降解為骨膠原多肽，為膠原多肽的廣泛應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬板骨 市購；胰蛋白酶(酶活11.96U/mg) 上?；瘜W(xué)試劑總廠；碳酸氫鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙醇、甲醛、氫氧化鈉、羥脯氨酸、考馬斯亮藍(lán)(均為生化級)。

1.2 理化指標(biāo)的測定

溶液中的蛋白含量：考馬斯亮藍(lán)法[9]；膠原蛋白含量：羥脯氨酸法[10]；水解度：雙指示劑甲醛滴定法(GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》)；膠原蛋白與膠原多肽性質(zhì)：蛋白吸水性、吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、發(fā)泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定參見文獻(xiàn)[11]。

1.3 方法

1.3.1 骨膠原蛋白的提取工藝流程

新鮮豬骨(剔去肉質(zhì)和肌腱)→用7 g/100 mL的NaHCO3溶液浸泡1h→用9g/100mL的NaCl溶液浸泡9h→用5倍體積的體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液浸泡12h→用5倍體積的正丁醇浸泡12h→高壓蒸煮3h→過濾→溶液冷凍干燥→膠原蛋白

1.3.2 膠原蛋白的酶解工藝

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

以水解度為指標(biāo)，考察胰蛋白酶酶解膠原蛋白的pH值、反應(yīng)溫度、酶添加量、水解時(shí)間及底物水平5個(gè)因素對酶解的影響，從而確定最佳的酶解條件[12]。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)確定酶解膠原蛋白的最佳工藝。選用因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對酶解膠原蛋白水解度的影響

2.1.1 pH值

圖1 pH值對膠原蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of pH on hydrolysis degree of collagen

由圖1可知，隨著pH值的增加，水解度先增加再下降，在pH7時(shí)，水解度最大，當(dāng)pH值小于或大于7時(shí)，酶活性會降低，從而影響水解度的變化。

2.1.2 酶添加量

圖2 酶添加量對膠原蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of collagen

由圖2可知，當(dāng)?shù)孜锼揭欢〞r(shí)，隨著酶添加量的增加，膠原蛋白的水解度先增加后減小，當(dāng)酶添加量在200～400mg/g膠原蛋白時(shí)，膠原蛋白的水解度變化不太明顯，這是因?yàn)楫?dāng)酶添加量較低時(shí)，隨著酶用量的增加，胰蛋白酶對膠原蛋白的酶解作用增強(qiáng)，水解度增加，但當(dāng)酶添加量過多時(shí)，胰蛋白酶可能自身相互水解，使得水解度呈下降趨勢。

2.1.3 反應(yīng)溫度

圖3 反應(yīng)溫度對膠原蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of collagen

由圖3可知，溫度能顯著影響胰蛋白酶的活性。隨著溫度的增加，水解度先增加后下降，溫度為65℃時(shí)水解度最高。

2.1.4 水解時(shí)間

圖4 水解時(shí)間對膠原蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of collagen

由圖4可知，在4h之前，隨著水解時(shí)間的延長，水解度逐漸增大，且增加的幅度較大，但4h后，隨著時(shí)間的延長，水解度變化不大。

2.1.5 底物水平

圖5 底物水平對膠原蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree of collagen

由圖5可知，隨著底物水平的減小，胰蛋白酶與底物能夠充分的結(jié)合，水解度逐漸增加并趨向于平緩，在底物水平為1/700(g/mL)時(shí)，水解度達(dá)到最大。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)選發(fā)酵條件的最佳工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 工藝優(yōu)選響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments for optimizing hydrolysis processing

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，以水解度(Y)為因變量，以pH值(X1)、溫度(X2)、料液比(X3)為自變量建立回歸方程：

圖6 pH值、反應(yīng)溫度、底物水平交互影響水解度的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of cross-interaction among hydrolysis pH, hydrolysis temperature and substrate concentration on hydrolysis degree of collagen

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過繪制響應(yīng)面曲線圖來進(jìn)行直觀的分析。圖6分別顯示了3組以水解度為響應(yīng)值的趨勢圖，從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度。由響應(yīng)面試驗(yàn)得出最優(yōu)酶解工藝為pH6.91、反應(yīng)溫度60℃、底物水平0.1/61.5(g/mL)，此時(shí)水解度為29.30%。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，水解度為29.36%，與理論值相差不大。

2.3 膠原蛋白和膠原多肽的性質(zhì)研究

經(jīng)檢測，從豬骨中提取的膠原蛋白原料中蛋白質(zhì)含量為98.22%，骨膠原蛋白的含量為86.54%。對膠原蛋白和膠原多肽的性質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 膠原蛋白和膠原多肽的性質(zhì)Table 3 Properties of collagen and collagen polypeptides

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定酶解的最佳工藝條件為pH6.91、反應(yīng)溫度60℃、酶添加量200mg/g膠原蛋白、底物水平0.1/61.5(g/mL)、水解時(shí)間4h。此工藝條件下，水解度為29.36%。酶解后膠原蛋白的溶解性及乳化性均顯著提高。

[1] 任紅敏. 畜禽骨的研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工:學(xué)刊, 2008(4):34-38.

[2] 李帆, 賈冬英, 姚開. 骨膠原蛋白的制備及性能表征研究進(jìn)展[J]. 食品科技, 2006(10):115-118.

[3] 趙玉紅. 骨的綜合利用[J]. 肉類工業(yè), 2001, 237(3):23-24.

[4] TAKAHASHI M, VOSHIKAWA M. Studies on the ileum contracting mechanisms and identification as a complement C3a receptor agonist of oryzatensin, a bioactive peptide derived from rice albumin[J]. Peptides,1996, 17(l):5-12.

[5] 劉玉德, 曹雁平. 生物蛋白膚的開發(fā)研究展望[J]. 食品科學(xué), 2002,23(8):319-320.

[6] 謝靜, 王傳花, 李珂, 等. 骨膠原多肽的制備及功能特性的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2008(3):13-16.

[7] 張根生, 黃巧莉, 楊春燕, 等. 木瓜蛋白酶法制備豬骨膠原多肽工藝條件研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17):262-265.

[8] 陳申如, 蔡揚(yáng)鵬, 周瓊, 等. 魚骨膠原蛋白的純化及其特性的初步研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(11):177-181.

[9] 李志江. 考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定啤酒中蛋白質(zhì)含量[J]. 食品科技, 2004, 35(1):95-97.

[10] 藍(lán)蔚青, 王川, 李燕, 等. 豬皮中羥脯氨酸含量的測定[J]. 中國食品與營養(yǎng), 2006(10):38-40.

[11] 賈冬英, 王文賢, 姚開, 等. 膠原蛋白多肽功能特性的研究[J]. 食品科學(xué), 2001, 22(6):21-24.

[12] 梁擁軍, 孫向軍, 楊璞, 等. 羅非魚魚皮膠原蛋白多肽的制備及其理化性質(zhì)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(4):1588-1590.

Enzymatic Hydrolysis Processing of Collagen

ZHAO Yan-yan，HU Lin-lin，F(xiàn)ANG Fang，JIANG Shao-tong(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

TS251

A

1002-6630(2010)22-0153-03

2010-06-28

趙妍嫣(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：Zhaoyy33@163.com