• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    富血紅素多肽產(chǎn)物制備用酶的比較研究

    2010-10-19 05:25:40楊萬根王衛(wèi)東孫會剛馬美湖
    食品科學 2010年22期
    關(guān)鍵詞:血紅素物質(zhì)量木瓜

    楊萬根,王衛(wèi)東,孫會剛,馬美湖*

    (1.徐州工程學院食品工程學院,江蘇 徐州 221008;2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,湖北 武漢 430070)

    富血紅素多肽產(chǎn)物制備用酶的比較研究

    楊萬根1,王衛(wèi)東1,孫會剛1,馬美湖2,*

    (1.徐州工程學院食品工程學院,江蘇 徐州 221008;2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,湖北 武漢 430070)

    為篩選適于生產(chǎn)富血紅素多肽產(chǎn)物的蛋白酶,比較不同蛋白酶對豬血紅蛋白的水解效果。在AS1398中性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的最適水解pH值及溫度下,以L16(45)正交試驗研究酶種類、酶質(zhì)量分數(shù)、底物質(zhì)量分數(shù)和水解時間等因素對水解率、水解液中粗多肽含量和血紅素含量等指標的影響。結(jié)果表明:酶種類和水解時間兩因素對水解率指標的影響達到極顯著水平(P<0.01);底物質(zhì)量分數(shù)是影響粗多肽含量指標的最重要因素;酶種類對血紅素含量指標的影響則達到顯著性水平(P<0.05)。中性蛋白酶有利于提高水解率,木瓜蛋白酶有利于提高水解物的粗多肽含量,而堿性蛋白酶則有利于提高水解物的血紅素含量。

    豬血紅蛋白;蛋白酶;多肽;血紅素;篩選

    Abstract:In order to screen a protease suitable for producing heme-enriched polypeptides, the effects of various proteases on hydrolysis efficiency of porcine hemoglobin were compared. Under the optimal pH and temperature of proteases such as AS1398 neutral protease, 2709 alkaline protease, papain and trypsin, orthogonal experiments were used to explore the effects of enzyme type, enzyme concentration, substrate concentration and hydrolysis time on the hydrolysis degree of porcine hemoglobin and the contents of polypeptides and heme. Results showed that the effects of enzyme type and hydrolysis time on the degree of hydrolysis reached an extremely significant level (P< 0.01). Substrate concentration was the most important factor to affect the content of polypeptide production. The effect of enzyme type on heme content reached a significant level(P< 0.05). Neutral protease is beneficial for the increase of hydrolysis degree and papain is good for the increase of polypeptide content, while alkali protease is helpful for the increase of heme content.

    Key words:porcine hemoglobin;proteases;polypeptide;heme;screening

    豬血紅蛋白占全血蛋白質(zhì)總量的2/3以上,是豬血中的重要營養(yǎng)成分。血紅蛋白由珠蛋白和血紅素兩部分構(gòu)成,經(jīng)過現(xiàn)代生物酶解技術(shù),血紅蛋白在被降解成多肽的同時,釋放出血紅素或血紅素肽[1]。已有研究證明,豬血紅蛋白多肽具有降血壓[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]和增強免疫力[5]等多種生物活性,血紅素或血紅素肽則是一種優(yōu)良的補鐵劑[6]。目前,國內(nèi)屠宰場每年產(chǎn)生大量的豬血,這些豬血大部分未經(jīng)利用被直接排放入環(huán)境中,既浪費了寶貴的蛋白質(zhì)資源,又造成了嚴重的環(huán)境污染。對豬血紅蛋白開展酶法生產(chǎn)富血紅素多肽研究,能變廢為寶,具有巨大的經(jīng)濟價值和重大環(huán)保意義。國內(nèi)外對酶法水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的研究正方興未艾[7-8]。本實驗研究酶種類、酶質(zhì)量分數(shù)、底物質(zhì)量分數(shù)和水解時間對水解率、水解液中粗多肽含量和血紅素含量的影響,比較不同蛋白酶降解豬血紅蛋白的效果,為利用屠宰廠廢棄豬血制備富血紅素多肽產(chǎn)品提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    粗血紅蛋白 自制[9];木瓜蛋白酶 廣州遠天酶制劑廠;AS1398中性蛋白酶和2709堿性蛋白酶 北京房山酶制劑廠;胰蛋白酶 上海實驗試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;LD5-2型醫(yī)用離心機 北京醫(yī)用離心機廠;微量凱氏定氮裝置 泉州市萬達實驗儀器設備;JB300-D型強力電動攪拌機、DS-1型組織搗碎機 上海標本模型廠;754型分光光度計 上海分析儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 正交試驗設計

    選用L16(45)正交表[10]考察酶種類、底物質(zhì)量分數(shù)、酶質(zhì)量分數(shù)和水解時間等因素對水解率、粗多肽含量以及血紅素含量等指標的影響,試驗因素水平見表1。

    表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

    1.3.2 豬血紅蛋白水解方法

    用適量水稀釋豬血紅蛋白解凍液,85℃加熱30min,搗碎,加水調(diào)至一定底物質(zhì)量分數(shù),加熱至蛋白酶水解溫度,并調(diào)節(jié)至水解pH值,加入一定濃度的蛋白酶水解,水解過程中滴加堿液保持pH值不變。到達一定水解時間后,90℃加熱15min滅酶。4000r/min離心20min得豬血紅蛋白水解液。

    1.3.3 酶活測定

    測定方法采用福林-酚法[11]。酶活單位(U)定義為:在各蛋白酶的最適水解pH值及溫度的條件下,水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

    1.3.4 總氮測定

    改良凱氏定氮法[12]。

    1.3.5 氨基氮測定

    甲醛滴定法[12]。

    1.3.6 血紅素含量測定

    分光光度法[13]。

    1.3.7 水解率公式

    1.3.8 粗多肽含量測定

    豬血紅蛋白水解液中主要成分是多肽,另外還含有少量的游離氨基酸和未降解的蛋白質(zhì),因此測定的是粗多肽的含量。粗多肽含量=總氮含量×6.25。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 正交試驗

    表2 正交試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

    2.2 水解率分析

    表3 水解率方差分析表Table 3 Variance analysis of hydrolysis degree

    水解率的方差分析結(jié)果見如表3所示。對水解率指標,各因素的影響:酶種類>水解時間>底物質(zhì)量分數(shù)>酶質(zhì)量分數(shù),其中酶種類和水解時間的影響達到了極顯著水平(P<0.01)。水平均值多重比較分析顯示,酶種類的影響:中性蛋白酶>堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶,中性蛋白酶與其他3種蛋白酶呈極顯著性差異(P<0.01);水解時間的影響:13h>10h>7h>4h,其中13h和10h之間無顯著差異(P>0.05),它們均與7h呈顯著性差異(P<0.05),而7h又和4h呈顯著性差異(P<0.05);底物質(zhì)量分數(shù)的影響:6%>8%>10%>4%,前三水平與4%的達到了顯著性差異(P<0.05);酶質(zhì)量分數(shù)的各水平之間無顯著性差異(P>0.05),各水平效果:2000U/g>6000U/g>4000U/g>8000U/g。因此對水解率指標,最優(yōu)的因素水平組合:中性蛋白酶、底物質(zhì)量分數(shù)6%、酶質(zhì)量分數(shù)2000U/g、水解時間13h。

    AS1398中性蛋白酶是微生物來源的蛋白酶,其水解特異性較寬,可以水解底物成小分子的肽或游離氨基酸,因此其對水解率指標影響最大。有試驗證明中性蛋白酶具有較強的水解能力,如劉昭明等、鄧佳等在豬血紅蛋白的水解研究中發(fā)現(xiàn),AS 1398中性蛋白酶比木瓜蛋白酶具有更高的水解率[15-16]。

    2.3 粗多肽含量分析

    表4 粗多肽含量極差分析Table 4 Range analysis of polypeptide contents

    粗多肽含量的極差分析結(jié)果如表4所示。由R值比較可知,對粗多肽含量指標,各因素的重要性:底物質(zhì)量分數(shù)>酶種類>酶質(zhì)量分數(shù)>水解時間。根據(jù)比較K值,底物質(zhì)量分數(shù)各水平的的優(yōu)劣:8%>10%>6%>4%;酶種類各水平的優(yōu)劣:木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶;酶質(zhì)量分數(shù)各水平的優(yōu)劣:4000U/g>8000U/g>6000U/g>2000U/g;水解時間各水平的優(yōu)劣:7h>13h>10h>4h。因此,對粗多肽含量指標,最優(yōu)的因素組合:木瓜蛋白酶、底物質(zhì)量分數(shù)8%、酶質(zhì)量分數(shù)4000U/g、水解時間7h。

    從粗多肽含量指標來看,底物質(zhì)量分數(shù)8%和10%的效果優(yōu)于4%和6%,這是由于在底物質(zhì)量分數(shù)小于8%時,酶還沒有被底物完全飽和。據(jù)Henri解釋,在低底物質(zhì)量分數(shù)時,并非所有的酶分子能與底物結(jié)合;隨底物質(zhì)量分數(shù)的增加,酶分子與底物相結(jié)合的數(shù)量增加,當所有的酶分子與底物相結(jié)合時,這時的催化速度最大[17]。在底物質(zhì)量分數(shù)10%時,豬血紅蛋白形成稠狀的物料,流動性差,不利酶的連續(xù)作用,因此其水解效果比底物質(zhì)量分數(shù)為8%時較差。木瓜蛋白酶是提高水解物中粗多肽含量的最適酶類,其原因是該酶為內(nèi)切酶,能酶切蛋白質(zhì)肽鏈成小肽段,使水溶性固形物增多,導致粗多肽含量指標提高。胰蛋白酶同樣為內(nèi)切酶,但其只能催化水解底物蛋白質(zhì)分子中由Lys-或Arg-殘基所構(gòu)成的肽鍵,底物特異性太強[8],因此對粗多肽含量指標的影響要小于木瓜蛋白酶。

    2.4 血紅素含量分析

    表5 血紅素含量方差分析Table 5 Variance analysis of heme contents

    血紅素含量指標的方差分析結(jié)果見表5,各因素的影響:酶種類>酶質(zhì)量分數(shù)>水解時間>底物質(zhì)量分數(shù),且只有酶種類一項達到顯著性水平(P<0.05),而其他因素的影響不顯著(P>0.05)。水平均值多重比較表明,酶種類各水平的優(yōu)劣:堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶,且堿性蛋白酶與中性蛋白酶、胰蛋白酶之間呈顯著性差異(P<0.05),與木瓜蛋白酶無顯著性差異(P>0.05)。其他因素的水平之間均無顯著性差異,酶質(zhì)量分數(shù)各水平的優(yōu)劣:4000U/g>8000U/g>6000U/g>2000U/g,底物質(zhì)量分數(shù)各水平的優(yōu)劣:4%>10%>8%>6%,水解時間各水平的優(yōu)劣:4h>7h>13h>10h。因此對血紅素指標,最優(yōu)的條件組合:堿性蛋白酶、酶質(zhì)量分數(shù)4000U/g、4%底物質(zhì)量分數(shù)、水解時間4h。

    實驗中一個顯著的現(xiàn)象是影響血紅素指標的酶類順序:堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶,它們作用的pH值依堿性到中性順序排列。一般認為在堿性環(huán)境中,由于蛋白質(zhì)分子中各基團具有相同的電荷,靜電排斥作用使珠蛋白的結(jié)構(gòu)伸展,暴露出珠蛋白肽鍵上更多的酶作用位點,從而使更多的血紅素從血紅蛋白中被釋放出來。張亞娟[18]在研究酶法水解血紅蛋白制備血紅素時發(fā)現(xiàn),堿性蛋白酶是制備血紅素的最優(yōu)酶類。孫騫等[19]報道,木瓜蛋白酶的水解液色澤要好于AS1398中性蛋白酶、胰蛋白酶等,水解液的色澤排列順序是木瓜蛋白酶>AS1398中性蛋白酶>胰蛋白酶,說明木瓜蛋白酶血紅素釋放的能力要大于AS1398中性蛋白酶和胰蛋白酶,與本實驗的結(jié)果一致。李寶臻[20]采用酶解方法對豬血球蛋白進行脫色研究時發(fā)現(xiàn),在所選擇的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶中,堿性蛋白酶和中性蛋白酶有較好的脫色效果,堿性蛋白酶的脫色率達到了90%以上,同樣說明了堿性蛋白酶有利于血紅素的釋放。

    3 結(jié) 論

    采用酶解技術(shù)水解屠宰場廢棄豬血中的血紅蛋白生產(chǎn)富血紅素多肽產(chǎn)品,具有重大的經(jīng)濟價值和環(huán)保意義。本實驗比較了AS1398中性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的水解效果,考察了酶種類、底物質(zhì)量分數(shù)、酶質(zhì)量分數(shù)和水解時間對水解率、粗多肽含量和血紅素含量等因素的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶種類是影響水解率和血紅素含量指標的重要因素,其對水解率指標的影響達到了極顯著水平(P<0.01),對血紅素含量指標的影響達到顯著性水平(P<0.05)。不同蛋白酶具有不同的水解效果。酶種類各水平中,對水解率指標,中性蛋白酶是最優(yōu)水平;對水解物的粗多肽含量指標,木瓜蛋白酶是最優(yōu)水平;對水解物的血紅素含量指標,堿性蛋白酶是最優(yōu)水平。本研究結(jié)果對富血紅素多肽生產(chǎn)具有一定參考價值。

    [1] 于美娟, 馬美湖, 單楊, 等. 生物酶法酶解豬血紅蛋白(Hb)的研究[J].食品科技, 2006, 31(9):287-291.

    [2] YU Yike, HU Jianen, MIYAGUCHI Y, et al. Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from porcine hemoglobin[J]. Peptides, 2006, 27(11):2950-2956.

    [3] CHANG C Y, WU K C, CHIANG S H. Antioxidant properties and protein compositions of porcine haemoglobin hydrolysates[J]. Food Chem, 2007, 100(4):1537-1543.

    [4] 李寶臻, 李興民, 劉毅, 等. 豬血紅蛋白酶解液的抑菌性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2006, 26(12):61-63.

    [5] 李艷偉, 江波, 佟祥山. 酶解豬血蛋白中活性肽的純化和功能研究[J]. 高等學?;瘜W學報, 2005, 26(1):61-63.

    [6] VAGHEFI N, NEDJAOUM F, GUILLOCHON D, et al. Iron absorption from concentrated hemoglobin hydrolysate by rat[J]. J Nutr Biochem,2005, 16(6):347-352.

    [7] 楊錫洪, 夏文水. 酶法水解血紅蛋白制備亞鐵血紅素肽[J]. 食品與機械, 2005, 21(3):14-16; 40.

    [8] 李華, 劉通訊, 趙謀明, 等. 富血紅素多肽生產(chǎn)初探[J]. 食品工業(yè)科技, 2007(2):154-156.

    [9] 楊萬根, 馬美湖. 微/超濾技術(shù)濃縮豬血紅蛋白水解液[J]. 食品科學,2009, 30(24):26-29.

    [10] 王欽德, 楊堅. 食品試驗設計與統(tǒng)計分析[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2003:503.

    [11] 施特爾馬赫 B. 酶的測定方法[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 1992:285-288.

    [12] 張意靜. 食品分析技術(shù)[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 2001.

    [13] 王光亞. 保健食品功效成分檢測方法[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,2002.

    [14] 王叔溶. 食品衛(wèi)生檢驗技術(shù)[M]. 北京:化學工業(yè)出版社, 1988.

    [15] 盧寅泉, 劉昭明. 酶技術(shù)開發(fā)動物血制取復合氨基酸營養(yǎng)液的研究[J]. 食品科學, 1995, 16(7):13-18.

    [16] 鄧佳, 劉學文, 鄧冕. 豬血血紅蛋白酶解的優(yōu)化研究[J]. 食品科技,2007(11):210-213.

    [17] 王璋. 食品酶學[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 1992:73.

    [18] 張亞娟. 從豬血中酶法制取血紅素的研究[D]. 無錫:江南大學, 2007.

    [19] 孫騫, 于雪初, 胡鑫, 等. 血紅蛋白酶法脫色技術(shù)研究[J]. 肉類研究,2008(11):32-34.

    [20] 李寶臻. 豬血球蛋白粉的酶法脫色研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2006.

    Comparison of Proteases for Hydrolyzing Porcine Hemoglobin

    YANG Wan-gen1,WANG Wei-dong1,SUN Hui-gang1,MA Mei-hu2,*
    (1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China;2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

    TS251.93

    A

    1002-6630(2010)22-0156-04

    2010-01-24

    國家自然科學基金項目(30270976)

    楊萬根(1974—),男,講師,博士,研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail:yangwangen08@163.com

    *通信作者:馬美湖(1957—),男,教授,博士,研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail:mameihuhn@yahoo.com.cn

    猜你喜歡
    血紅素物質(zhì)量木瓜
    同叫“木瓜”,功效不同
    水庫工程區(qū)水土保持生態(tài)服務價值估算
    人民黃河(2020年12期)2020-12-30 12:55:30
    施肥量對谷子干物質(zhì)量積累及分配的影響
    不同播期與品種對糯玉米干物質(zhì)積累的影響
    木瓜老奶奶的云
    木瓜老奶奶的云
    學生天地(2019年3期)2019-03-05 08:21:28
    植物幫之木瓜
    一種柱狀金屬物質(zhì)量檢測器的研究
    電子制作(2017年10期)2017-04-18 07:23:14
    血紅素氧合酶-1與急性腎損傷研究新進展
    血紅素加氧酶-1對TNF-α引起內(nèi)皮細胞炎癥損傷的保護作用
    老司机午夜福利在线观看视频| av国产免费在线观看| h日本视频在线播放| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久性视频一级片| 久久久久久久久久黄片| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 成人精品一区二区免费| 国产精品 欧美亚洲| aaaaa片日本免费| 日韩有码中文字幕| 国产美女午夜福利| 18禁在线播放成人免费| 最近视频中文字幕2019在线8| 一个人免费在线观看电影| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜精品久久久久久毛片777| 国内精品久久久久久久电影| 人妻久久中文字幕网| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 九九在线视频观看精品| 婷婷亚洲欧美| 国产三级在线视频| 18禁美女被吸乳视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久精品大字幕| 日本黄色视频三级网站网址| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 中文资源天堂在线| 美女大奶头视频| 国产精品女同一区二区软件 | 一本久久中文字幕| 国产在视频线在精品| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久99热这里只有精品18| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产成人欧美在线观看| 婷婷亚洲欧美| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品 国内视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 又黄又粗又硬又大视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 成人永久免费在线观看视频| 一级a爱片免费观看的视频| 香蕉丝袜av| 成年免费大片在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品久久久久久精品电影| 夜夜爽天天搞| 日本一本二区三区精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 哪里可以看免费的av片| 欧美日韩一级在线毛片| netflix在线观看网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久久国产a免费观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品色激情综合| 美女cb高潮喷水在线观看| 男女那种视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品影院6| 麻豆国产av国片精品| 国产探花在线观看一区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产真人三级小视频在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 色综合欧美亚洲国产小说| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美日韩乱码在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产毛片a区久久久久| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美zozozo另类| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲美女视频黄频| 麻豆国产av国片精品| 国产精品野战在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲avbb在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 最新在线观看一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产欧美日韩一区二区精品| 一本一本综合久久| 美女 人体艺术 gogo| xxxwww97欧美| 欧美大码av| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品国产亚洲在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 变态另类丝袜制服| 一区二区三区免费毛片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产成人a区在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 色吧在线观看| 免费大片18禁| 国产麻豆成人av免费视频| 最新美女视频免费是黄的| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| а√天堂www在线а√下载| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产老妇女一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久香蕉国产精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄色日韩在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品影视一区二区三区av| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美乱码精品一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 国产淫片久久久久久久久 | 国产乱人伦免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 淫秽高清视频在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久人人精品亚洲av| 亚洲 国产 在线| 一级a爱片免费观看的视频| 国产成年人精品一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件 | av天堂在线播放| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美成人性av电影在线观看| aaaaa片日本免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 在线天堂最新版资源| av国产免费在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩乱码在线| 国模一区二区三区四区视频| 精品欧美国产一区二区三| 三级毛片av免费| 九色国产91popny在线| av黄色大香蕉| 一个人免费在线观看的高清视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产淫片久久久久久久久 | 嫩草影院入口| 亚洲欧美精品综合久久99| 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久久电影 | 可以在线观看的亚洲视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久香蕉精品热| 丰满的人妻完整版| 亚洲av熟女| 国产成人欧美在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品粉嫩美女一区| 1024手机看黄色片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久久久大av| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av不卡在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美一区二区精品小视频在线| 男女之事视频高清在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 黄片小视频在线播放| 免费搜索国产男女视频| 久久午夜亚洲精品久久| 制服人妻中文乱码| 国语自产精品视频在线第100页| 美女大奶头视频| 久久久久久久精品吃奶| 精品日产1卡2卡| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 天堂动漫精品| 午夜福利视频1000在线观看| 99热这里只有是精品50| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久久久午夜电影| 久99久视频精品免费| 日日夜夜操网爽| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 美女黄网站色视频| 精品一区二区三区人妻视频| 久久这里只有精品中国| 国产欧美日韩一区二区精品| 在线观看舔阴道视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲五月婷婷丁香| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 麻豆久久精品国产亚洲av| 少妇的逼好多水| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美成狂野欧美在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 91av网一区二区| 禁无遮挡网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 一级毛片高清免费大全| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文字幕av成人在线电影| 麻豆国产97在线/欧美| 无人区码免费观看不卡| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品精品国产色婷婷| 美女高潮的动态| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| 欧美成人a在线观看| 国产在视频线在精品| 亚洲精品在线美女| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品一区二区三区视频在线 | 亚洲激情在线av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜两性在线视频| 亚洲激情在线av| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 综合色av麻豆| 少妇的丰满在线观看| 国产探花极品一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 日本免费a在线| 亚洲avbb在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 美女黄网站色视频| 99精品久久久久人妻精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品,欧美在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 免费在线观看日本一区| 97碰自拍视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| e午夜精品久久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品久久电影中文字幕| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜福利在线在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本黄色视频三级网站网址| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费大片18禁| 欧美日韩国产亚洲二区| 黄色视频,在线免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品永久免费网站| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久久久精品吃奶| 岛国在线观看网站| 亚洲av熟女| 亚洲国产欧美网| www.999成人在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 高清毛片免费观看视频网站| 少妇的丰满在线观看| 哪里可以看免费的av片| 日韩欧美免费精品| 国产精品久久久久久久久免 | 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 99久国产av精品| 手机成人av网站| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | bbb黄色大片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 色吧在线观看| 午夜激情欧美在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99热只有精品国产| 很黄的视频免费| 手机成人av网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 人妻久久中文字幕网| 亚洲成人精品中文字幕电影| www国产在线视频色| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美黄色淫秽网站| 嫩草影视91久久| 久99久视频精品免费| av在线蜜桃| 成年人黄色毛片网站| 全区人妻精品视频| 国产精品久久视频播放| 又紧又爽又黄一区二区| 十八禁人妻一区二区| 麻豆成人av在线观看| 色播亚洲综合网| 国产探花极品一区二区| 我要搜黄色片| 757午夜福利合集在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩国内少妇激情av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 中文字幕熟女人妻在线| 在线观看舔阴道视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人欧美大片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费av观看视频| a级毛片a级免费在线| 窝窝影院91人妻| 床上黄色一级片| 看免费av毛片| 长腿黑丝高跟| 国产精品野战在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲无线观看免费| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美不卡视频在线免费观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 黄色成人免费大全| 一边摸一边抽搐一进一小说| 小说图片视频综合网站| 久久久久九九精品影院| 不卡一级毛片| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 午夜精品在线福利| 91久久精品电影网| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 波多野结衣高清无吗| 亚洲成人久久爱视频| 91字幕亚洲| 99热6这里只有精品| 嫩草影视91久久| 一级黄片播放器| 欧美又色又爽又黄视频| e午夜精品久久久久久久| 亚洲美女黄片视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 美女大奶头视频| 一级作爱视频免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 婷婷六月久久综合丁香| 久久草成人影院| 国产不卡一卡二| 日韩欧美在线二视频| 一进一出好大好爽视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲无线在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲精华国产精华精| 九九在线视频观看精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 中文字幕av成人在线电影| 在线看三级毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 在线免费观看的www视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 哪里可以看免费的av片| 在线观看舔阴道视频| 男女之事视频高清在线观看| 免费av不卡在线播放| 男人的好看免费观看在线视频| 免费看光身美女| 久久香蕉国产精品| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲精品久久国产高清桃花| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品熟女少妇八av免费久了| 最好的美女福利视频网| 热99在线观看视频| 午夜福利成人在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 成人一区二区视频在线观看| 深爱激情五月婷婷| 国产黄片美女视频| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 日本黄色片子视频| 亚洲美女视频黄频| 怎么达到女性高潮| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美精品啪啪一区二区三区| 俺也久久电影网| 国产高潮美女av| 在线看三级毛片| 欧美在线黄色| 日韩欧美国产在线观看| 国产三级黄色录像| 天天一区二区日本电影三级| a在线观看视频网站| 国产高潮美女av| av片东京热男人的天堂| 少妇丰满av| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费搜索国产男女视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲欧美激情综合另类| 日本 av在线| 最新美女视频免费是黄的| 国产一区二区在线av高清观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美zozozo另类| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人av在线播放网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 人妻久久中文字幕网| 国产精品免费一区二区三区在线| 看黄色毛片网站| 成人午夜高清在线视频| 亚洲精品在线美女| e午夜精品久久久久久久| 国产主播在线观看一区二区| 脱女人内裤的视频| 性色av乱码一区二区三区2| 日本成人三级电影网站| 在线观看日韩欧美| 91av网一区二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 九九热线精品视视频播放| www日本在线高清视频| 久久久久国内视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲男人的天堂狠狠| 88av欧美| 在线播放无遮挡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 老汉色∧v一级毛片| 免费在线观看成人毛片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产伦人伦偷精品视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 三级毛片av免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 免费在线观看亚洲国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人一区二区视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 999久久久精品免费观看国产| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品久久久久久精品电影| 麻豆一二三区av精品| 久久久久久久精品吃奶| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美中文日本在线观看视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 日韩欧美三级三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美中文日本在线观看视频| 深夜精品福利| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美性感艳星| 国产视频一区二区在线看| 精品无人区乱码1区二区| 久久这里只有精品中国| 麻豆一二三区av精品| 色播亚洲综合网| 免费在线观看影片大全网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲美女黄片视频| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩欧美免费精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 最新在线观看一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 内射极品少妇av片p| 欧美乱妇无乱码| 日本与韩国留学比较| 最近最新中文字幕大全电影3| 黄色视频,在线免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 99久久精品国产亚洲精品| 国产91精品成人一区二区三区| 中文资源天堂在线| 久久性视频一级片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 九色国产91popny在线| 欧美性感艳星| 国产极品精品免费视频能看的| 免费看日本二区| 国产成年人精品一区二区| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲国产精品999在线| 国产精品一区二区免费欧美| 51午夜福利影视在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 久久草成人影院| 九色成人免费人妻av| 欧美日韩精品网址| 一进一出抽搐动态| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产欧美网| 日韩高清综合在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产成人a区在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 操出白浆在线播放| 久久99热这里只有精品18| 中文资源天堂在线| 久久午夜亚洲精品久久| avwww免费| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久精品91无色码中文字幕| 国产av在哪里看| 亚洲在线观看片| 色播亚洲综合网| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产高清videossex| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本免费a在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一区二区三区激情视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 有码 亚洲区| 麻豆成人av在线观看| 色视频www国产| 亚洲精品色激情综合| 激情在线观看视频在线高清| 51国产日韩欧美| 97超视频在线观看视频| 日韩精品中文字幕看吧| 很黄的视频免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品福利观看| 国产日本99.免费观看| 十八禁网站免费在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 美女高潮的动态| 有码 亚洲区| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲无线在线观看| 成年版毛片免费区| 久久久色成人| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美乱码精品一区二区三区| 超碰av人人做人人爽久久 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 狂野欧美激情性xxxx| 久久99热这里只有精品18| 99热这里只有是精品50|