高速剪切對大豆分離蛋白限制性酶修飾的影響

齊蓮子，遲玉杰*

(東北農業(yè)大學食品學院，大豆生物學省部共建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

高速剪切對大豆分離蛋白限制性酶修飾的影響

齊蓮子，遲玉杰*

(東北農業(yè)大學食品學院，大豆生物學省部共建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

研究高速剪切預處理對大豆分離蛋白限制性酶修飾制備等電點處高分散性蛋白的影響。以酶修飾產(chǎn)物的水解度、分散性為指標進行綜合評價，揭示水解度與分散性的關系。結果表明，以常規(guī)酶修飾為對照，高速剪切處理能有效地促進大豆分離蛋白的酶修飾，在0.5～2.0h范圍內，隨水解時間的延長，水解度逐漸增大，分散性也隨之增加。該處理方式的最適參數(shù)為底物質量濃度100g/L、剪切速率6000r/min、剪切時間4min，該條件下酶修飾物的水解度從1.29%提高到4.16%，等電點處分散性由20.62%提高到46.82%，分別提高了3.22倍和2.27倍(P＜0.05)，并將改性時間由4.5h縮短至2.0h。

大豆分離蛋白；高速剪切；水解度；分散性

Abstract：The aims of the present study were to determine the effect of high-speed shearing before flavourzyme hydrolysis on the degree of hydrolysis (DH) of soybean protein isolate and to analyze the relationship between the DH and dispersibility of soy protein isolate (SPI) in an aqueous solution at the isoelectric point. The introduction of high-speed shearing effectively propelled the enzymatic modification of SPI with flavourzyme. As the hydrolysis time was prolonged from 0.5 to 2.0 h, both the DH and disperisibility of SPI showed a gradual rise. The optimal shearing treatment conditions were found to be:substrate concentration, 100 g/L; shearing rate, 6000 r/min; and shearing duration, 4 min, and the DH of SPI was increased from 1.92% to 4.16% and the disperisibility at the isoelectric point from 20.62% to 46.82% under these conditions, reaching 3.22- and 2.27-fold increments, respectively, but the time required for the completion of enzymatic modification was shortened from 4.5 to 2.0 h.

Key words：soy protein isolate；high-speed shearing；degree of hydrolysis；dispersibility

大豆分離蛋白(SPI)是植物蛋白中為數(shù)不多可替代牛奶、雞蛋等動物蛋白的品種之一，具有分散性、乳化性、凝膠性等多種功能特性，廣泛應用于各類食品中[1]。蛋白質強化酸性飲料pH值處于4.0～5.0，因風味良好和營養(yǎng)豐富逐漸被人們所青睞。但SPI在近等電點pH4.5處分散性不佳限制了其應用，因此提高SPI在其等電點附近的分散性可拓寬其應用范圍。酶修飾SPI是一條制備高分散性、良好懸浮穩(wěn)定性蛋白的途徑。Qi等[1]利用胰蛋白酶對SPI進行酶修飾，但此方法底物濃度較低，產(chǎn)品得率不高，且過度水解導致苦味產(chǎn)生。Achouri等[2]利用中性蛋白酶修飾SPI，其等點電下pH值為4.5的分散性可達60%以上，但由于酶的添加量較高，增加了成本。Sara等[3]利用菠蘿蛋白酶水解12h后改善了SPI的分散性，但水解周期過長，能耗過大。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，100g/L含量的SPI溶液經(jīng)加熱會凝固產(chǎn)生凝膠化現(xiàn)象[4]，高濃度、高黏度底物能夠產(chǎn)生酶抑制作用及失活作用，導致反應速率下降[5]。因此，目前針對高濃度底物、低酶用量進行限制性酶修飾的報道較少。

高速剪切作為SPI酶修飾前的一種預處理手段。目的在于通過剪切稀釋作用使高濃度、高黏度的SPI分子體系達到一定的破碎效果，以利于后期酶修飾，旨在提高水解度(DH)的同時降低酶用量，對SPI濃度、高速剪切處理條件進行研究，明確最適處理參數(shù)，為獲等電點處高分散性SPI粉的生產(chǎn)提供技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質87.11%，脂肪1.98%，水分5.84%，灰分4.95%) 哈高科大豆食品有限責任公司；風味蛋白酶(Flavourzyme) 丹麥NOVO公司；果糖、水合茚三酮等(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

B-290型噴霧干燥儀 瑞士Buchi公司；LD4-2A離心機 北京醫(yī)用離心機廠；ALC-310.3電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-3C型酸度計 上海精密儀器有限公司；HYP-Ⅱ型消化爐與凱氏定氮儀上海纖檢儀器有限公司；JJ-2B高速組織搗碎機 江蘇榮華儀器制造有限公司；H722可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器 上海浦東物理光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白組分含量的測定

粗蛋白質：GB/T 5511—2003；水分：GB/T 5479—85；脂肪：GB/T 5009.6—2003；灰分：GB/T 14770—1993。

1.3.2 蛋白酶活力的測定

采用福林酚比色法[6]，經(jīng)測定風味蛋白酶活力為5.0×104U/g。

1.3.3 常規(guī)酶修飾

基于風味蛋白酶(Flavourzyme)在蛋白水解中的應用條件，配制一定質量濃度的SPI溶液，置于酶反應器中，調節(jié)溫度50℃、pH7.0，加0.5%(E/S)Flavourzyme進行酶修飾。反應過程中保持溫度、pH值恒定。酶修飾時間設定為0.5～2.0h，每隔0.5h取樣于90℃、15min鈍化蛋白酶，測定DH。經(jīng)噴霧干燥得到限制性酶修飾SPI粉，測定其等電點處分散性。

1.3.4 高速剪切預處理對SPI限制性酶修飾的影響。

以水解度為指標，將不同濃度的SPI溶液經(jīng)高速剪切預處理一定時間，然后進行酶修飾，考察SPI濃度、高速剪切速率及時間等參數(shù)對酶修飾效果的影響。酶修飾參數(shù)同1.2.3節(jié)。

1.3.4.1 單因素試驗

單因素試驗的條件定為：固定SPI質量濃度120g/L，剪切速率6000r/min，剪切時間2min。改變其中一個條件，固定其他條件以分別考察SPI質量濃度、剪切速率、剪切時間對SPI水解度的影響。各因素水平見表1。

表1 單因素試驗參數(shù)Table 1 Factors and levels in single factor design

1.3.4.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗確定各因素的取值水平范圍，再對SPI質量濃度、剪切速率、剪切時間進行L9(34)正交試驗，根據(jù)產(chǎn)物的DH確定最佳輔助處理條件。因素水平編碼表見表2。

表2 正交試驗因素水平設計Table 2 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.5 噴霧干燥條件

進風溫度170℃，出風溫度80～90℃。

1.3.6 分析方法

采用茚三酮法測定水解度[7]；分散性的測定[8]：稱取20.00gSPI，倒入300mL蒸餾水，在4000r/min的轉速下攪拌10min，取出漿液，調節(jié)pH4.5，于2700r/min、離心10min，利用凱氏定氮法測定上清液及樣品中蛋白質的含量，重復3次。分散性(protein dispersibility index，PDI)表達式如下：

1.3.7 統(tǒng)計分析

水解度及分散性平行測定3次，采用SAS 8.1軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 高速剪切預處理對SPI酶修飾效果的影響

2.1.1 SPI質量濃度對酶修飾效果的影響

剪切速率6000r/min，剪切時間2min時，SPI底物質量濃度60～150g/L范圍內水解度的變化趨勢見圖1。當?shù)孜镔|量濃度為60g/L時，水解效果最好，DH值達(3.78±0.036)%。隨底物質量濃度的升高，高速剪切輔助限制性酶修飾產(chǎn)物的DH呈降低趨勢，但在質量濃度為60～100g/L下降程度不明顯，下降幅度僅為0.16%。底物濃度大于100g/L時，DH顯著降低，SPI質量濃度為150g/L時，DH僅為2.72%。

在實際生產(chǎn)中為提高產(chǎn)品得率，宜采用較高底物濃度進行限制性酶修飾。因此，確定底物濃度為100g/L，此時DH為(3.62±0.037)%。

圖1 蛋白液質量濃度對限制性酶修飾的影響Fig.1 Effect of SPI concentration on DH

2.1.2 剪切速率對酶修飾效果的影響

在SPI底物質量濃度為100g/L、剪切時間2min條件下，研究剪切速率對SPI水解度的影響(圖2)，剪切速率在0～6000r/min內，DH隨速率的升高迅速上升。當剪切速率為6000r/min時，水解2.0h時樣品的DH達最大(3.60±0.022)%，比常規(guī)酶修飾時提高了2.79倍。剪切速率繼續(xù)增加，水解度則開始下降。

圖2 剪切速率對SPI限制性酶解的影響Fig.2 Effect of shearing rate on DH

因為經(jīng)過一定速率的剪切處理，SPI結構較疏松，凝聚的蛋白質分子逐漸解締并伸展，使酶作用位點暴露，有利于加速酶和底物結合[9]，DH增加。高速剪切作用使蛋白質大分子聚集體破碎為蛋白分子[10]，同時增加了原先包埋在分子內部的疏水基團的暴露機會。但剪切速率過大，使蛋白質聚集體產(chǎn)生不可逆的裂解，破壞程度加大，導致分子表觀直徑減少，酶解反應不完全[11]。由此，確定最適剪切速率為6000r/min。

2.1.3 剪切時間對酶修飾效果的影響

在SPI底物質量濃度為100g/L、剪切速率6000r/min條件下，1～5min剪切時間范圍內SPI水解程度的變化趨勢見圖3，SPI水解程度在1～4min范圍內隨時間的升高呈上升趨勢，剪切時間為3、4 min時，產(chǎn)物在酶解2.0h時DH增幅不明顯，分別為(4.08±0.051)%和(4.12±0.043)%，再進一步延長剪切時間則D H顯著降低。

圖3 剪切時間對SPI限制性酶解的影響Fig.3 Effect of shearing duration on DH

隨剪切時間的延長，蛋白質空間構象發(fā)生變化[10]，埋藏在蛋白質內部的活性部位暴露出來，擴大了與酶接觸的機會；然而，剪切時間進一步延長，部分蛋白質的活性部位逐漸被破壞，因而酶解物的DH有所下降。綜上所述，確定剪切時間為3min。

2.2 高速剪切輔助酶修飾優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗得到的數(shù)據(jù)，以酶解物DH為指標，采用L9(34)正交試驗確定最佳輔助處理參數(shù)。正交試驗及方差分析結果見表3、4。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal array design matrix and experimental results

表4 正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis for DH with various shearing conditions

比較本試驗中A、B、D三個因素中極差的大小，可得出B因素為最重要因素，其次為D因素，而A因素為不重要因素。三個因素的主次關系是B＞D＞A。按照各因素的最好水平選取B2D3A2，即剪切速率6000r/min、蛋白液質量濃度100g/L、剪切時間4min作為輔助處理的較優(yōu)組合。剪切速率對結果影響顯著，而剪切時間及底物質量濃度對結果影響不顯著。

由于得到的高速剪切輔助限制性酶修飾較優(yōu)組合參數(shù)在正交試驗內未出現(xiàn)，因此補作這部分的試驗，即按照剪切速率6000r/min、蛋白液質量濃度100g/L、剪切時間4min進行驗證實驗，測得結果：水解度為(4.16±0.082)%，分散性為(46.82±0.68)%。

2.3 水解度對分散性的影響

分散性與DH呈正相關[12-13]，據(jù)DH的測定方法，在波長570nm處測定的吸光度越大，則樣品的分散性越強。本實驗重點探討SPI在等電點處分散性和DH的關系。

圖4 水解度對SPI分散性的影響Fig.4 Effect of DH on disperisibility of SPI

由圖4所示，經(jīng)輔助處理限制性酶修飾的SPI分散性與空白對照相比有顯著提高。在低DH范圍內，分散性隨DH的增加明顯上升。因為經(jīng)風味蛋白酶作用后斷裂成小分子短鏈物質，使得氨基和羧基的數(shù)目增多，極性增加，電荷密度增大，分子間相互排斥作用增加，親水性增強[14]，從而提高了分散性。另外，SPI經(jīng)輔助處理后，蛋白質分子顆粒的表面電荷分布加強，圍繞著新暴露的極性基團的結合水增多，使親水性增強[15]。DH為4.16%時，在等電點處，改性后SPI粉的分散性可達到46.82%，提高了2.27倍。

2.4 高速剪切輔助限制性酶修飾的綜合評價

表5 改性前后酶修飾結果比較Table 5 Comparison between routine and high-speed shearing-assisted enzymatic modification of SPI

由表5可見，與空白對照相比，采用高速剪切輔助進行限制性酶修飾，將改性時間由原來的4.5h減少到了2.0h，DH也基本達到一致，且經(jīng)高速剪切處理輔助限制性酶修飾SPI分散性有所提高。

3 結 論

3.1 利用高速剪切的剪切稀釋作用使高濃度、高黏度的SPI溶液達到一定的破碎效果。高速剪切作用對較低濃度SPI水解程度的提高更為顯著。剪切速率過大導致蛋白結構破壞程度加大，增加了反應接觸面，使速率有所加快。但考慮到能耗及工藝可行性因素，蛋白質分子不可能磨得過細，同時也避免因微生物繁殖而影響產(chǎn)品品質。剪切時間過長，使樣品的機械能轉化為不可逆的熱能導致溫度升高，蛋白過度變性，形成不溶聚合體也不利于酶修飾的進行，都會造成DH降低。

3.2 在酶修飾參數(shù)為酶添加量0.50%、pH7.0、反應溫度50℃、反應時間2.0h條件下，通過正交試驗確定高速剪切輔助高濃度大豆分離蛋白限制性酶修飾提高其水解效果的較優(yōu)組合為剪切速率6000r/min、蛋白液質量濃度100g/L、剪切時間4min，與常規(guī)酶修飾相比，高濃度SPI、短時間內水解度從1.29%提高到4.16%，分散性從20.62%提高到46.82%，分別提高了3.22倍和2.27倍。

3.3 高速剪切作用使蛋白質大分子聚集體破碎，即打斷了蛋白分子間的較弱的作用力，使得球狀蛋白質內部的酶切位點暴露出來，增加與酶結合的幾率。因此，通過剪切稀釋作用(分子在流動的方向逐步定向，摩擦阻力下降，使得黏度降低)對高濃度、高黏度的SPI溶液進行酶修飾前預處理，輔助其進行限制性酶修飾，在短時間內提高DH，避免苦味肽的產(chǎn)生，并提高其分散性，具有一定的可行性。

3.4 隨DH的增加，輔助限制性酶修飾SPI粉在其等電點處的分散性得到了顯著的改善，為擴大其應用范圍提供了條件。高速剪切輔助處理可以加速限制性酶修飾反應，縮短反應時間，提高效率。

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Effect of High-speed Shearing Pretreatment on Limited Enzymatic Hydrolysis of Soy Protein Isolate

QI Lian-zi，CHI Yu-jie*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Provincial Key Laboratory of Soybean Biology,Education of Ministry, Harbin 150030, China)

TS253.1

A

1002-6630(2010)22-0011-05

2010-02-11

教育部博士點基金項目(20070224001)；黑龍江省自然科學重點基金項目(ZD200902)

齊蓮子(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為食品化學及農產(chǎn)品深加工。E-mail：qilianzi@139.com

*通信作者：遲玉杰(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品化學及農產(chǎn)品深加工。E-mail：yjchi@126.com