杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3a功能結(jié)構(gòu)域的克隆與表達(dá)分析

王翠，李杰，柳麗平，曾磊，薛樂勛

鄭州大學(xué)生物工程系 細(xì)胞生物學(xué)研究室，鄭州 450001

杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3a功能結(jié)構(gòu)域的克隆與表達(dá)分析

王翠，李杰，柳麗平，曾磊，薛樂勛

鄭州大學(xué)生物工程系 細(xì)胞生物學(xué)研究室，鄭州 450001

為了研究STT3a基因在杜氏鹽藻耐鹽及鞭毛再生方面的作用，根據(jù)衣藻、擬南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL設(shè)計(jì)一對(duì)簡并引物，采用RT-PCR及3'RACE的方法擴(kuò)增杜氏鹽藻STT3a蛋白功能結(jié)構(gòu)域的cDNA序列。序列分析顯示克隆的cDNA全長1 650 bp，具有一定保守性，與衣藻、擬南芥和人的相似性分別為48%、50%和46%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示杜氏鹽藻STT3amRNA水平隨著鹽濃度的升高而逐漸增加，其水平在3.5 mol/L NaCl濃度時(shí)比在1.5 mol/L NaCl濃度時(shí)升高了11倍(P＜0.01)。另外，與沒有脫鞭毛的杜氏鹽藻相比，STT3amRNA在鞭毛再生過程中持續(xù)高表達(dá)。本研究顯示杜氏鹽藻STT3a基因的高表達(dá)可以增強(qiáng)其鹽適應(yīng)和鞭毛再生能力。

杜氏鹽藻，STT3a基因，耐鹽，鞭毛再生

Abstract:To investigate the function ofSTT3agene in salt adaptation and flagellar regeneration ofDunaliella salina(D.salina), a pair of degenerate primers was designed according to conserved homologous amino acid sequences of VCVFTA and DVDYVL of STT3a fromChlamydomonas,Arabidopsis thalianaand other organisms.A cDNA sequence of 1 650 bp encoding a whole functional domain of STT3a was amplified fromD.salinaby RT-PCR and 3′ Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE), which shared homology withChlamydomonas(48%),Arabidopsis thaliana(50%),Homo sapiens(46%), etc.Real-time fluorescence quantitative PCR(real-time Q-PCR)demonstrated that theSTT3amRNAs fromD.salinawere induced by increased concentration of NaCl, and increased to 11-fold higher by 3.5 mol/L NaCl than that by 1.5 mol/L NaCl(P＜0.01).Also,STT3amRNA ofD.salinamaintained at a higher level in the process of flagellar regeneration with than without experiencing deflagellar treatment.In conclusion, the findings of this study demonstrate that the high expression of theSTT3agene enhances the capability of salt adaptation and flagellar regeneration inD.salina.

Keywords:Dunaliella salina,STT3agene, salt adaptation, flagellar regeneration

N-連接糖基化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最常見的蛋白質(zhì)修飾，這個(gè)過程是由位于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OST)催化的。一系列的研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的OST包含8個(gè)亞基：Ost1p，Ost2p，Wbp1，Stt3p，Swp1p，Ost4p，Ost5p，Ost3p/Ost6p[1]，STT3p 在已知的OST亞基中是最保守的[2]，它在酵母中編碼一個(gè)78 kDa的蛋白，為OST的催化亞基[3]。幾乎所有的真核生物基因組中都存在編碼酵母 Stt3p蛋白的同系物。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) Stt3p的兩種同系物STT3a和 STT3b，它們的表達(dá)具有組織特異性，并能調(diào)節(jié)OST的活性，且含有一個(gè)STT3a亞基的OST復(fù)合物比含有STT3b亞基的OST復(fù)合物對(duì)于選擇完全裝配的長鏈寡糖供體(Glac3Man9GlcNAc2-PP-Dol)更具有特異性[3]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)擬南芥OST的STT3a亞基作為一種跨膜蛋白在高鹽應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮一定作用[4]。

杜氏鹽藻Dunaliella salina(D.salina)是一種高度耐鹽的單細(xì)胞真核綠藻，它能在 0.5～5 mol/L NaCl鹽濃度下生存，但是目前關(guān)于其耐鹽機(jī)制還不清楚。另外，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)：在高鹽條件下，鹽藻的運(yùn)動(dòng)性明顯降低，而鹽藻的鞭毛直接參與了鹽藻自身的運(yùn)動(dòng)。為了探討鹽藻的鹽耐受性和鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性之間是否有潛在的聯(lián)系，本研究根據(jù)已知物種的 STT3a高度保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡并引物，通過RT-PCR及RACE方法獲得STT3a功能結(jié)構(gòu)域的cDNA序列，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測STT3a基因mRNA在杜氏鹽藻鹽適應(yīng)及鞭毛再生過程中的動(dòng)態(tài)變化，以期了解STT3a基因在杜氏鹽藻耐鹽及鞭毛再生中的作用。

1 材料與方法

1.1 杜氏鹽藻藻株、載體與菌株

杜氏鹽藻藻株為 UTEX-LB-1644，購自美國德州大學(xué)。載體 pMD18T-vector購自大連寶生物工程公司。大腸桿菌DH5α為本室保存。

1.2 主要試劑

EcoRⅠ、Hind Ⅲ、LATaq酶、rTaq酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物工程公司。實(shí)時(shí)定量PCR熒光染料購自天根生化科技(北京)有限公司。First Choice RLMRACE Kit購自美國Ambion公司。

1.3 杜氏鹽藻cDNA的制備及簡并引物的設(shè)計(jì)

杜氏鹽藻細(xì)胞按照 5×105/mL的接種量接種于改良的PKS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為4500 Lux，光/暗培養(yǎng)各12 h。取對(duì)數(shù)生長期的杜氏鹽藻細(xì)胞，用 Trizol法提取杜氏鹽藻細(xì)胞的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測所提取總RNA的質(zhì)量和濃度。取6 μg RNA作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，于37℃反轉(zhuǎn)錄1 h后，70 ℃ 10 min ，置于?20℃保存。從GenBank上搜索近10個(gè)物種的STT3a蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，找出兩段相對(duì)比較保守的序列設(shè)計(jì)簡并引物，上游引物：5′-GTNTG(T/C)GTNTT(T/C)ACNGC-3′，下游引物：5′-A(A/G)NAC(A/G)TA(A/G)TCNAC(A/G)TC-3′，引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 RT-PCR

以制備的 cDNA為模板，利用合成的簡并引物，用PCR的方法擴(kuò)增STT3a的部分基因片段。PCR 反應(yīng)體系為：cDNA 0.5 μL，10× LA Buffer 10 μL，dNTPs(10 mmol/L)8 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各 1 μL，LATaq酶 0.5 μL，dH2O 補(bǔ)至100 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃～60℃30 s，72 ℃ 2 min ，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 0 min，4℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。將PCR產(chǎn)物膠回收，連接至pMD18T-vector中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，用含有 Amp、IPTG和 X-Gal的平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，將鑒定正確的菌樣送北京博尚生物技術(shù)有限公司測序，序列通過Primer Premier 5.0整理并用BLAST進(jìn)行同源性分析。

1.5 STT3a基因的3′RACE擴(kuò)增

根據(jù)簡并引物擴(kuò)增得到的已知序列，設(shè)計(jì)STT3a的3′RACE引物(表1)，提取杜氏鹽藻的總RNA，按照 FirstChoice RLM-RACE Kit說明進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃ 1 min ，30個(gè)循環(huán)；72℃ 1 0 min，4℃終止反應(yīng)。巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收后連接于pMD18T-vector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，正確后由北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，序列通過Primer Premier 5.0整理并用BLAST進(jìn)行同源性分析。

表1 設(shè)計(jì)的3′RACE引物序列Table 1 Primers used in 3′RACE

1.6 STT3a結(jié)構(gòu)域的功能分析

通過Primer Premier 5.0在STT3a結(jié)構(gòu)域中設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析STT3a在杜氏鹽藻鹽誘導(dǎo)及鞭毛再生過程中的作用。將對(duì)數(shù)生長期的杜氏鹽藻分別轉(zhuǎn)入0.75、1.0、1.5、2.0、3.0及3.5 mol/L NaCl的PKS液體培養(yǎng)基中光培養(yǎng)10 h后，收集不同鹽濃度下的杜氏鹽藻細(xì)胞；同時(shí)，將對(duì)數(shù)生長期的杜氏鹽藻分別轉(zhuǎn)入1.5、3.0 mol/L NaCl的PKS液體培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，分別收集0、2、4、6、8和10 h的杜氏鹽藻細(xì)胞，分別提取上述處理細(xì)胞的總RNA，取6 μg RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取0.8 μL cDNA作為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量 PCR說明書進(jìn)行操作，同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃30 s，95℃ 15 s。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測及測序，并運(yùn)用 2-△△Ct方法[5]分析STT3a基因的相對(duì)表達(dá)量。

另外，取對(duì)數(shù)生長期的杜氏鹽藻細(xì)胞，在添加甘油的電擊緩沖液中用機(jī)械方法[6]去除鞭毛后，分別收集 0、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270、300、360和420 min時(shí)的杜氏鹽藻細(xì)胞，同時(shí)以未經(jīng)過去鞭毛處理的杜氏鹽藻細(xì)胞作為對(duì)照組。按上述方法制備 cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.7 杜氏鹽藻鞭毛再生不同時(shí)期的鞭毛銀染

運(yùn)用改進(jìn)的銀染法[7]對(duì)杜氏鹽藻鞭毛及藻體進(jìn)行銀染。

1.8 杜氏鹽藻鞭毛再生不同時(shí)期鞭毛長度的測量

用熒光顯微鏡在相同條件下對(duì)鞭毛再生不同時(shí)期的杜氏鹽藻細(xì)胞照相，然后每個(gè)時(shí)期分別取30個(gè)杜氏鹽藻樣本，利用細(xì)線擬合鞭毛，進(jìn)行鞭毛長度的測量，取其鞭毛生長平均值，根據(jù)公式V=(S2?S1)/t(其中V為相對(duì)生長速率，S2和S1分別為相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鞭毛長度平均值，t代表間隔時(shí)間)，最終求出杜氏鹽藻鞭毛不同時(shí)期的相對(duì)生長速率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)中每項(xiàng)處理均重復(fù) 3次。數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)樣本進(jìn)行方差檢驗(yàn)，每次試驗(yàn)中P＜0.05，表明差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻總RNA的純度和質(zhì)量鑒定

所提取的杜氏鹽藻總RNA質(zhì)量完好，28S和18S rRNA帶比較清晰，無拖尾現(xiàn)象，其亮度比約為2∶1，無 RNA降解和 DNA、蛋白質(zhì)污染，可以用于下步實(shí)驗(yàn)。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物鑒定

電泳結(jié)果如圖1所示，所得片段長度約為1 500 bp，與理論值相符。膠回收后連接于pMD18T-vector上，得到載體pMD-stt3，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，可見一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻STT3a cDNAFig.1 Amplification ofSTT3acDNA fromD.salinaby RT-PCR. 1: pMD-stt3; 2: pMD-stt3 digested withEcoRⅠ andHind Ⅲ ; 3: PCR amplification product; M: DNA marker.

2.3 杜氏鹽藻STT3a基因3′下游序列的擴(kuò)增

經(jīng)過巢式PCR，電泳結(jié)果如圖2所示：所得片段長度約為 850 bp，膠回收后連接于 pMD18T-vector上，得到載體pSTT3-1，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，可見一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

圖2 巢式PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻STT3a基因3′下游序列Fig.2 Amplification of the 3′ downstream sequence ofD.salinaSTT3agene by nested PCR.M: DNA marker; 1: 3′downstream sequence amplification product ofSTT3agene; 2:pSTT3-1; 3: pSTT3-1 digested withEcoRⅠandHind Ⅲ.

2.4 同源性分析

STT3a基因的同源性分析表明：在STT3a基因的3'下游序列中發(fā)現(xiàn)WWDYG與DK兩個(gè)保守的基序?？寺～@得STT3a基因1 869 bp，其中STT3a的功能結(jié)構(gòu)域cDNA序列約為1 650 bp，編碼550個(gè)氨基酸(圖3)，BLAST比對(duì)顯示它和衣藻、擬南芥、稻、高粱、毛果楊、玉米、人等的 STT3a同源性分別為 48%、50%、50%、50%、49%、50%和46%。GenBank登錄序列號(hào)：GU301076。

2.5 不同鹽濃度誘導(dǎo)下STT3a mRNA表達(dá)情況

如圖4所示：相對(duì)于1.5 mol/L NaCl鹽濃度的正常培養(yǎng)條件，杜氏鹽藻STT3amRNA水平在0.75、1.0、2.0、3.0和3.5 mol/L NaCl鹽濃度培養(yǎng)條件下明顯升高(P＜0.01)，且在3.5 mol/L NaCl濃度時(shí)比在1.5 mol/L NaCl濃度時(shí)升高了11倍。圖5中可以看出，在高鹽脅迫下(3.0 mol/L NaCl)，STT3amRNA的水平高于正常鹽濃度條件(1.5 mol/L NaCl)下的STT3amRNA水平(P＜0.05)，在 10 h時(shí)，STT3amRNA的水平相對(duì)于0 h升高了8.5倍。這說明STT3a基因的表達(dá)與鹽誘導(dǎo)有關(guān)，STT3a基因可能直接或間接參與了杜氏鹽藻的耐鹽機(jī)制。

2.6 杜氏鹽藻鞭毛再生不同時(shí)期STT3a mRNA表達(dá)情況

圖3 STT3a蛋白推測的功能結(jié)構(gòu)域Fig.3 Putative functional domains of STT3a fromD.salina.

圖4 不同鹽濃度誘導(dǎo)下 STT3a基因表達(dá)情況(＊＊P＜0.01)Fig.4 Expression ofD.salinaSTT3agene in different salt concentrations.**P＜0.01.

圖5 高鹽脅迫(3.0 mol/L NaCl)下杜氏鹽藻STT3a基因表達(dá)情況Fig.5 Expression ofD.salinaSTT3agene in high salt stress(3.0 mol/L NaCl).

圖6 鞭毛再生不同時(shí)期STT3a基因表達(dá)情況Fig.6 Expression ofD.salinaSTT3agene in different states of flagellar regeneration.

如圖6所示：杜氏鹽藻鞭毛再生過程中STT3amRNA水平較正常培養(yǎng)條件下沒有脫鞭毛的持續(xù)高表達(dá)。鞭毛再生過程0～60 min中STT3amRNA的水平基本沒有變化，60～120 min中STT3amRNA的水平逐漸升高，說明杜氏鹽藻鞭毛在最初受損再生過程中延遲至 60 min才開始逐漸大量表達(dá)，120～300 min中STT3amRNA的水平處于平臺(tái)期，但相比較正常培養(yǎng)條件下的杜氏鹽藻，其STT3amRNA仍大量表達(dá)，這個(gè)時(shí)期的杜氏鹽藻鞭毛仍在逐漸生長，420 min后，STT3amRNA的水平逐漸趨于正常值(P＜0.05)。

2.7 杜氏鹽藻鞭毛再生不同時(shí)期鞭毛長度變化及相對(duì)生長速率

從圖7中可以清楚地看出杜氏鹽藻鞭毛再生的前15 min鞭毛增長比較明顯，隨著時(shí)間的延長，杜氏鹽藻鞭毛逐漸延長，至420 min時(shí)基本上完成鞭毛再生。圖8中可以看出，在杜氏鹽藻鞭毛再生的初級(jí)階段，鞭毛生長較快，在前15 min內(nèi)，其相對(duì)生長速率為 0.0835 μm/min，30～240 min 時(shí)鞭毛的相對(duì)生長速率逐步降低，300～360 min時(shí)鞭毛相對(duì)生長速率降低至0.0017 μm/min，表明鞭毛的生長基本完成。在杜氏鹽藻鞭毛再生的不同時(shí)期，其鞭毛相對(duì)生長速率的變化與STT3a基因mRNA水平的變化基本相一致。

圖8 杜氏鹽藻鞭毛再生不同時(shí)期的相對(duì)生長速率Fig.8 The relative growth rates ofD.salinain different times of flagellar regeneration.

3 討論

OST是蛋白進(jìn)入分泌途徑的門戶，它負(fù)責(zé)催化完整的多萜醇結(jié)合前體聚糖向多肽接納體的轉(zhuǎn)移，這種酶的特異性決定需要有Asn-X-Ser/Thr(X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)這一接納體序列的存在。在OST的作用下，寡糖鏈與膜上的磷酸多萜醇分離，而與Asn的N-端相連。完整的寡糖鏈向新生多肽鏈的轉(zhuǎn)移發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔內(nèi)側(cè)。

以往對(duì)STT3a的研究多集中在對(duì)其結(jié)構(gòu)方面的研究，但對(duì)其功能的研究還相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)STT3為 OST的催化亞單位，它有一個(gè)Ncyt-Clum拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，含有 11個(gè)跨膜螺旋[8]，3′下游序列中有WWDYG與 DK兩個(gè)保守的基序[9]。Koiwa 等[4]發(fā)現(xiàn)擬南芥OST的STT3a亞基對(duì)鹽和滲透壓有反應(yīng)，本研究中我們也證實(shí)了STT3a基因的表達(dá)與鹽誘導(dǎo)有關(guān)，隨著鹽濃度的逐漸升高，STT3a的mRNA表達(dá)也提高。

杜氏鹽藻的耐鹽機(jī)制比較復(fù)雜，到目前為止還沒有完全研究清楚。研究發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻的耐鹽機(jī)制除受到甘油和離子流動(dòng)的調(diào)節(jié)外，還有一些蛋白質(zhì)的參與[10]。Fisher等[11]在杜氏鹽藻細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)了一種 p60蛋白質(zhì)，它是一種雙拷貝的碳酸酐酶(DCA)基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的作用，而且隨著鹽濃度的升高，其mRNA水平和細(xì)胞外DCA的活性也同時(shí)提高。本研究室也發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻細(xì)胞膜中的DCA基因mRNA水平隨著鹽濃度的升高而升高，并且在2.0 mol/L NaCl鹽濃度下杜氏鹽藻DCA活性達(dá)到最高。STT3a作為杜氏鹽藻一種新發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白，能直接感受培養(yǎng)基中鹽濃度的變化，本研究也證實(shí)杜氏鹽藻STT3a的 mRNA水平隨著鹽濃度的升高而升高。這些結(jié)果可能為我們研究杜氏鹽藻DCA與STT3a在耐鹽方面的協(xié)同作用提供理論依據(jù)。

鞭毛與纖毛是一種由細(xì)胞質(zhì)膜延伸的細(xì)胞表面突起，主要由微管組成。鞭毛膜作為特化的細(xì)胞膜，其再生受到多種基因的精確調(diào)控，然而關(guān)于其調(diào)控機(jī)制知之甚少。為了解跨膜蛋白STT3a在杜氏鹽藻鞭毛再生中的作用，本研究監(jiān)測了鞭毛再生不同時(shí)期STT3amRNA水平的變化。結(jié)果顯示，STT3a基因在杜氏鹽藻鞭毛最初受損再生過程中延遲至60 min才開始逐漸大量表達(dá)，之后直至鞭毛完成再生過程中都高表達(dá)。這可能是因?yàn)槎攀消}藻藻體本身儲(chǔ)存的一些STT3a蛋白在鞭毛再生的初期起到作用，隨著鞭毛再生過程中對(duì)STT3a蛋白需求的增加，STT3a基因開始逐漸大量表達(dá)。這提示STT3a可能作為一種跨膜蛋白，直接或間接參與了杜氏鹽藻鞭毛膜的再生或者鞭毛再生過程中所需相關(guān)蛋白的糖基化修飾，這些結(jié)果可能為我們研究杜氏鹽藻鞭毛再生過程中基因的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

鞭毛作為杜氏鹽藻的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器直接參與鹽藻的游動(dòng)，而高鹽條件下杜氏鹽藻運(yùn)動(dòng)遲緩是否和高鹽影響相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，目前還沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)跨膜蛋白STT3a既參與了杜氏鹽藻的耐鹽調(diào)控，又參與了杜氏鹽藻鞭毛的再生過程，提示杜氏鹽藻的鹽耐受性和鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性之間可能有潛在的聯(lián)系，值得進(jìn)一步的研究。

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Characterization of the functional domain of STT3a of oligosaccharyltransferase from Dunaliella salina

Cui Wang, Jie Li, Liping Liu, Lei Zeng, and Lexun Xue
Laboratory for Cell Biology, Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

Received:December 29, 2009;Accepted:April 21, 2010

Supported by:International Cooperative Project of the National Science and Technology Ministry(No.2007DFA01240), National Natural Science Foundation of China(No.30700014).

Corresponding author:Jie Li.Tel: +86-371-66658332; E-mail: lijiechen@zzu.edu.cn Lexun Xue.Tel: +86-371-66658332; E-mail: xuelx@371.net科技部國際科技合作項(xiàng)目(No.2007DFA01240)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30700014)資助。