五個(gè)水稻類受體激酶的抗體制備及檢測(cè)

王博，李莉云，曹英豪，劉子光，劉國(guó)振

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071001

五個(gè)水稻類受體激酶的抗體制備及檢測(cè)

王博，李莉云，曹英豪，劉子光，劉國(guó)振

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071001

類受體激酶在植物發(fā)育、自交不親和、雄性不育、抗逆和抗病等生命過程中起著重要的調(diào)控作用。為了對(duì)水稻類受體激酶的功能及生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，本實(shí)驗(yàn)克隆表達(dá)了水稻中 5個(gè)類受體激酶抗原表位片段，以純化的蛋白質(zhì)為抗原免疫新西蘭兔，獲得了特異性較高的多克隆抗體。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，5個(gè)類受體激酶均在葉片中表達(dá)。

水稻，類受體激酶，蛋白質(zhì)純化，多克隆抗體

Abstract:Receptor-like kinase involves self-incompatibility, male sterility, stress responses, and disease resistance.To better understand the physiological function and biological characteristics of rice receptor-like kinase, we cloned five predicted epitope fragments of rice receptor-like kinase.The purified fusion protein was used as antigen to immunize rabbit to get specific polyclonal antibodies.Western blotting analysis shows that the five receptor-like kinases were expressed in rice leaves.

Keywords:rice, receptor-like kinase, protein purification, polyclonal antibody

水稻Oryza sativaL.是世界上最重要的谷類作物之一，是研究作物產(chǎn)量、轉(zhuǎn)基因、雜種優(yōu)勢(shì)、植物病蟲害抗性和其他抗逆等方面的重要遺傳材料。近年來，隨著水稻基因組的測(cè)序完成，越來越多的研究者將目光投向了這一模式植物。

植物類受體激酶(Receptor-like kinase，RLK)在真核生物中廣泛存在，水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約1 130個(gè)類受體激酶，其數(shù)目大約是擬南芥的 2倍[1]，它們?cè)诳共?、發(fā)育、自交不親和性、植物激素的信號(hào)傳遞、器官脫落、細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)等過程中發(fā)揮重要作用。目前克隆的植物類受體激酶數(shù)目不多，主要來源于擬南芥、水稻、油菜和煙草等植物[1]，對(duì)植物類受體激酶的功能更是知之甚少。

植物類受體激酶主要由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域 3部分組成。根據(jù)胞外受體結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，植物類受體蛋白激酶可分為以下幾類：含S-結(jié)構(gòu)域類(S-Domain Kinase，SRK)、富含亮氨酸類(LRR-RLK)、細(xì)胞壁連接類(Wall-associated kinase，WAK)、表皮生長(zhǎng)因子類(Epidermal growth factor，EGF)、腫瘤壞死因子受體類(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)和組氨酸類受體蛋白激酶[1]。其中，WAK通過細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，調(diào)控側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育[2]；對(duì)玉米的Crinkly4(TNFR類)基因研究發(fā)現(xiàn)，它編碼的激酶參與調(diào)控葉表皮細(xì)胞和胚乳中糊粉細(xì)胞的分化[3]；LRR-RLKs，其胞外受體部分具有重復(fù)出現(xiàn)的富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域，在分子識(shí)別中起重要作用[4]，如抗病基因Xa21[5]、Xa26[6]、Pi-d2[7]等屬于此類；S位點(diǎn)受體激酶與自交不親和反應(yīng)相關(guān)[8]。

目前，采用純化蛋白質(zhì)或合成多肽作為抗原免疫動(dòng)物制備抗體，并用于植物中的蛋白質(zhì)功能研究這一實(shí)驗(yàn)手段已很常見[9-10]，但是針對(duì)植物類受體激酶的抗體還為數(shù)不多[11-12]，本研究室在對(duì)水稻類受體激酶的克隆、表達(dá)和磷酸化活性等研究的基礎(chǔ)上[13]，從中挑選出5個(gè)功能和類別不同的類受體激酶，分析了它們的抗原表位片段，并克隆到細(xì)菌表達(dá)載體上，進(jìn)行體外的表達(dá)和純化，以純化蛋白質(zhì)為抗原免疫新西蘭兔，制備抗體，為進(jìn)一步研究類受體激酶的生化特性及其生物學(xué)功能提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻93-11、水稻根cDNA文庫(kù)、pET-30a質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶EcoR I、BglII、Hind III購(gòu)自NEB公司。ExTaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司。大腸桿菌菌株DH5α、ER2566為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 抗原決定簇預(yù)測(cè)

用 BEPITOPE軟件[14]對(duì)候選RLKs基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)，根據(jù)不同表位預(yù)測(cè)方法(疏水性、可及性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等)加和修正之后得到的一致峰圖，選出峰值較高的片段后，用 BLASTP對(duì)水稻蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行唯一性檢測(cè)后選出目標(biāo)片段。

1.3 細(xì)菌表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) NCBI公布的水稻序列設(shè)計(jì)引物，見表1。PCR擴(kuò) 增 條 件 為 ：94 ℃ 4 min ；94 ℃ 1 min，58℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 0 min。

將pET-30a載體進(jìn)行雙酶切，與PCR產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。挑選出正確的重組子送北京華大基因研究中心測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 融合蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及其大量純化

將測(cè)序正確的重組子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，挑取單菌落到 LB+Kan(50 μg/mL)培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，次日將過夜菌轉(zhuǎn)接至LB+Kan+1%葡萄糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約為0.7，加入1 mmol/L的IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)3 h。收集細(xì)胞沉淀，超聲后分別取上清和沉淀進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

表1 Gene ID及擴(kuò)增引物信息Table 1 Gene ID and information of primers

將誘導(dǎo)的菌液離心，在沉淀中加入 10 mmol/L Tris；再加2 mol/L尿素和10 mmol/L Tris，吹勻沉淀后離心，于沉淀中加入 0.5～1 mL 10 mmol/L Tris；再加 5～10 mL 8 mol/L 尿素+0.5 mol/L NaCl+10 mmol/L Tris，冰水浴超聲。4℃放置30 min，離心，棄上清，向沉淀中加入10 mmol/L Tris，將溶解后的樣品上樣，過鎳柱進(jìn)行親和層析。上樣結(jié)束后，分別用15 mmol/L和60 mmol/L咪唑溶液洗去雜蛋白質(zhì)，最后，用300 mmol/L咪唑溶液，洗脫目的蛋白質(zhì)。利用15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

1.5 抗體的制備與檢測(cè)

將純化后并富集的重組蛋白質(zhì)送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，免疫新西蘭兔，獲得多克隆抗體。

將免疫新西蘭兔得到的抗體血清，按1∶1加入100%甘油稀釋后，以1∶5 000和1∶2 500的一抗稀釋倍數(shù)，分別與純化的重組抗原和水稻葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印記檢測(cè)。

1.6 水稻葉片蛋白質(zhì)的提取

用液氮研磨新鮮水稻組織至粉末狀，加入蛋白質(zhì)裂解液(62.5 mmol/L Tris，pH 7.4，10%甘油，2%SDS，20 mmol/L NaF，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT)，冰水混合物中孵育10 min，4℃，12 000 r/min 離心15 min，取上清，轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管中。

1.7 Western blotting檢測(cè)

將提取的水稻蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，用制備的抗體室溫孵育3 h，TTBS(2 mmol/L Tris(pH 7.6)，13.6 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)洗膜3次，每次10 min，之后加入羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TTBS洗膜3次，每次10 min，加ECL Plus檢測(cè)液檢測(cè)，暗室X光片曝光。

2 結(jié)果

2.1 水稻 RLKs基因序列的獲得和抗原決定簇的預(yù)測(cè)

根據(jù)前期工作，挑取不同類別和功能各異的 5個(gè)水稻類受體激酶，分別為WAKs(Os04g49460)、Calcium-regulated protein kinase (CRPK1L-1)(Os01g06280、Os03g21540)、Crinkly 4_Like(Os03g43670)和 SRKs(Os01g48000)。

使用BEPITOPE軟件對(duì)5個(gè)RLKs的抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，選取抗原表位峰值較高的蛋白片段進(jìn)行研究，由于胞外區(qū)在激酶調(diào)控過程中具有重要作用，我們最終確定的克隆片段均位于胞外區(qū)。然后進(jìn)行蛋白質(zhì)的唯一性檢測(cè)，確定了在CDS上的位置依次為 115～627 bp(Os04g49460)；79～531 bp(Os01g06280)；601～1023 bp(Os03g21540)；511～1 023 bp(Os03g43670)；310～852 bp(Os01g48000)(圖1)。

2.2 水稻RLKs基因片段的克隆

用水稻根的 cDNA為模板，進(jìn)行 PCR，結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小與預(yù)測(cè)的類受體激酶基因片段的大小相符合。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，提取質(zhì)粒DNA，酶切后瓊脂糖電泳檢測(cè)。將酶切正確的重組質(zhì)粒送到北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明重組子的序列是正確的(結(jié)果未顯示)。

2.3 融合蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化

對(duì)克隆得到的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行了體外的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，融合蛋白質(zhì)在工作濃度為1 mmol/L的IPTG的誘導(dǎo)條件下，在沉淀中均有大量表達(dá)(圖2)，且融合蛋白質(zhì)的大小符合預(yù)測(cè)大小(22、19、17、22、25 kDa)。

通過特異識(shí)別His-Tag的beads獲得了體外純化的類受體激酶胞外區(qū)域表位片段與 6×His融合蛋白質(zhì)，融合蛋白質(zhì)的大小符合預(yù)測(cè)值。將純化的蛋白質(zhì)過大量蛋白純化柱進(jìn)行富集，當(dāng)抗原的量積累到約5～10 mg時(shí)，進(jìn)行洗脫，得到較純的高濃度目的蛋白質(zhì)(圖3)，并用其對(duì)新西蘭兔進(jìn)行免疫，制備抗體。

圖1 五個(gè)類受體激酶的抗原表位分析及克隆片段的選擇Fig.1 Epitope prediction and fragment selection ofRLKs.The domain structure predicted and analyzed by SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)and BEPITOPE.

圖2 融合蛋白質(zhì)的體外誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 Expression of recombinant proteinsin vitro.0 h:control of without IPTG; S: supernatant by ultrasonic; P:pellet by ultrasonic.Os04g49460-P(22 kDa); Os01g06280-P(19 kDa); Os03g21540-S(P)(17 kDa); Os03g43670-P(22 kDa); Os01g48000-P(25 kDa).

2.4 RLKs抗體能識(shí)別重組抗原

使用制備的多克隆抗體按 1∶5 000的稀釋倍數(shù)，對(duì)細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示，抗體能夠特異識(shí)別目標(biāo)抗原(圖4)。

圖3 融合蛋白質(zhì)的大量純化Fig.3 Purification of fusion proteinsin vitro.Os04g49460(22 kDa); Os01g06280(19 kDa); Os03g21540(17 kDa);Os03g43670(22 kDa); Os01g48000(25 kDa).

2.5 RLKs抗體在水稻葉片組織中的表達(dá)

使用RLKs抗體按1∶2 500的稀釋倍數(shù)，對(duì)水稻苗期葉片中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，5個(gè)抗體均可識(shí)別水稻中的蛋白質(zhì)。其中，抗體Os04g49460可觀察到清晰的主帶，大小與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)值80 kDa基本相符，還有一條分子量稍大的弱帶出現(xiàn)；抗體Os01g06280檢測(cè)到單一的特異條帶，大小略高于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)值97 kDa；抗體Os03g21540檢測(cè)到單一的特異條帶，大小約為60 kDa，低于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)值 97 kDa；抗體Os03g43670可見有3條清晰的條帶，其中2條帶分子量略大于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)值99 kDa，一條帶分子量較小約為50 kDa；抗體Os01g48000檢測(cè)到單一的特異條帶，大小約為60 kDa，低于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)值89 kDa(圖5)。

圖4 RLKs抗體的重組抗原檢測(cè)Fig.4 Western blotting ofRLKs antibodies with recombinant proteins.Os04g49460(22 kDa); Os01g06280(19 kDa);Os03g21540(17 kDa); Os03g43670(22 kDa); Os01g48000(25 kDa).

圖5 RLKs抗體在水稻苗期葉片中的表達(dá)Fig.5 Expression ofRLKs in shoot of rice 93-11.Os04g49460(95 kDa, 80 kDa and 60 kDa); Os01g06280(130 kDa);Os03g21540(60 kDa); Os03g43670(130 kDa, 120 kDa and 50 kDa); Os01g48000(60 kDa).

造成抗體在水稻苗期葉片組織中檢測(cè)結(jié)果與其全長(zhǎng)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分子量不符這一結(jié)果的原因，很可能與蛋白質(zhì)在植物體內(nèi)不同的翻譯后修飾[15]以及不同的剪切形式有關(guān)。當(dāng)然，這其中也不能排除蛋白質(zhì)降解的因素。

3 討論

通常來講，抗體制備可以用全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)、片段蛋白或合成多肽作免疫原，若對(duì)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)進(jìn)行克隆，難度較大，甚至有些蛋白質(zhì)很難在體外表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)從5個(gè)RLKs蛋白質(zhì)出發(fā)，選取部分片段進(jìn)行克隆表達(dá)，并獲得了純化的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，采用這一方法可以獲得足量的高純度蛋白質(zhì)用于動(dòng)物免疫，得到具有較高特異性的抗體，證明了這一技術(shù)路線的可靠性[9-12]。本實(shí)驗(yàn)制備完成的 5個(gè)抗體，均能特異性識(shí)別水稻葉片中的蛋白質(zhì)，其中Os03g43670與馬云所做的抗體[12]一致，只是克隆的位置不同，馬云等檢測(cè)到水稻組織中的蛋白質(zhì)分子量約120 kDa，與預(yù)測(cè)分子量約99 kDa存在一些差異，這主要是由于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾造成的。

細(xì)胞壁在植物的生長(zhǎng)過程以及在遭受病原菌侵染或其他脅迫處理時(shí)發(fā)揮著重要作用，然而目前對(duì)植物細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)之間信號(hào)傳遞途徑還知之甚少，WAK提供了一個(gè)研究此過程的很好的候選對(duì)象，相信深入解析 WAK的作用機(jī)制將有助于我們了解細(xì)胞壁信號(hào)的傳遞過程，也為我們了解植物細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境刺激應(yīng)答過程中的調(diào)控提供幫助[2]。SRK位于柱頭表面乳突細(xì)胞的原生質(zhì)膜上，是甘藍(lán)等蕓薹屬作物柱頭識(shí)別自花花粉、啟動(dòng)自交不親和信號(hào)傳導(dǎo)和最終導(dǎo)致自花花粉萌發(fā)受阻的核心關(guān)鍵酶[8,16]。已報(bào)告的 LRR-RLKs參與調(diào)節(jié)的發(fā)育過程有花器官的脫落(HAESA)、表皮細(xì)胞特化(CRINKLY4)、調(diào)控長(zhǎng)角果的成熟發(fā)育(TMKL1)、雄性器官的發(fā)育(RPK1)等等[1]。

隨著水稻基因組序列信息的闡釋和轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的積累，基于抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究將成為現(xiàn)實(shí)。本研究以水稻為材料，克隆和表達(dá)蛋白激酶片段，純化蛋白質(zhì)并進(jìn)行抗體的制備，為進(jìn)一步研究激酶的生化特性和功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前利用 5個(gè)抗體對(duì)水稻不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)研究正在進(jìn)行中。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)體系的構(gòu)建對(duì)于其他植物類受體激酶的抗體制備及其功能研究具有重要的意義。

REFERENCES

[1]Shiu SH, Karlowski WM, Pan R,et al.Comparative analysis of the receptor-like kinase family inArabidopsisand rice.Plant Cell, 2004, 16(5): 1220?1234.

[2]Lally D, Ingmire P, Tong HY,et al.Antisense expression of a cell wall-associated protein kinase, WAK4, inhibits cell elongation and alters morphology.Plant Cell, 2001,13(6): 1317?1331.

[3]Becraft PW, Stinard PS, McCarty DR.CRINKLY4: a TNFR-like receptor kinase involved in maize epidermal differentiation.Science, 1996, 273: 1406?1409.

[4]Nam KH, Li JM.BRI1/BAK1, a receptor kinase pair mediating brassinosteroid signaling.Cell, 2002, 110(2):203?209.

[5]Song WY, Wang GL, Chen LL,et al.A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21.Science, 1995, 270: 1084?1086.

[6]Sun XL, Cao YL, Yang ZF,et al.Xa26, a gene conferring resistance toXanthomonas oryzaein rice, encodes an LRR receptor kinase-like protein.Plant J, 2004, 37: 517?527.

[7]Chen XW, Shang JJ, Chen DX,et al.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance.Plant J, 2006,46(5): 794?804.

[8]Goring DR, Rothstein SJ.The S-locus receptor kinase gene in a self-incompatibleBrassica napusline encodes a functional serine/threonine kinase.Plant Cell, 1992, 4(10):1273?1280.

[9]Katou S, Kuroda K, Seo S,et al.A calmodulin-binding mitogen-activated protein kinase phosphatase is induced by wounding and regulates the activities of stress-related mitogen-activated protein kinases in rice.Plant Cell Physiol, 2007, 48(2): 332?344.

[10]Cheong YH, Moon BC, Kim JK,et al.BWMK1, a rice mitogen-activated protein kinase, locates in the nucleus and mediates pathogenesis-related gene expression by activation of a transcription factor.Plant Physiol, 2003,132(2): 1961?1972.

[11]Cheng YW, Li L, Shen R,et al.Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of the extracellular domain about rice LRR receptor like protein kinase.Prog Biochem Biophys, 2008, 35(9): 1077?1083.程彥偉, 李亮, 沈嶸, 等.水稻 LRR型類受體蛋白激酶胞外區(qū)的原核表達(dá)及多克隆抗體制備.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2008, 35(9): 1077?1083.

[12]Ma Y, Sun DY, Sun Y.Preparation and identification of antibody against OsCR4, the receptor-like kinase from rice.Chin J Biochem Mol Bio, 2006, 22(11): 924?930.馬云, 孫大業(yè), 孫穎.水稻類受體激酶OsCR4的抗體制備及特異性檢測(cè).中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2006,22(11): 924?930.

[13]Li LY, Sun J, Wang HJ.High throughput cloning,expression and autophosphorylation analysis of rice kinases.J Mol Cell Bio, 2007, 40(3): 245?250.李莉云, 孫健, 王海嬌, 等.水稻蛋白激酶的規(guī)?；寺?、表達(dá)及活性研究.分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào), 2007, 40(3):245?250.

[14]Odorico M, Pellequer JL.BEPITOPE: predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins.J Mol Recognit, 2003, 16(1): 20?22.

[15]Kaothien P, Ok SH, Shuai B,et al.Kinase partner protein interacts with the LePRK1 and LePRK2 receptor kinases and plays a role in polarized pollen tube growth.Plant J,2005, 42(4): 492?503.

[16]Takasaki T, Hatakeyama K, Suzuki G,et al.The S receptor kinase determines self-incompatibility inBrassica stigma.Nature, 2000, 403: 913?916.

Journals.im.ac.cn

Preparation and verification of antibodies for five rice receptor-like kinases

Bo Wang, Liyun Li, Yinghao Cao, Ziguang Liu, and Guozhen Liu
College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China

Received:December 18, 2009;Accepted:March 30, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30670175, 30730007), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2006CB101705).

Corresponding author:Liyun Li.Tel/Fax: +86-312-7528271; E-mail: liliyun@hebau.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Nos.30670175, 30730007)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2006CB101705)資助。