從人類基因組到人造生命：克雷格·文特爾領(lǐng)路生命科學(xué)

孫明偉，李寅，高福

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)院微生物研究所 工業(yè)微生物與生物技術(shù)研究室，北京 100101 3 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230027 4 中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院，北京 100101

從人類基因組到人造生命：克雷格·文特爾領(lǐng)路生命科學(xué)

孫明偉1,3，李寅2，高福1,4

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)院微生物研究所 工業(yè)微生物與生物技術(shù)研究室，北京 100101 3 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230027 4 中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院，北京 100101

2010年5月20日，美國Science雜志報(bào)道J.Craig Venter 的研究小組制造了第一個(gè)能夠自我復(fù)制的人工合成生命，并立即引發(fā)了人們對這一研究潛在威脅的擔(dān)憂和有關(guān)生物安全和生物倫理的討論。但同時(shí)，這一成果也是人類在合成生物學(xué)領(lǐng)域的一次突破。我們相信在后基因組時(shí)代，合成生物學(xué)的發(fā)展必將廣泛地應(yīng)用于能源、環(huán)境、材料、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域，從而影響和改變?nèi)祟愇磥淼纳睢?/p>

人造生命，克雷格·文特爾，人類基因組計(jì)劃，合成生物學(xué)

Abstract:For the first time ever, the scientists of J.Craig Venter team have created actual self-replicating synthetic life.The research was just published in the Journal ofScienceon May 20, 2010.Although this news immediately brings the worry about the possible potential threat to biosecurity and biosafety as well as the ethical disputes, it yet indicates that mankind have made a new step forward in synthetic biology.In the time of post-genome era, we believe the advancement of synthetic biology that might affect or change the future life of human being will be widely used in energy, environment, materials, medication and many other fields.

Keywords:artificial life, Craig Venter, Human Genome Project, synthetic biology

自人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project，HGP)完成以后，生命科學(xué)進(jìn)入“后基因組時(shí)代”，生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)以及合成生物學(xué)等嶄新學(xué)科不斷出現(xiàn)，并得到快速發(fā)展。前不久，首個(gè)“具有人造DNA的活細(xì)胞”在J.Craig Venter的研究所橫空出世，該成果一經(jīng)報(bào)道立即引起了科學(xué)界、哲學(xué)界的轟動(dòng)，合成生物學(xué)這一新興學(xué)科也因此再次引起了人們的高度關(guān)注。

1 2010年夏天的“爆炸”新聞

2010年5月20日，J.Craig Venter私立研究所(J.Craig Venter Institute)的一個(gè)20多人的科研小組在美國Science雜志上報(bào)道了首例人造細(xì)胞的誕生。這是一個(gè)山羊支原體Mycoplasma capricolum細(xì)胞，但細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)卻是依照另一個(gè)物種即蕈狀支原體Mycoplasma mycoides的基因組人工合成而來，產(chǎn)生的人造細(xì)胞表現(xiàn)出的是后者的生命特性[1]。這是地球上第一個(gè)由人類制造并能夠自我復(fù)制的新物種。Craig Venter的團(tuán)隊(duì)將這一人造細(xì)胞稱作“Synthia”(意為：合成體)。

回顧Venter團(tuán)隊(duì)制造人造細(xì)胞的研究歷程，這項(xiàng)工作早在 1995年就開始了。在 2007年，Venter團(tuán)隊(duì)就已經(jīng)掌握了在這兩種支原體中進(jìn)行基因組轉(zhuǎn)移的技術(shù)，只不過當(dāng)時(shí)的操作對象是蕈狀支原體內(nèi)的天然DNA[2]。2008年2月，Venter團(tuán)隊(duì)又成功地合成了另一種原核生物——生殖支原體Mycoplasma genitalium的基因組DNA[3]。今天舉世矚目的人造細(xì)胞“Synthia”就是將以上兩種技術(shù)合而為一的結(jié)果。

支原體是目前發(fā)現(xiàn)的最小、最簡單的具有自我繁殖能力的細(xì)胞，其基因組也是原核生物中最小的，因此便于操作。盡管Venter團(tuán)隊(duì)已經(jīng)能夠合成生殖支原體的基因組，但由于生殖支原體生長極其緩慢，因此研究者選擇了生長較快的蕈狀支原體和山羊支原體作為實(shí)驗(yàn)對象，分以下4個(gè)步驟完成實(shí)驗(yàn)(圖1)。

圖1 文特爾人造生命合成示意圖Fig.1 The man-made life of Venter’s.

1)合成供體的基因組 DNA：首先，將蕈狀支原體的全基因組測序，并按照該序列信息將其合成為1 078條平均長度為1 080 bp的DNA片段。這些片段兩兩間具有 80 bp的部分重疊，所有片段拼接起來構(gòu)成蕈狀支原體的全長基因組。值得注意的是這些合成的片段較天然基因組略有一些改動(dòng)，包括去除了14個(gè)不重要的基因、為阻斷基因而設(shè)計(jì)的兩個(gè)插入序列、27處單核苷酸多態(tài)性(其中19處在意料之中)以及 4條用來區(qū)分于天然序列模本的“水印”標(biāo)記(Watermark)，這些改動(dòng)都不影響細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。該過程涉及到計(jì)算機(jī)對合成序列的精密計(jì)算。2)合成 DNA片段的拼接：將以上合成的1 078條DNA片段分別連接到載體，使其能在酵母細(xì)胞中通過同源重組拼接起來。于是，平均1 080 bp的DNA片段，10個(gè)一組拼接為大約10 kb的片段(109個(gè))，然后將這些連接有目的基因片段的載體從酵母中分離出來，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli中進(jìn)行擴(kuò)增，以限制酶篩選出陽性克??；之后再將陽性克隆質(zhì)粒中的這109條10 kb左右的片段按同樣的方法每組10個(gè)拼接成100 kb的片段(11個(gè))；這11條片段最終拼接成完整的總共1 077 947 bp的基因組(由于攜帶太大片段的載體在E.coli中不能穩(wěn)定傳代，因此后兩步拼接中采用多重PCR來篩選陽性克隆)。此過程除了 2個(gè)銜接反應(yīng)是在體外用酶處理構(gòu)建，其余所有的片段都是在酵母細(xì)胞內(nèi)依靠同源重組拼接而成。3)人工基因組的甲基化修飾：由于供體細(xì)胞(蕈狀支原體)和受體細(xì)胞(山羊支原體)共用同一套限制酶系統(tǒng)，而天然的供體基因組是經(jīng)甲基化修飾的。因此，拼接完成的基因組DNA還需在體外用甲基化酶(從蕈狀支原體或山羊支原體提取物中純化)進(jìn)行修飾，以避免受體細(xì)胞限制酶系統(tǒng)的阻礙。4)人工基因組移植入受體細(xì)胞：將構(gòu)建好的人工合成基因組移植入山羊支原體內(nèi)。細(xì)胞經(jīng)過不斷分裂傳代，具有人造基因組的細(xì)胞在含抗生素的培養(yǎng)基中篩選出來，同時(shí)含有天然DNA的細(xì)胞逐漸消失殆盡。最終只剩下含有山羊支原體細(xì)胞質(zhì)但由合成DNA控制的人工嵌合體細(xì)胞。雖然蕈狀支原體和山羊支原體在基因組上75%是同源的，但該人造細(xì)胞明顯表現(xiàn)出蕈狀支原體的生長特性。

其實(shí)，嵌合體細(xì)胞應(yīng)用遺傳工程手段早已實(shí)現(xiàn)。而Venter的“人造細(xì)胞”也只是遺傳物質(zhì)由人工合成，其他組分均來自于已有的生命形式。因此，一些媒體采用“首個(gè)人造生命”的說法言之過甚。相反，Venter等人在Science上的文章題目“創(chuàng)造由化學(xué)合成基因組控制的細(xì)菌細(xì)胞”更為嚴(yán)謹(jǐn)、客觀。但是無論如何，這項(xiàng)孕育15年、耗資4 000萬美元的科技成果，畢竟是生命科學(xué)發(fā)展的一大進(jìn)步，在合成生物學(xué)發(fā)展史上具有里程碑意義。

2 Craig Venter挑戰(zhàn)人類基因組計(jì)劃

John Craig Venter 出生于1946年，曾應(yīng)征加入美國海軍醫(yī)療隊(duì)參加越戰(zhàn)，越南戰(zhàn)場的殘酷使他認(rèn)識(shí)到時(shí)間和生命的寶貴，“人生的每一分鐘都應(yīng)該有所創(chuàng)新”?；貒?，Venter僅用了6年時(shí)間先后就讀于圣馬特奧學(xué)院(College of San Mateo)和加州大學(xué)圣迭戈分校(UC San Diego)，并在后者獲得了生物化學(xué)學(xué)士學(xué)位和生理學(xué)及藥理學(xué)的博士學(xué)位，從此開始了他的學(xué)術(shù)生涯。

2.1 國際人類基因組計(jì)劃與“霰彈槍測序法”

1984年，在一個(gè)由美國能源部資助的旨在討論日益發(fā)展的DNA重組技術(shù)的會(huì)議上，科學(xué)家們第一次討論了人類基因組測序的應(yīng)用價(jià)值[4]。這一年，Venter進(jìn)入了美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)，從事細(xì)胞表面受體研究。在這期間Venter逐漸對基因組研究產(chǎn)生濃厚興趣。1986年，Nature雜志上報(bào)道了Smith等發(fā)明的一種DNA序列自動(dòng)分析技術(shù)[5]，Venter立刻與發(fā)明人取得聯(lián)系。幾個(gè)月后，Venter便擁有了當(dāng)時(shí)NIH的第一臺(tái)自動(dòng)基因測序儀。而又是在這一年，諾貝爾獎(jiǎng)得主Renato Dulbecco在Science雜志文章中強(qiáng)調(diào)人類基因組測序?qū)χ斡┌Y和腫瘤的巨大作用[6]，同時(shí)Robert Sinsheimer等也首次對于人類基因組測序的可行性進(jìn)行了深刻探討，使得美國能源部決定對人類基因組啟動(dòng)計(jì)劃資助530萬美元[7-8]。1988年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)者James D.Watson著手領(lǐng)導(dǎo)在NIH成立的美國國家人類基因組研究中心(National Human Genome Research Institute，NHGRI)，Venter便作為其中的一員加入了這項(xiàng)計(jì)劃。1990年，號(hào)稱“30億美元，30億個(gè)堿基對”的人類基因組計(jì)劃由美國能源部和NIH正式啟動(dòng)，預(yù)期15年內(nèi)完成對人體10萬個(gè)基因的解碼，繪制出人類基因組圖譜。之后，英、法、德、日、印等國相繼加入，我國也在1999年9月正式加入人類基因組計(jì)劃并承擔(dān) 1%的測序工作。人類基因組計(jì)劃成為了一項(xiàng)國際間合作的科研計(jì)劃。

當(dāng)時(shí)，大量的人類基因組測序工作所采用的是“鏈終止法”或稱“末端終止法”，即先將大片段的DNA分子用限制酶切成小的片段作為 PCR模板，再在每組PCR體系中按一定比例摻入一種2′,3′雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，該化合物的加入將會(huì)使得DNA合成終止。經(jīng)過4組反應(yīng)(對應(yīng)4種 ddNTP)后，各種不同大小的片段末端即為該種核苷酸。再通過變性膠電泳，最終在自顯影圖上讀出相應(yīng)的DNA序列[9]?！版溄K止法”雖然能夠準(zhǔn)確地讀取特定DNA片段的序列，但該方法應(yīng)用于基因組測序也存在著很多弊端：首先，該方法只能處理堿基數(shù)目較少的DNA，無法應(yīng)付如人類基因組這般由上億個(gè)堿基對構(gòu)成的DNA庫?？上攵?，如果要將其用限制酶切割成小的片段一一進(jìn)行末端測序，最終的工作量將是驚人的。其次，該方法還需要大量完全相同的DNA拷貝，因此在測序前要構(gòu)建人工染色體，并在細(xì)菌中“克隆擴(kuò)增”，以增加目的片段的拷貝數(shù)。這樣無形中也加大了整項(xiàng)測序工作的成本和時(shí)間。因此這項(xiàng)跨世紀(jì)的計(jì)劃不僅耗資巨大，而且需要各國大量的人力、物力的共同參與方可完成。當(dāng)時(shí)在NIH參與工作的Venter也認(rèn)為用傳統(tǒng)的“鏈終止法”的測序效率實(shí)在太低，他提出一種更為簡單快捷的測序方法：將基因組打斷為數(shù)百萬個(gè)DNA片段，并對每個(gè)片段進(jìn)行末端測序，然后應(yīng)用一定算法的計(jì)算機(jī)程序?qū)⒕哂邢嗤┒诵蛄械钠沃匦抡掀唇釉谝黄?，從而得到整個(gè)基因組序列。該方法稱為霰彈槍測序法(Shotgun sequencing)，俗稱“鳥槍法”。但此提議卻遭到NIH的研究者的一致反對。他們認(rèn)為人類的染色體在端粒和著絲點(diǎn)處有著大量重復(fù)的序列，應(yīng)用“鳥槍法”進(jìn)行測序時(shí)，這些高度重復(fù)的序列會(huì)導(dǎo)致程序計(jì)算出錯(cuò)誤的結(jié)果。對于人類如此復(fù)雜的生命機(jī)體而言，該方法的精確性有待商榷。盡管Venter四處游說，但仍然無法為他的這一方法獲得公共資金支持，這讓他頗為沮喪。

1992年，Craig Venter在馬里蘭州的羅克維爾成立了他的第一家非盈利的基因組研究機(jī)構(gòu)——TIGR(The Institute for Genomic Research)。三年后，Venter所領(lǐng)導(dǎo)的 TIGR研究所完成了第一個(gè)單細(xì)胞自由生物流感嗜血桿菌Haemophilus influenzaeRd的全基因組序列測定[10]。當(dāng)時(shí)TIGR使用了14臺(tái)測序儀，僅 3個(gè)月的時(shí)間就完成了必需的 28 463個(gè)測序反應(yīng)，從而驗(yàn)證了霰彈槍測序法，同時(shí)也讓NIH的官員感到頗為難堪。1996年，他們又第一個(gè)完成了具有最小基因組的單細(xì)胞生物生殖支原體Mycoplasma genitalium[11]以及詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii的全基因組測定[12]，再一次證明了自己的實(shí)力。

2.2 Craig Venter的人類基因組計(jì)劃

國際人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)8年后的1998年，在PerkinElmer公司3.3億美元(僅是國際計(jì)劃的1/10)的投資下，Venter又建立了名為塞雷拉基因組(Celera Genomics)的私立公司，正式開始自己的人類基因組計(jì)劃。他堅(jiān)定地采用快速但頗具風(fēng)險(xiǎn)的霰彈槍測序法，并聲稱要在 3年內(nèi)完成人類基因組的序列測定。此時(shí)，由政府支持的人類基因組測序工作已經(jīng)花了8年時(shí)間，但僅僅測定了基因組的3%。雖然科學(xué)家們對Venter的“狂言”表示懷疑，但當(dāng)時(shí) Francis Collins領(lǐng)導(dǎo)的美國國家人類基因組研究所還是因此加快了研究進(jìn)度。遺憾的是，面對Venter這樣一個(gè)科學(xué)奇才，他們的努力仍然望塵莫及。2000年4月6日，Venter的研究小組向全世界宣布他們已經(jīng)完成了人類基因組的測序工作。然而，他們拒絕將得到的數(shù)據(jù)和全人類共享，也禁止他人自由發(fā)布或無償使用他們得到的基因數(shù)據(jù)，而且他們已經(jīng)將人類的 6 500個(gè)基因申請專利保護(hù)，這對于國際基因組聯(lián)盟來說無疑是當(dāng)頭一棒。最終美國總統(tǒng)克林頓和英國首相布萊爾聯(lián)合發(fā)表聲明稱人類基因組數(shù)據(jù)不允許專利保護(hù)，且必須對所有研究者公開，才使得人類基因組圖譜這一全人類的財(cái)富沒有變成私有。不久，國際基因組聯(lián)盟也完成了人類基因組工作草圖的繪制。

2000年6月 26日，美國總統(tǒng)克林頓等六國領(lǐng)導(dǎo)人共同宣布人類基因組計(jì)劃的草圖完成。雖然，Venter為基因申請專利的舉動(dòng)不能被接受，但也正是由于他的貢獻(xiàn)，使得預(yù)計(jì)15年才能完成的工作，提前3年便得已竣工。2001年2月國際人類基因組測序聯(lián)盟和Venter在Celera公司的研究團(tuán)隊(duì)的人類基因組工作草圖的具體序列信息、測序方法以及序列的分析結(jié)果分別發(fā)表于Nature與Science雜志[13-14]。Craig Venter和人類基因組研究所所長Francis Collins一起分享了當(dāng)年A&E Network頒發(fā)的生物年度獎(jiǎng)(Biography of the Year)。

Venter的成功，也是他的創(chuàng)新點(diǎn)就在于計(jì)算機(jī)技術(shù)的運(yùn)用：Venter用計(jì)算機(jī)程序模擬基因定序，而不再通過手工操作測序。這樣就可以將一個(gè)細(xì)胞的所有基因分成無數(shù)個(gè) DNA片段，提供給測序機(jī)“解碼”。再通過相應(yīng)的程序算法處理由此產(chǎn)生的瑣碎數(shù)據(jù)，并把解讀的“密碼”一步步拼接成完整的基因組序列。大量工作交給計(jì)算機(jī)后，極大地提高了測序工作的效率?！皞鹘y(tǒng)基因技術(shù)用數(shù)十年才能完成的工程縮減到數(shù)月、數(shù)周，甚至數(shù)天完成”，就連對Venter批評很多的諾貝爾獎(jiǎng)得主James Watson也不得不承認(rèn)他的發(fā)現(xiàn)是“科學(xué)上的偉大時(shí)刻”。

在人類基因組測序的競爭中，研究人員表現(xiàn)出了令人難以置信的凝聚力、專注和驚人的速度。今年4月Nature雜志發(fā)表?？度祟惢蚪M十年記》[15]。5月21日“首個(gè)單細(xì)胞生命”在Venter手中誕生。這一歷史性突破，可以說是對“人類基因組計(jì)劃完成十周年”的最好紀(jì)念，同時(shí)也是進(jìn)入“后基因組時(shí)代”的十年來生命科學(xué)迅速發(fā)展的最精彩的詮釋。

3 早期的合成生物學(xué)及中國的貢獻(xiàn)

如果說 Craig Venter是國際上率先解讀人類基因組的研究者之一，那么在合成生物學(xué)領(lǐng)域他絕對是世界上“制造”能夠自我復(fù)制的細(xì)胞基因組的第一人。人造細(xì)胞“Synthia”的誕生，讓Craig Venter又一次站在了全世界的聚光燈下。但如果從廣義的角度解讀“合成人工生命”，Venter的工作還算不上是“首次”。

2002年，紐約州立大學(xué) Wimmer小組的 Cello等人制造了歷史上第一個(gè)人工合成的病毒——脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)。這是一種單股正鏈 RNA病毒，病毒侵入細(xì)胞后，RNA在病毒蛋白、RNA依賴的聚合酶以及其他相關(guān)蛋白的幫助下，轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈，并以此作為模板合成新的病毒基因組。該研究小組則按照相反的方向，用化學(xué)方法合成了與病毒基因組RNA互補(bǔ)的cDNA，使其在體外RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄成病毒的RNA，并且在無細(xì)胞培養(yǎng)液中翻譯并復(fù)制，最終重新裝配成具有侵染能力的脊灰病毒[16]。若將這種合成的病毒注射到小鼠體內(nèi)可使其脊椎麻痹，甚至死亡。但該種合成病毒的毒力很小，僅相當(dāng)于天然病毒的一千到一萬分之一。這一工作開創(chuàng)了以無生命的化合物合成感染性病毒的先河。

2003年，Hamilton O.Smith和Craig Venter僅用了兩周時(shí)間便合成了噬菌體φX174的基因組，該病毒只有11個(gè)基因(5 386 bp)，但將合成的基因組DNA注入宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞的反應(yīng)和感染了真正的φX174噬菌體的細(xì)胞一樣[17-18]。

2008年，Becker等設(shè)計(jì)并合成了蝙蝠體內(nèi)的SARS樣冠狀病毒基因組，并將該基因組中受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Receptor-binding domain，RBD)替換為之前流行的SARS病毒的RBD，并成功感染了培養(yǎng)的人呼吸道上皮細(xì)胞(HAE)以及小鼠。這一29.7 kb的 RNA序列是當(dāng)時(shí)合成的最大的可以自我復(fù)制的基因組[19]。

之后Venter又將挑戰(zhàn)目標(biāo)指向原核生物。2007年8月，他的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)能夠?qū)⑥钪гw的整個(gè)基因組分離為“裸露”的DNA并將其移植到山羊支原體中，實(shí)現(xiàn)了不同物種間的基因組轉(zhuǎn)輸[2]。之后Venter又率領(lǐng)一個(gè)17人小組首次嘗試人工合成細(xì)胞基因組，最終在2008年成功地利用酵母細(xì)胞的同源重組完成了生殖支原體的全基因組合成，創(chuàng)造了當(dāng)時(shí)世界上最大的人工合成的DNA組織(582 970個(gè)堿基對)[3,20]。

科學(xué)界對于人造生命的實(shí)踐還是從本世紀(jì)初才興起的。而上個(gè)世紀(jì)60年代就開始的對于核酸和蛋白質(zhì)等有機(jī)物的人工合成也為人們后來嘗試合成生命奠定了基礎(chǔ)。這也要?dú)w功于中國在合成生物學(xué)方面的貢獻(xiàn)：1965年9月 17日，我國人工合成了結(jié)晶牛胰島素，這是世界上首次人工合成蛋白質(zhì)，也是當(dāng)時(shí)人工合成的具有生物活力的最大的天然有機(jī)化合物[21-23]。在1979年Khorana等合成酪氨酸阻遏tRNA[24]之后，中國科學(xué)院上海生化研究所王德寶等歷時(shí)13年，經(jīng)過千百次的探尋和摸索，在世界上最早用人工方法合成了具有與天然分子相同化學(xué)結(jié)構(gòu)和完整生物活性的核糖核酸——酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸(Yeast alanine tRNA)。這種核糖核酸由 76個(gè)核苷酸組成，其中除了 4種常見的核苷酸外，還有 7種稀有的核苷酸。利用化學(xué)和酶促相結(jié)合的方法，研究者自行制備出了11種核苷酸、近10種核糖核酸工具酶和有關(guān)的化學(xué)試劑等，并采取有機(jī)化學(xué)和酶促合成的方法，先合成了幾十個(gè)長度為 2～8個(gè)核苷酸的寡核苷酸鏈，然后用T4 RNA連接酶連接成6個(gè)大片段(長度為9～19個(gè)核苷酸)，然后分別接成含有35和41個(gè)核苷酸的兩個(gè)半分子。最后終于在1981年11月20日完成了最后的合成，以后又進(jìn)行了5次重復(fù)合成試驗(yàn)，均獲得了成功。在人類探索生命科學(xué)的道路上邁出了重要的一步[25-26]。

“Synthia”的問世，似乎讓人們覺得當(dāng)年震驚世界的科學(xué)奇才Venter一下子又在實(shí)驗(yàn)室中制造出世上沒有的人工生命。其實(shí)不然，雖然Venter以其過人的智慧在基因組與合成生物學(xué)領(lǐng)域走在世界前列，但人造生命的產(chǎn)生也并非一日之功。前人在生物合成以及人造病毒等方面的工作，為Venter在合成支原體細(xì)胞提供了豐富的依據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。而且，Venter也是在自己先前合成生殖支原體基因組以及天然基因組種間移植的工作基礎(chǔ)上，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，反復(fù)摸索，才在2年之后獲得成功[27]。因此，人造生命的出現(xiàn)并非偶然。

4 合成生物學(xué)的貢獻(xiàn)和困擾

4.1 合成生物學(xué)的概念與意義

合成生物學(xué)(Synthetic biology)是一門建立在系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)之上，并以基因組技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物科學(xué)。

合成生物學(xué)一詞最早出現(xiàn)于 1911年的The Lancet雜志[28]，但許多學(xué)者認(rèn)為合成生物學(xué)成為一門真正的學(xué)科開始于2000年[29-31]。進(jìn)入后基因組時(shí)代以后，集成系統(tǒng)生物學(xué)思想的合成生物學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，它綜合了生物化學(xué)、生物物理和生物信息等技術(shù)，利用基因和基因組的基本要素及其組合，設(shè)計(jì)、改造、重構(gòu)或是創(chuàng)造生物分子、生物體部件、生物反應(yīng)系統(tǒng)、代謝途徑與網(wǎng)絡(luò)乃至具有生命活力的生物個(gè)體。目前的合成生物學(xué)研究可以籠統(tǒng)分為兩大類：一類是以創(chuàng)造人造生命為目的，利用非天然的分子再現(xiàn)自然生物體的天然特性；另外一類則是力求分離自然生物體中的一部分并將其重構(gòu)到具有非天然機(jī)能的生物系統(tǒng)當(dāng)中，這種包含了天然成分的合成又叫半合成生物學(xué)。無論哪種類型，都推動(dòng)著科學(xué)家們深入以往未知的領(lǐng)域，并可能遇到以前很難遇到的問題和困難，最終通過分析解決這些問題是所有合成生物學(xué)工作者的共同目標(biāo)[32]。

合成生物學(xué)的研究既是生命科學(xué)和生物技術(shù)在分子生物學(xué)和基因工程水平上的自然延伸，又是在系統(tǒng)生物學(xué)和基因組綜合工程技術(shù)層次上的整合性發(fā)展。其目的在于設(shè)計(jì)和構(gòu)建工程化的生物體系，使其能夠處理信息、加工化合物、制造材料、生產(chǎn)能源、提供食物、處理污染等。從而增強(qiáng)人類的健康，改善生存的環(huán)境，以應(yīng)對人類社會(huì)發(fā)展所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

4.2 人造生命的技術(shù)困擾和挑戰(zhàn)

合成生物學(xué)是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的新興領(lǐng)域。早在本世紀(jì)初，它就已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。然而，“合成生物學(xué)”第一次真正進(jìn)入大眾視野，還是緣于這次“世界首個(gè)人造生命”的新聞事件。本次合成的支原體細(xì)胞較以前無論是病毒還是噬菌體基因組都要大出很多倍，Venter等的工作首次將合成生命的對象推廣到原核生物，實(shí)現(xiàn)了合成生物學(xué)在細(xì)胞基因組水平的突破。

殊不知，雖然本次實(shí)驗(yàn)的最終產(chǎn)品是支原體細(xì)胞，但真核酵母卻是這場表演的真正主角。目前的DNA合成技術(shù)還不能一次得到很長的序列片段，Venter小組合成的蕈狀支原體的DNA，也是將整個(gè)基因組截成1 078條DNA片段來合成，然后把它們插入酵母細(xì)胞中，利用酵母中具有超強(qiáng)DNA修復(fù)功能的酶，將平均長度為1 080 bp的DNA片段拼接成1 077 947 bp的全長基因組。

因此準(zhǔn)確地說，人造細(xì)胞“Synthia”唯一非天然的部分便是它依照蕈狀支原體合成的基因組，但這1 000多kb的DNA，如果不是借助酵母的細(xì)胞環(huán)境，僅靠化學(xué)合成仍然是不能完成的。這也是目前人造生命主要的技術(shù)困擾之一：人工合成生命體的遺傳物質(zhì)在體外無法達(dá)到細(xì)胞基因組水平的最小長度；而且這些化學(xué)合成的“核酸”也并不一定能在細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制傳代并指導(dǎo)生命活動(dòng)，所以更談不上僅依靠這些化合物從頭產(chǎn)生有生命的個(gè)體。另外 Venter的小組合成的基因組也并非絕對的憑空“創(chuàng)造”。無論是2年前合成的生殖支原體基因組，還是這一次的蕈狀支原體人造基因，除了幾處極少的改動(dòng)外，基本等同于這些天然細(xì)胞的基因序列?？傊?，目前的人造生命不可能完全脫離其天然范本和細(xì)胞環(huán)境。

在后基因組時(shí)代，基因測序和DNA合成技術(shù)雖然日臻成熟，且成本也越來越低。但人造生命或者其他合成生物學(xué)的研究仍然沒有想象中簡單。就以“Synthia”的產(chǎn)生過程為例，當(dāng)正確的DNA序列移入到受體(山羊支原體)后卻不正常工作。最終Venter他們還是通過甲基化酶的DNA修飾才克服了受體細(xì)胞的限制性。由于表觀遺傳學(xué)所涉及的各種因素，往往序列正確的DNA組裝成結(jié)構(gòu)正確的染色體后還是會(huì)在胞內(nèi)發(fā)生沉默；外源基因的插入還可能造成細(xì)胞原有代謝途徑的改變，從而影響到正常生命活動(dòng)的進(jìn)行。另外，生命系統(tǒng)的復(fù)雜多變、系統(tǒng)中各部件的功能尚不明朗，這些都成為合成生物學(xué)研究的技術(shù)困擾與發(fā)展制約[33]。同時(shí)這也正是人類基因組破譯10年后，其研究成果不能直接應(yīng)用于醫(yī)療的具體原因之一[15]。

4.3 生物安全與生物倫理

合成生物學(xué)研究只有突破各種技術(shù)壁壘和制約瓶頸，才能最終蓬勃發(fā)展起來。作為以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)的一門新興學(xué)科，捷報(bào)頻傳的成果已經(jīng)說明了合成生物學(xué)巨大的生命力和廣闊應(yīng)用前景，未來隨著自然科學(xué)的飛速發(fā)展和合成生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，一定可以實(shí)現(xiàn)對微生物乃至高等動(dòng)植物進(jìn)行定向改造，甚至直接制造出世界上不存在的生命個(gè)體。但隨之而來的生物倫理和生物安全等備受關(guān)注的問題又令一些學(xué)者望而卻步。如同 30多年前的DNA重組技術(shù)是否會(huì)對人類健康造成威脅的問題一樣，一些必須面對的社會(huì)問題也困擾著合成生物學(xué)家們。2004年6月在美國麻省理工學(xué)院(MIT)舉行的第一屆合成生物學(xué)國際會(huì)議上除了涉及合成生物學(xué)的科學(xué)與技術(shù)問題外，還討論了這一學(xué)科當(dāng)前與未來的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)、有關(guān)倫理學(xué)問題以及知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題。隨著這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，對于合成生物學(xué)的安全性的考慮越來越多。人們所擔(dān)心的正是對這些人工合成的微生物有意或無意的誤用，讓一些具有致病感染性的病菌威脅人類和其他生物的安全[34]；或者在實(shí)驗(yàn)室中制造出未經(jīng)自然選擇而產(chǎn)生的物種，而這些生物的某些特性很可能影響到生態(tài)環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，這些危害一旦發(fā)生后果將是難以預(yù)知和控制的[35]。倘若合成生物技術(shù)被應(yīng)用于制造生物武器，更會(huì)讓人感到異?？謶?。但另一方面，合成生物學(xué)的貢獻(xiàn)和前景已是有目共睹，合理開展合成生物學(xué)研究，將極大地推動(dòng)經(jīng)濟(jì)與社會(huì)的發(fā)展。一味地逃避風(fēng)險(xiǎn)而停下探索的腳步無異于因噎廢食。當(dāng)然，在進(jìn)行各種類型的研究之前，一定的監(jiān)督和對價(jià)值與風(fēng)險(xiǎn)的評估都是必要的[36]。這樣才能使這一學(xué)科向著對全人類有益的方向發(fā)展；在未來才會(huì)有更多生命科學(xué)的發(fā)明創(chuàng)造在能源、環(huán)境、資源、健康等領(lǐng)域得到應(yīng)用。這些應(yīng)用才是科學(xué)家開創(chuàng)合成生物學(xué)的真正初衷，也是合成生物學(xué)本身的意義所在。

另外，合成生物學(xué)的發(fā)展過程也一直伴隨著有關(guān)倫理道德的爭論。一些宗教組織還認(rèn)為生物合成無異于扮演上帝造物，有悖自然倫理。其實(shí)不然，類似于基因重組這樣的工作幾乎每天都發(fā)生在任何一個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中。況且，一些致病的病毒和細(xì)菌同樣是自然界的產(chǎn)物，而人類卻一直為消滅它們而進(jìn)行著斗爭。天花病毒早已滅絕，脊髓灰質(zhì)炎病毒也幾近絕跡，沒有什么比這更像在充當(dāng)上帝的角色，但也不會(huì)有哪個(gè)理智的人對此感到遺憾。另外，合成生物學(xué)遠(yuǎn)沒有發(fā)展到可以任意創(chuàng)造生命的程度?！叭我鈩?chuàng)造生命”既不是目前合成生物學(xué)發(fā)展水平所能及，也不是發(fā)展該學(xué)科的最終意義。諾貝爾和平獎(jiǎng)獲得者Schweitzer 醫(yī)生曾經(jīng)寫到“我必須堅(jiān)持這樣一個(gè)事實(shí)：生命意識(shí)透過我展示了她自己，成為與其他生命意識(shí)相互依存的一員”。人們不該因?yàn)槟w淺的信條而削減了認(rèn)識(shí)自然與追求真理的動(dòng)力。感受和領(lǐng)悟“生命之美”恰恰是每一個(gè)生命科學(xué)研究者的理想與責(zé)任。但同時(shí)，對生物倫理的擔(dān)心與討論也值得被重視，相關(guān)的觀點(diǎn)也應(yīng)該受到尊重。

5 展望

當(dāng)生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時(shí)代的第10年，合成生物學(xué)也在 Craig Venter等人的一個(gè)個(gè)創(chuàng)新與突破中走過了 10個(gè)年頭。今天，“人造細(xì)胞”的成功見證了合成生物學(xué)領(lǐng)域由無機(jī)到有機(jī)，從基因組到細(xì)胞的又一次飛越。讓人不禁感嘆現(xiàn)代生物科技的高度發(fā)達(dá)。這一研究成果與其說是人類征服自然過程中的一次勝利，不如說是自然賦予我們的又一新知。

系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展使人們對生物系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)逐漸加深。隨著基因組數(shù)據(jù)庫的日益豐富，生物信息學(xué)、基因與蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域的進(jìn)步，新的技術(shù)方法、更高的效率以及更低的成本將推動(dòng)合成生物學(xué)在更多學(xué)科和領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)從局部向整體、由分散到系統(tǒng)的多元化發(fā)展。合成生物學(xué)有著巨大的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，必將在能源、環(huán)境、化工、材料、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是，目前的合成生物學(xué)仍然有很多思想上和技術(shù)上的困難要克服。Craig Venter的挑戰(zhàn)與創(chuàng)新精神正是未來所需要的。生物合成已不僅僅是一個(gè)科學(xué)問題，更是一個(gè)人類問題與社會(huì)問題。

在生命科學(xué)飛速發(fā)展的21世紀(jì)，科技進(jìn)步需要積極、合理并有預(yù)見性地融入合成生物學(xué)的研究方法。唯有這樣，合成生物學(xué)這把“雙刃劍”才能真正成為人類認(rèn)識(shí)世界和征服世界的利器；人們的未來生活才能最大程度地受益于生命科學(xué)的探索成果。合成生物學(xué)的潛能是巨大的：人造器官、廉價(jià)高效的藥物生產(chǎn)、清潔并可持續(xù)的生物能源……這些美好的前景需要的是耐心和努力，以及一大批科學(xué)家和工程師們的創(chuàng)新與探索[29]。因此，合成生物學(xué)任重而道遠(yuǎn)。

附錄 合成生物學(xué)大事記

1828年，Wohler利用氰酸銨合成尿素[37]。

1953年，Miller通過放電合成氨基酸，模擬原始地球的有機(jī)物發(fā)生過程[38]。

1965年9月17日，中國合成了第一個(gè)人工合成的蛋白質(zhì)——結(jié)晶牛胰島素[21-22]。

1968年，Khorana等合成了核苷酸及基因密碼子[39]。

1970年，Khorana等首次用化學(xué)方法人工合成了有77個(gè)核苷酸對的酵母丙氨酸的結(jié)構(gòu)基因[40]。

1972年，Price和Conover等的實(shí)驗(yàn)室各自用反向轉(zhuǎn)錄酶合成了家兔和人的珠蛋白基因，這是首次合成真核生物的基因[41]。

1973年8月，Khorana等又合成了具有126個(gè)核苷酸對的大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因，但并沒有轉(zhuǎn)錄功能[42]。

1973年11月，Stanley Cohen和Herbert Boyle等精確地把基因或者DNA片段插入其他細(xì)胞中，從而建立了重組DNA技術(shù)[43-44]。

1977年，美國加州大學(xué)的 Boyer等用化學(xué)方法合成了人生長激素抑制因子的基因[45]。

1979年，Khorana等合成了酪氨酸阻遏tRNA以及酪氨酸t(yī)RNA基因[24,46]。

1981年11月20日，中國合成酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖

核酸[25-26]。

2000年1月，Gardner等在大腸桿菌中構(gòu)建了基因開關(guān)(Toggle switch)，一個(gè)合成的雙穩(wěn)態(tài)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[31]。Elowitz等構(gòu)建了第一個(gè)合成的生物振蕩器——壓縮振蕩子(Repressilator)[30]。這兩項(xiàng)事件標(biāo)志著合成生物學(xué)作為一項(xiàng)新的領(lǐng)域正式產(chǎn)生。

2000年11月，Brenner等設(shè)計(jì)向細(xì)胞DNA中參入天然不存在的堿基的方法來發(fā)展人工遺傳系統(tǒng)，支持人工生命形式[47]。

2001年，Schultz實(shí)驗(yàn)室向大腸桿菌蛋白質(zhì)生物合成裝置中添入新的組分(tRNA/氨酰-tRNA合成酶組合)，使之能通過基因生成非天然的氨基酸[48]。

2002年8月，Cello等制造了第一個(gè)人工合成的病毒——脊髓灰質(zhì)炎病毒[16]。

2003年7月，Keasling等在美國勞倫斯伯克利國家實(shí)驗(yàn)室設(shè)立合成生物學(xué)部，并在大腸桿菌中成功地建立了合成青蒿素的網(wǎng)絡(luò)，使得青蒿素價(jià)格降低到原來的1/10[49]。

2003年8月，Schultz實(shí)驗(yàn)室又發(fā)明了一種向酵母中加入非天然氨基酸密碼子的方法，成功地向蛋白質(zhì)中導(dǎo)入了5種氨基酸[50]。

2003年12月，Craig Venter等合成了噬菌體φX174的基因組[18]。

2004年6月，第一屆合成生物學(xué)國際會(huì)議在美國麻省理工學(xué)院召開。

2004年10月，美國、加拿大與日本的學(xué)者合作將收集到的 1918年西班牙流感病毒的 DNA片段進(jìn)行分析，并據(jù)此人工合成了該株流感病毒編碼HA和NA蛋白的基因，進(jìn)而獲得了新的流感病毒。該病毒表現(xiàn)出與西班牙亞型流感病毒相近的致病性[51]。

2004年12月，Libchaber領(lǐng)導(dǎo)的研究小組嘗試創(chuàng)造了一個(gè)模擬人造生物——“囊生物反應(yīng)器”(Vesicle bioreactors)，其組成部分來自不同的生物材料：由蛋清中的脂肪分子和大腸桿菌細(xì)胞提取物組成?！澳疑铩眱?nèi)的基因可控制合成 α-溶血素(α-hemolysin)[52]。

2005年8月19日，美國舊金山舉行了合成生物學(xué)會(huì)議，討論了合成生物學(xué)在藥物開發(fā)、細(xì)胞編程和生物機(jī)器人方面的潛在應(yīng)用，以及隨之而來的生物安全、倫理、法律等問題。

2005年11月，麻省理工學(xué)院的研究人員在E.coli中加入一個(gè)合成的傳感器激酶，使細(xì)菌能對不同光照條件作出應(yīng)答[53]。

2006年，Keasling實(shí)驗(yàn)室將多個(gè)青蒿素生物合成基因?qū)虢湍妇挟a(chǎn)生了青蒿酸，并通過對代謝網(wǎng)絡(luò)不斷改造和優(yōu)化，使產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級(jí)水平的提高[54]。

2008年2月，Craig Venter小組合成了生殖支原體的基因組DNA，這是第一個(gè)人工合成的原核生物基因組[3]。

2008年12月，Becker等設(shè)計(jì)并合成了重組的蝙蝠SARS樣冠狀病毒[19]。

2009年2月，日本東京大學(xué)和科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)的Tomohisa Sawada等應(yīng)用納米技術(shù)合成了只有1對堿基對的世界最短的雙鏈 RNA片段和只有 3對堿基對的雙鏈DNA片段[55]。

2010年1月，美國Cell雜志和英國Nature雜志同時(shí)為合成生物學(xué)創(chuàng)建10年發(fā)表專題社論，并提出合成生物學(xué)將面臨的挑戰(zhàn)[29,33,56]。

2010年5月20日，Craig Venter小組人工合成了蕈狀支原體基因組，并在山羊支原體細(xì)胞中成功復(fù)制、翻譯并傳代。實(shí)現(xiàn)了第一個(gè)具有人造基因組的活細(xì)胞[1]。

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From human genome to man-made life: J.Craig Venter leads the life sciences

Mingwei Sun1,3, Yin Li2, and George F.Gao1,4
1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 Department of Industrial Microbiology and Biotechnology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 3 College of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230027, China 4 Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Received:June 12, 2010;Accepted:June 17, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China for Distinguished Young Investigator(No.30525010).

Corresponding author:George F.Gao.Tel: +86-10-64807688; Fax: +86-10-64807882; E-mail: gaof@im.ac.cn國家自然科學(xué)基金委員會(huì)杰出青年科學(xué)基金(No.30525010)資助。