聚乙烯亞胺包裹小環(huán)DNA形成的納米顆粒傳輸外源基因的性質表征

張超，劉鶴，高詩娟，黃文林,3，王宗燁

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101 2 解放軍第306醫(yī)院放療中心，北京 100101 3 中山大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣州 510060

聚乙烯亞胺包裹小環(huán)DNA形成的納米顆粒傳輸外源基因的性質表征

張超1，劉鶴1，高詩娟1，黃文林1,3，王宗燁2

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101 2 解放軍第306醫(yī)院放療中心，北京 100101 3 中山大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣州 510060

聚乙烯亞胺(PEI)是一種具有良好生物安全性和生物相容性的非病毒載體，能高效轉染腫瘤細胞。小環(huán)DNA是一種去除質粒細菌骨架，只含有目的基因表達框的環(huán)狀DNA分子。與普通質粒相比，小環(huán)DNA具有表達效率高、持續(xù)時間長的優(yōu)勢。使用PEI包裹攜帶報告基因gfp和抑癌基因pten小環(huán)DNA載體，并利用各種技術手段分析了該傳輸系統(tǒng)的理化性質和生物學效應。凝膠阻滯實驗、電鏡實驗及MTT實驗分析結果表明利用PEI包裹小環(huán)DNA和質粒DNA體系性質無顯著的差別，并且2種復合物對細胞毒性亦無明顯差別；但是動態(tài)光散射實驗結果顯示由于PEI可以包裹更多數量的小環(huán)DNA，所以PEI包裹小環(huán)DNA形成的復合物粒徑要略大于包裹質粒DNA形成的復合物粒徑。熒光顯微鏡實驗、real-time PCR分析和Western blotting 分析結果表明，PEI包裹小環(huán)DNA形成的復合物對細胞的轉染效率要遠遠高于PEI包裹質粒DNA所形成的復合物，并且小環(huán)所攜帶的外源基因的表達效率要遠遠高于質粒DNA所攜帶的外源基因的表達效率。實驗結果表明，PEI包裹小環(huán)DNA形成的納米顆粒在細胞轉染過程中具有很高的表達效率，這一研究結果為PEI包裹小環(huán)DNA的非病毒載體系統(tǒng)在傳輸外源基因過程中的應用提供理論基礎和技術支持。

聚乙烯亞胺，小環(huán)DNA，gfp基因，pten基因，納米顆粒，基因傳輸

Abstract:Polyethylenimine(PEI)is one of the most characterized non-viral vectors.It can condense DNA in a good manner and achieve high transfection efficiency.Minicircle DNA(mc-DNA)is a novel kind of supercoiled DNA which is devoid of bacterial backbone.mc-DNA is superior to conventional DNA for its higher transfection effciciency and longer time-span.In this study, we combined PEI and mc-DNA in gene delivery system.We investigated the physicochemical and biochemical effects of this non-viral system and further explore its potential in tumor gene therapy.mc-DNA was obtained by recombination of parentalplasmid in the presence of L-arabinose, and complexed with PEI.The results of transmission electron microscopy and scanning electron microscopy showed that the particles were spherical and homogeneous.Through gel retardation assay and MTT assay, we found that there were no obvious differences in binding capability of PEI to mc-DNA and plasmid DNA, as well as in cytotoxicity.The results of dynamic light scattering showed that the size of PEI/mc-DNA was about 68 nm, a slight larger than that of PEI/plasmid DNA.Furthermore, the tumor cells transfected with mc-GFP showed higher GFP expression level than that of conventional plasmid.The same results were achieved in the cells treated with tumor-suppressor gene pten, assayed by RT-PCR and Western blot.It indicates that the system of PEI/minicircle DNA is promising in gene transfer.

Keywords:polyethylenimine, minicircle DNA,gfp,pten, nanoparticle, gene delivery

基因傳輸系統(tǒng)是當前研究的一個熱點。目前用于基因傳輸的載體可分為病毒載體和非病毒載體 2種。與病毒載體相比，非病毒載體具有安全性高、容易制備和修飾、基因容量大的優(yōu)勢[1-2]。其中，聚陽離子化合物聚乙烯亞胺(PEI)是研究最多和最有效的非病毒載體之一。PEI具有“質子海綿效應”，因此能夠很好地復合帶負電荷的DNA分子，并且能夠將復合的 DNA 運送到細胞核內，實現有效的基因轉染[3-5]。小環(huán) DNA是一種去除了細菌骨架，而只含有目的基因表達框的新型環(huán)狀DNA，它是由母環(huán)質粒DNA在ΦC31重組酶的誘導下重組產生的。研究表明，與普通質粒相比，小環(huán)DNA具有表達效率高、表達時間長的優(yōu)勢[6-9]。除此之外，小環(huán)DNA因為缺乏質粒 DNA 中的抗性基因，因此更為安全[10]。Park等利用PEI包裹攜帶脂聯素基因的小環(huán)DNA治療II型肥胖糖尿病小鼠，取得了比使用普通質粒系統(tǒng)更好的治療效果[11]。但是關于PEI包裹小環(huán)DNA這一傳輸體系的理化性質，以及它在腫瘤細胞中的生物學效應等方面的研究尚未見報道。因此，本研究用PEI包裹攜帶報告基因gfp和抑癌基因pten的小環(huán)DNA，并利用各種技術手段比較該體系相對質粒DNA體系的理化和生化性質的差別，探討PEI包裹小環(huán) DNA的非病毒載體系統(tǒng)在基因傳輸中應用的可行性，并為探索該系統(tǒng)在腫瘤基因治療中的應用提供前期的理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種和細胞

p2ΦC31質粒由美國斯坦福大學陳志英教授惠贈；pEGFPN1質粒購自美國Clontech公司；pBS-T載體和大腸桿菌TOP10購自中國TIANGEN生物科技有限公司；pShuttle和pCDNA3.1-PTEN由本實驗室保存。人轉化腎上皮細胞系293T、人乳腺癌細胞系 MCF-7、人宮頸癌細胞系HeLa和人肝癌細胞系HepG2購自美國ATCC。

1.2 主要試劑和材料

L-阿拉伯糖、樹枝狀聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI，MW 25 kDa)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)等購自美國Sigma-Aldrich公司；限制性內切酶和連接酶購自日本 TaKaRa公司；胎牛血清購自Hyclone公司；DMEM購自美國Gibco公司；質粒提取試劑盒和TRNzol Total RNA Reagent 購自中國TIANGEN生物科技有限公司；M-MLV逆轉錄酶系統(tǒng)購自美國Promega公司；抗PTEN鼠多克隆抗體、HRP標記羊抗鼠IgG抗體購自中山金橋公司。

1.3 質粒構建

1.3.1p2ΦC31-EGFPN1質粒的構建

用BglII 和BamH I雙酶切pEGFPN 1質粒，將得到的載體片段進行自連，轉化大腸桿菌TOP10，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得pEGFPN1-2。以pEGFPN1-2質粒為模板擴增得到 CMV-EGFP-polyA的基因片段，上游引物：5′-GGACTAGT GTAATC AATTACGGGGTCATTAG-3′，下游引物：5′-GGACT AGT CGCCTTAAGATACATTGATGAGT-3′(下劃線代表SpeI酶切位點)，將得到的目的基因片段克隆到 p2ΦC31載體中，轉化大腸桿菌，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得p2ΦC31-EGFPN1。

1.3.2 p2ΦC31-PTEN質粒的構建

以 pCDNA3.1-PTEN質粒為模板擴增得到pten的基因片段，上游引物：5′-GCTCTAGA ATGACAGC CATCATCAAAGAG-3′(下劃線部分為XbaI 酶切位點)，下游引物：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTAT-3′(下劃線部分為NotI酶切位點)，將擴增的片段通過XbaI 和NotI雙酶切后克隆到 pShuttle載體中，轉化大腸桿菌 TOP10，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得pShuttle-PTEN。用SpeI和EcoR I雙酶切 pShuttle-PTEN得到CMV-PTEN-BGH的基因片段，將該片段連入pBS-T載體，轉化大腸桿菌 TOP10，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得pBS-T-PTEN。用SpeI和XhoI雙酶切 pBS-T-PTEN，將得到的基因片段克隆到p2ΦC31載體中，轉化大腸桿菌，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得p2ΦC31-PTEN。

1.3.3 小環(huán)DNA的誘導和純化

本實驗中的方法步驟是根據 Chen等所介紹的方法稍做改動[7]。將質粒轉化的E.coliTOP10接種到 Tris-borate培養(yǎng)基中，過夜搖菌，當OD600約為2.50時離心、收菌，將菌團重懸于原液體積1/4的，含1.5%的L-阿拉伯糖的LB(Amp+)培養(yǎng)基中，在32℃搖床上250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～4 h，接下來向菌液中加入其 1/2體積的，含 1%的 L-阿拉伯糖LB(Amp+)培養(yǎng)基(pH 8.0)，隨之將溫度調至37℃，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～4 h，收集菌體并用質粒提取試劑盒提取小環(huán)DNA。

1.4 復合物的理化性質表征

1.4.1 聚陽離子復合物的制備

首先，將一定量的PEI溶于150 mmol/L的NaCl溶液中，用0.22 μm的濾膜(Millipore)過濾除菌得到聚陽離子溶液；將提取的DNA溶于超純水中。然后，將一定量的聚陽離子溶液滴加到DNA溶液中，邊滴加邊振蕩，并將形成的復合物室溫放置15～30 min，制成不同N/P比(PEI中的N原子數/DNA中的P原子數)的復合物(DNA濃度為20 mg/L)。

1.4.2 凝膠阻滯實驗

將制備好的復合物在1%(W/V)的瓊脂糖膠上進行電泳，電泳緩沖液為 Tris-acetate(TAE)，電壓為140 V，電泳時間30 min，電泳結束后將膠放在溴化乙錠(EB，0.5 mg/L)中染色5 min，用紫外燈(λ=312 nm)進行觀察。

1.4.3 動態(tài)光散射法測量顆粒粒徑

將制備的聚陽離子復合物以3 000 r/min 離心10 min 去除灰塵顆粒，取上清用動態(tài)光散射儀(DynaPro Tian，Wyatt Technology Inc)進行測量。每個樣品重復測量3次。

1.4.4 透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米顆粒形態(tài)結構

制備PEI/mc-DNA 復合物，將制備的復合物滴加到300目的銅網上，室溫孵育5 min，將顆粒用醋酸鈾染色5 min，用去離子水洗滌，過夜晾干，樣品用透射電子顯微鏡(JEM-1400，Tokyo，Japan)進行觀察。

1.4.5 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察納米顆粒形態(tài)結構

用超濾膜收集顆粒，室溫下過夜晾干，將樣品用金包被，然后用兩面導電的膠帶裱在一個stub上，用掃描電子顯微鏡(Quanta 200，FEI company，Holland)進行觀察。

1.5 MTT實驗

細胞以 104/孔接種于 96孔板(邊緣孔用無菌PBS填充)，在5% CO2，37℃條件下孵育24 h，之后換為DMEM無血清培養(yǎng)基，并將不同N/P比的復合物加入每孔細胞中。5% CO2，37℃孵育24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，應用酶聯免疫檢測儀在OD570處測量各孔的吸光值，計算細胞存活率。

1.6 細胞培養(yǎng)和轉染

細胞在含10% 胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL氨芐和100 mg/L氯霉素的DMEM培養(yǎng)基(37℃，5% CO2)中貼壁生長。轉染前將細胞按1×104/孔接種于96孔板的孔中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當細胞濃度達到80%～90%時，將培養(yǎng)基換為DMEM無血清培養(yǎng)基并轉染特定 N/P比的復合物，每孔轉入質粒的量均為0.3 μg，在 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 4～6 h，之后用含10% 血清的DMEM培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)30 h，進行后續(xù)的檢測。轉染細胞中GFP蛋白表達用倒置熒光顯微鏡(Axiovert200，ZEISS，Germany)檢測。

1.7 半定量RT-PCR

收集 5×106的細胞，用 TRNzol Total RNA Reagent并依據其說明書提取總 RNA。取 2 μg RNA，1 μg Random Primer，DEPC 水補至 10 μL；70℃水浴變性5 min；冰上驟冷后加入2 μL dNTPs(10 nmol/L)，1 μL RNAse inhibitor，8 μL 5×Reaction Buffer，1 μL M-MLV 逆轉錄酶，DEPC 水補至 40 μL，37℃水浴1 h。然后進行PCR，PCR的反應條件為：94℃ 5 min，1 個循環(huán)；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃ 終延伸5 min。pten的上游引物：5′-GAACTGGTGTAATGATATGTGCATATT T-3′，下游引物：5′-ATTTTTTGTTAAAGTAAGTAC TAGATAT-3′；β-actin 的上游引物 5′-CTACAATG AGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物：5′-CAGGTCCAG ACGCAGGATGGC-3′。

1.8 Western blotting檢測蛋白表達

收集處理和未處理的293T細胞，用IP細胞裂解液提取總蛋白，用Bradford法測量蛋白濃度，各取40 μg蛋白進行12%的 SDS-PAGE凝膠電泳，然后在冰上300 mA條件下轉膜1 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一定稀釋比例的一抗4℃反應過夜，用TBST洗滌3次，再加連接有辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育1 h，然后用凝膠成像儀檢測。

2 結果

2.1 重組母環(huán)質粒和小環(huán)DNA的酶切鑒定

小環(huán) DNA的誘導過程如圖1所示。p2ΦC31-EGFPN1 用SpeI單酶切得到約大于10 kb的片段，與預期結果一致(圖2A)。p2ΦC31-PTEN用插入位點SpeI和XhoI雙酶切得到約9.7 kb的載體片段和約2.3 kb的pten基因片段，與預期結果一致(圖2C)。pShuttle-PTEN用插入位點XbaI和NotI雙酶切得到約4.0 kb的載體片段和約1.2 kb的pten基因片段，與預期一致(圖2E)。小環(huán)DNA 的電泳和酶切電泳結果顯示(圖2B，D)，誘導產生得到的minicircle-GFP(mc-GFP)和minicircle-PTEN(mc-PTEN)的電泳條帶很亮，相比較而言，殘余的母環(huán)和細菌骨架條帶比較弱。信號強度分析顯示mc-GFP和mc-PTEN的得率均占總DNA的95%以上，說明實驗中小環(huán)的誘導比較完全。

圖1 p2ΦC31-EGFPN1和p2ΦC31-PTEN質粒誘導產生小環(huán)DNA的示意圖Fig.1 Diagrams of p2ΦC31-EGFPN1or p2ΦC31-PTEN and production of mc-GFP or mc-PTEN.Flow chart of ΦC31 integrase-mediated intramolecular recombination of p2ΦC31-EGFPN1 and p2ΦC31-PTEN.The resulting products are mc-GFP and mc-PTEN, respectively.BAD: araBAD promoter; araC: araC repressor; attB: bacterial attachment site; attP: phage attachment site;attR: right hybrid sequence; Amp: ampicillin resistance gene.

圖2 p2ΦC31-EGFPN1、p2ΦC31-PTEN和pShuttle-PTEN質粒及小環(huán)mc-GFP和mc-PTEN的酶切鑒定Fig.2 Identification of DNA with(+)or without(-)enzyme digestion.(A)p2ΦC31-EGFPN1 and(B)mc-GFP digested with or withoutXhoI.(C)p2ΦC31-PTEN and(D)mc-PTEN digested with or withoutSpeI andXhoI.(E)pShuttle-PTEN digested with or withoutXbaI andNotI.M: DNA marker.

2.2 DNA遷移實驗比較PEI復合DNA的能力

小環(huán)DNA因為去除了細菌骨架，所以比普通質粒DNA要小(圖1)。由于之前的研究表明，聚陽離子在復合大小存在差異的質粒和siRNA 的能力上存在明顯區(qū)別[12-13]，所以在本實驗中，凝膠阻滯實驗被用來評價小環(huán)DNA與質粒DNA大小的差別是否影響 PEI復合兩者的能力。結果顯示(圖3)，聚合物PEI在復合兩種DNA的能力上沒有明顯區(qū)別。在N/P比為4或大于4時，未觀測到有質粒DNA和小環(huán)DNA的條帶，說明當N/P值為4時，PEI能夠完全復合這2種DNA。

圖3 凝膠阻滯實驗比較PEI復合質粒DNA和小環(huán)DNA的能力Fig.3 Agarose gel electrophoresis of(A)pEGFPN1 and(B)mc-GFP complexed by PEI at different N/P ratios.Complete retardation of PEI/pEGFPN1 and PEI/mc-GFP were achieved at N/P ratio of 4.

2.3 動態(tài)光散射實驗考察顆粒粒徑

通過動態(tài)光散射法測量PEI復合質粒DNA和小環(huán)DNA后形成的納米顆粒的粒徑，結果顯示復合物PEI/pEGFPN1的粒徑為(62.4±0.8)nm，復合物PEI/mc-GFP的粒徑為(68.4±1.8)nm。PEI復合小環(huán)DNA形成的顆粒的粒徑大于復合質粒DNA形成的顆粒粒徑，結果與之前Park等的報道相符合[11]。這可能是由于顆粒內小環(huán) DNA的拷貝數多于質粒DNA的拷貝數引起的。

2.4 電鏡觀察納米顆粒形態(tài)結構

通過透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察PEI復合小環(huán)DNA形成的納米顆粒的形態(tài)結構，從圖中可以看出復合物 PEI/mc-DNA能夠形成大小均一、形態(tài)規(guī)則的納米顆粒(圖4)。

圖4 透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察顆粒的形態(tài)Fig.4 Transmission electron microscopy and Scanning electron microscopy of PEI/mc-DNA polyplexes.The polyplexes were formed in 150 mmol/L NaCl solution with a DNA concentration of 20 mg/L and observed by(A)TEM and(B)SEM.The polyplexes were pointed by arrow.

2.5 MTT法檢測復合物對細胞的毒性

我們用MTT法考察小環(huán)DNA和質粒DNA形成復合物對細胞毒性的影響，從圖5中可以發(fā)現，2種復合物對細胞的毒性隨著N/P比的增加而增加，PEI復合小環(huán)DNA及復合質粒DNA形成的納米顆粒對細胞毒性的影響沒有明顯的區(qū)別。

圖5 MTT法檢測復合物的細胞毒性Fig.5 Cytotoxicity evaluated with the MTT assay in HepG2(A)and HeLa(B)cells.Results are presented as±s.

2.6 攜帶gfp基因的小環(huán)DNA和質粒DNA的表達量的比較

熒光顯微鏡觀察 293T、MCF-7、HeLa 細胞中GFP的表達，結果顯示(圖6)2種復合物在不同細胞中均有較高的轉染效率，并且復合物PEI/mc-GFP的轉染效率在不同細胞中均高于復合物 PEI/pEGFPN1的轉染效率。表明轉染小環(huán)DNA形成的復合物具有比普通質粒系統(tǒng)更高的表達效率。

2.7 RT-PCR比較攜帶pten基因的小環(huán)DNA和質粒DNA的表達量

為進一步探索PEI復合小環(huán)DNA的載體系統(tǒng)應用到腫瘤基因治療中的可行性，從RNA水平和蛋白水平比較攜帶抑癌基因pten的小環(huán) DNA和質粒DNA系統(tǒng)的表達量。

RT-PCR的結果顯示(圖7)，轉染了復合物PEI/mc-PTEN的293T、MCF-7、HeLa細胞中PTEN的表達量明顯高于轉染了復合物PEI/p2ΦC31-PTEN細胞中的水平，表明比起普通質粒系統(tǒng)，攜帶pten基因的小環(huán)DNA系統(tǒng)具有更高的mRNA轉錄水平。

圖6 PEI復合質粒DNA和小環(huán)DNA形成的納米顆粒轉染細胞后GFP表達量的比較(100×)Fig.6 Gene transfection efficiency examined by GFP expression in varied cells at N/P ratio of 15(100×).

圖7 RT-PCR比較小環(huán)DNA體系和普通質粒DNA體系轉染的細胞中mRNA水平Fig.7 Analysis of PTEN expression by RT-PCR.Total RNA was extracted, reverse transcribed, and amplified.RT-PCR was carried.1: pCDNA; 2: mc-PTEN; 3: p2ΦC31-PTEN.

2.8 Western blotting比較攜帶 pten基因的小環(huán)DNA和質粒DNA在細胞中的表達效率

Western blotting 實驗結果表明(圖8)，mc-PTEN轉染的 293T細胞中 PTEN的表達量顯著高于p2ΦC31-PTEN轉染的細胞中PTEN的表達量，進一步從蛋白表達水平說明小環(huán) DNA系統(tǒng)比普通質粒DNA系統(tǒng)具有更高的表達效率。而mc-PTEN 轉染的MCF-7細胞中這種差別不是很明顯，這可能是由于MCF-7的轉染效率比較低造成的。

圖8 Western blotting比較小環(huán)DNA體系和質粒DNA體系轉染的細胞中PTEN基因的蛋白表達效率Fig.8 Protein expression of PTEN in human 293T cells and MCF-7 cells by Western blotting assay.1: pCDNA; 2:mc-PTEN; 3: p2ΦC31-PTEN.

3 討論

在過去的研究報道中，小環(huán)DNA在細胞水平的轉染主要是通過脂質體介導的，而用 PEI運載小環(huán)DNA的研究僅有 Park等組成的研究小組進行過相關報道[11]。他們利用PEI運載攜帶脂聯素基因的小環(huán)DNA治療 II型肥胖小鼠，動物實驗結果顯示使用小環(huán) DNA系統(tǒng)攜帶的脂聯素基因的表達量顯著高于使用普通質粒系統(tǒng)的表達量。除此之外，關于PEI包裹小環(huán)DNA這一傳輸體系的理化性質，以及它在腫瘤細胞中的生物學效應等方面的研究還沒有相關報道。本研究用 PEI包裹攜帶報告基因gfp和抑癌基因pten的小環(huán)DNA，并利用各種技術手段比較該體系相對質粒 DNA體系的理化和生化性質的差別，探討PEI包裹小環(huán)DNA的非病毒載體系統(tǒng)在腫瘤細胞基因傳輸中的可行性。

研究結果表明PEI能夠很好的復合小環(huán)DNA，并且形成均一規(guī)則的納米顆粒，顆粒的粒徑大小為(68.4±1.8)nm。研究表明100 nm左右的納米顆粒，通過血液循環(huán)后能夠很好地富集到腫瘤部位，這主要是由于腫瘤血管存在著200～400 nm的空隙，小于這個尺寸的納米顆粒能夠通過并到達腫瘤組織，這種性質被稱為 enhanced permeability and retention effect(EPR)效應[2,14]。因此，將PEI復合小環(huán)DNA的納米顆粒應用于腫瘤基因治療中，可能能夠實現被動靶向腫瘤組織，從而減少毒副作用。

通過對理化性質的研究發(fā)現，PEI復合小環(huán)DNA和復合質粒DNA差別并不是很明顯，但是比較兩者轉染腫瘤細胞后GFP的表達發(fā)現，相比較質粒DNA系統(tǒng)來說，小環(huán)DNA系統(tǒng)能夠實現更為高效的表達。由于理化性質無明顯差別，因此這種差別主要是由于小環(huán)DNA自身的優(yōu)勢引起的。研究表明，質粒DNA中的細菌骨架能夠在空間上順式抑制基因的轉錄，小環(huán)DNA由于去除了細菌骨架而去除了這種抑制作用，因此能夠實現更為高效的表達[15]。

為了進一步探討PEI運載小環(huán)DNA的基因傳輸系統(tǒng)在腫瘤治療中的潛在價值，本研究將抑癌基因pten引入到這一系統(tǒng)中，結果進一步表明小環(huán)DNA系統(tǒng)比普通質粒DNA系統(tǒng)具有更高的表達優(yōu)勢，因此能夠發(fā)揮更強的抑癌效果。之前有研究應用小環(huán)DNA攜帶 IFNγ治療鼻咽癌的荷瘤小鼠，并且取得良好的效果，小環(huán)DNA在IFNγ的表達量和治療效果方面都有明顯的優(yōu)勢[16]。本研究的結果為小環(huán) DNA在腫瘤基因治療方面的可行性提供了理論基礎和技術支持。

然而，PEI復合小環(huán)DNA的載體系統(tǒng)和普通質粒系統(tǒng)類似[17]，能夠導致較大的細胞毒性，因此以后的研究仍需要進一步對該系統(tǒng)進行修飾和改良，減少對細胞的毒性和機體的損傷。

綜上所述，PEI復合小環(huán)DNA能夠形成均一規(guī)則的納米顆粒，而且形成的復合物在腫瘤細胞轉染中具有比普通質粒系統(tǒng)更高的表達優(yōu)勢。研究表明PEI復合小環(huán)DNA的載體系統(tǒng)在基因傳輸中具有比較顯著的優(yōu)勢。

REFERENCES

[1]Niidome T, Huang L.Gene therapy progress and prospects:nonviral vectors.Gene Ther, 2002, 9(24): 1647?1652.

[2]Davis ME, Chen ZG, Shin DM.Nanoparticle therapeutics:an emerging treatment modality for cancer.Nat Rev Drug Discov, 2008, 7(9): 771?782.

[3]Godbey WT, Wu KK, Mikos AG.Poly(ethylenimine)and its role in gene delivery.J Control Release, 1999, 60(2/3):149?160.

[4]Godbey WT, Wu KK, Mikos AG.Tracking the intracellular path of poly(ethylenimine)/DNA complexes for gene delivery.Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(9): 5177?5181.

[5]Sonawane ND, Szoka FC, Verkman, AS.Chloride accumulation and swelling in endosomes enhances DNA transfer by polyamine-DNA polyplexes.J Biol Chem,2003, 278(45): 44826?44831.

[6]Chen ZY, He CY, Ehrhardt A,et al.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expressionin vivo.Mol Ther, 2003,8(3): 495?500.

[7]Chen ZY, He CY, Kay MA.Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expressionin vivo.Hum Gene Ther, 2005, 16(1): 126?131.

[8]Darquet AM, Cameron B, Wils P,et al.A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle.Gene Ther, 1997, 4(12): 1341?1349.

[9]Darquet AM, Rangara R, Kreiss P,et al.Minicircle: an improved DNA molecule forin vitroandin vivogene transfer.Gene Ther, 1999, 6(2): 209?218.

[10]Jia F, Wilson KD, Sun N,et al.A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.Nature methods, 2010,7(3): 197?199.

[11]Park JH, Lee M, Kim SW.Non-viral adiponectin gene therapy into obese type 2 diabetic mice ameliorates insulin resistance.J Control Release, 2006, 114(1): 118?125.

[12]Shim MS, Kwon YJ.Controlled cytoplasmic and nuclear localization of plasmid DNA and siRNA by differentially tailored polyethylenimine.J Control Release, 2009,133(3): 206?213.

[13]Stevenson M, Ramos-Perez V, Singh S,et al.Delivery of siRNA mediated by histidine-containing reducible polycations.J Control Release, 2008, 130(1): 46?56.

[14]Shchors K, Evan G.Tumor angiogenesis: cause or consequence of cancer?Cancer Res, 2007, 67(15):7059?7061.

[15]Chen ZY, Riu E, He CY,et al.Silencing of episomal transgene expression in liver by plasmid bacterial backbone DNA is independent of CpG methylation.Mol Ther, 2008, 16(3): 548?556.

[16]Wu J, Xiao X, Zhao P,et al.Minicircle-IFNgamma induces antiproliferative and antitumoral effects in human nasopharyngeal carcinoma.Clin Cancer Res, 2006, 12(15):4702?4713.

[17]Kunath K, von Harpe A, Fischer D,et al.Low-molecularweight polyethylenimine as a non-viral vector for DNA delivery: comparison of physicochemical properties,transfection efficiency andin vivodistribution with high-molecular-weight polyethylenimine.JControl Release, 2003, 89(1): 113?125.

Polyethylenimine and minicircle DNA based gene transfer

Chao Zhang1, He Liu1, Shijuan Gao1, Wenlin Huang1,3, and Zongye Wang2
1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 Radiotherapy Center, the 306thHospital of P.L.A, Beijing 100101, China 3 State Key Laboratory of Oncology in South China, Cancer Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, China

Received:March 9, 2010;Accepted:April 7, 2010

Supported by:Knowledge Innovation Program in Chinese Academy of Sciences(No.KSCX1-YW-R-10), National Natural Science Foundation of China(Nos.30901751, 30973448), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2010CB529904).

Corresponding author:Zongye Wang.Tel: +86-10-64872016; E-mail: wangzye@163.com中國科學院知識創(chuàng)新工程基金項目(No.KSCX1-YW-R-10)，國家自然科學基金(Nos.30901751, 30973448)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(973計劃)(No.2010CB529904)資助。