非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞表達(dá)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子

陳慧梅，曹廣力，薛仁宇，貢成良

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215123

非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞表達(dá)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子

陳慧梅，曹廣力，薛仁宇，貢成良

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215123

為了建立非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞系，將家蠶核型多角體病毒極早期基因(ie-1)啟動(dòng)子控制的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表達(dá)盒克隆至 pIZT/V5-His，獲得重組載體pIZT-IE-hGM-CSF，該載體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞后，通過博萊霉素(Zeocin)篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系IE-hGM-CSF。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組經(jīng)PCR鑒定，成功檢測到ie-hGM-CSF，Western blotting分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的重組hGM-CSF的大小為22 kDa，ELISA檢測結(jié)果顯示hGM-CSF在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系里的表達(dá)水平大約為2 814.7 pg/106個(gè)細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化，pIZT/V5-His，hGM-CSF，BmN細(xì)胞

Abstract:To develop the stable transformants of the silkworm(Bombyx mori)BmN cells that could continuously express the exogenous gene based on a non-transposon vector, an expression cassette containing human granucyto-macrophage colony-stimulating factor(hGM-CSF)gene driven byie-1 promoter fromB.morinucleopolyhedrovirus was inserted into pIZT-V5-His to form a recombinant vector pIZT-IE-hGM-CSF, followed by transfecting the constructant into BmN cells, the stable ie-hGM-CSF cell lines were obtained after being selected with Zeocin.PCR result using the genomic DNA of the transformed BmN cells as template illustrated a specific fragment ofie-hGM-CSF, and Western blotting analysis using an antibody against hGM-CSFdemonstrated a specific band with a molecular weight of 22 kDa in the transformed cells,meanwhile, the expression level of hGM-CSF determined by ELISA was about 2 814.7 pg in 106transformed BmN cells.

Keywords:transformation, pIZT/V5-His, hGM-CSF, BmN cells

目前主要通過大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞 4種系統(tǒng)來表達(dá)外源蛋白[1]，這 4大表達(dá)系統(tǒng)在科學(xué)研究、新藥研發(fā)等方面發(fā)揮了巨大的作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)屬于原核表達(dá)系統(tǒng)，具有良好的操作性、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但重組蛋白不能進(jìn)行翻譯后修飾加工，難以獲得高活性的目的蛋白；酵母表達(dá)系統(tǒng)屬于低級的真核表達(dá)系統(tǒng)，可以進(jìn)行翻譯后加工修飾，但發(fā)生錯(cuò)誤修飾的機(jī)率較高；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過加工修飾表達(dá)的外源蛋白與天然蛋白結(jié)構(gòu)最為接近，但表達(dá)量不高，并且培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞成本高、操作復(fù)雜。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作簡單，易培養(yǎng)，成本相對較低，并且可以進(jìn)行糖基化等修飾，可以生產(chǎn)得到高活性的外源蛋白。昆蟲表達(dá)一般采用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)。BEVS是一種瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲細(xì)胞會(huì)因?yàn)椴《靖腥径劳?，外源基因不能?shí)現(xiàn)連續(xù)、傳代表達(dá)，另外盡管桿狀病毒進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞不能產(chǎn)生有效感染，但目前仍未排除桿狀病毒對宿主潛在的危害[2-3]，而通過昆蟲轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)外源基因其表達(dá)水平較低，約為BEVS的1%[4]，但是通過轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞克服了BEVS的一些缺點(diǎn)，它是一種永久性的表達(dá)系統(tǒng)，形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系細(xì)胞可以持續(xù)、傳代培養(yǎng)，并且昆蟲細(xì)胞的安全性比BEVS的要高許多。目前已有一些獲得穩(wěn)定昆蟲細(xì)胞系的報(bào)道[5-7]，但有關(guān)家蠶穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞報(bào)道卻不多見[7]。Jarvis等[4]利用苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)ie-1啟動(dòng)子控制 β-半乳糖苷酶基因表達(dá)元件的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞，通過抗生素G418篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，并且經(jīng)過多次傳代后，外源基因仍能穩(wěn)定表達(dá)；Cherbas等[5]通過相似的方法同樣獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化果蠅Drosophila melanogaster細(xì)胞系；趙越等[8]用攜帶neo、綠色熒光蛋白(gfp)及家蠶絲膠基因啟動(dòng)子(Pser-1)驅(qū)動(dòng)人胰島素樣生長因子(hIGF-Ⅰ)表達(dá)的基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，經(jīng)過G418的篩選，獲得了可以穩(wěn)定表達(dá)hIGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。

人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第1個(gè)被克隆和利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的一種造血生長因子，能夠刺激T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖、成熟和分化，具有極其重要的免疫調(diào)解功能，在造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，因此具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[9]。目前市場上銷售的hGM-CSF多是通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白，探討 hGM-CSF的新表達(dá)方法對重組 hGM-CSF的生產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)意義。

pIZT/V5-His是Invitrogen公司開發(fā)的一種能用于昆蟲 Sf9細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)外源基因的載體，該載體可隨機(jī)多拷貝整合至昆蟲細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且載體含有博萊霉素(Zeocin)抗性基因和綠色熒光蛋白(gfp)基因融合表達(dá)盒。利用該載體通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化Sf9細(xì)胞表達(dá)外源基因已有一些研究[10-12]，但用于家蠶BmN細(xì)胞的研究還不多見。目前BmN細(xì)胞廣泛用于家蠶基因功能的鑒定、重組蛋白的表達(dá)、家蠶核型多角體病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovius，BmNPV)的分子生物學(xué)研究等。它屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有細(xì)胞易培養(yǎng)、重組蛋白的后加工比較完善等優(yōu)點(diǎn)。為了檢測 pIZT/V5-His載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化家蠶細(xì)胞表達(dá)外源基因的能力，本研究將ie-1啟動(dòng)子控制的hGM-CSF表達(dá)盒克隆至pIZT/V5-His載體，獲得了重組轉(zhuǎn)基因載體 pIZT-IE-hGM-CSF，家蠶BmN細(xì)胞轉(zhuǎn)染該載體后，通過Zeocin篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)hGM-CSF的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，為利用家蠶細(xì)胞表達(dá)外源基因提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

載體pIZT/V5-His購自Invitrogen公司。帶有桿狀病毒極早期啟動(dòng)子ie-1控制的 hGM-CSF表達(dá)盒的重組質(zhì)粒 pSK-IE-hGM-CSF[13]、宿主菌E.coliTG1、家蠶卵巢來源的BmN細(xì)胞系均由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、T4 DNA連接酶等購自 Fermentas公司。X-gal、IPTG、20×PBS等購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。凝膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。hGM-CSF ELISA kit購自 USCN Life Science &Technology Company。兔抗 hGM-CSF抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京博奧森公司。TC-100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Lipofectin、博萊霉素均購自Invitrogen公司。

1.2 引物

參照 GenBank中的 BmNPV-T3株基因組全序列(Accession No.L33180))的/ie-1基因啟動(dòng)子區(qū)域序列和hGM-CSF基因序列，設(shè)計(jì)引物 p1(5′-CGGGTACC GATTTGCAGTTCGGGAC-3′，下劃線表示EcoRⅠ酶切位點(diǎn))、p2(5′-CGGAATTCC ACTCCTGGACTGGCTCCC-3′，下劃線表示KpnⅠ酶切位點(diǎn))，以及 hGM-CSF-1(5′-TGGATATCATGT GGCTGCAGAGCCTGC-3′，下劃線表示EcoR V酶切位點(diǎn))、hGM-CSF-2(5′-ATCTCGAGAAGCTTAT CACTCCTGGACTGGCTCCC-3′，下劃線表示XhoI、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 轉(zhuǎn)基因載體PIZT-IE-hGM-CSF的構(gòu)建

以質(zhì)粒pSK-IE-hGM-CSF為模板，以p1/p2為引物，通過PCR擴(kuò)增ie-hGM-CSF片段(約1 kb)。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性 5 min；95℃ 50 s，52℃50 s，72 ℃ 1 .5 min ，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳、割膠回收后，用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的 pIZT/V5-His載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTG1的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有博萊霉素的 LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選單菌落，快抽質(zhì)粒進(jìn)行 PCR鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pIZT-IE-hGM-CSF。該載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 轉(zhuǎn)基因載體PIZT-IE-hGM-CSF的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schenmatic diagram of transgenic vector PIZT-IE-hGM-CSF.OpIE1: IE1 promoter of OpNPV;gfp: green fluorescent protein gene; Zeocin: Zeocin resistance gene;SV40pA: polyA signal of SV40; OpIE2: IE2 promoter of OpNPV; IEpro: IE1 promoter.

1.3.2 家蠶BmN細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選

家蠶BmN細(xì)胞用含10%胎牛血清的TC-100在26℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光細(xì)胞，4 d后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基，同時(shí)添加博萊霉素至終濃度30 mg/L，連續(xù)篩選1個(gè)月，期間觀察綠色熒光細(xì)胞的比例。當(dāng)綠色熒光細(xì)胞達(dá)80%以上時(shí)，收集細(xì)胞，抽提基因組進(jìn)行鑒定。

1.3.3 hGM-CSF表達(dá)的檢測

當(dāng)綠色熒光細(xì)胞比例達(dá)70%以上時(shí)，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加1 mL 1× PBS反復(fù)吹打細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，?20℃反復(fù)凍融3次后，10 000 r/min、4℃離心 10 min，取上清，稀釋5倍，按照 ELISA試劑盒的使用說明測定 hGM-CSF的表達(dá)水平，重復(fù) 2次。剩余的上清加 2倍體積的無水乙醇，?20℃冷凍1 h，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，加30 μL的1× PBS溶解，與上樣緩沖液混合后，100℃水浴5 min，離心后取上清進(jìn)行 SDS-PAGE(濃縮膠為 5%，分離膠為15%)和Western blotting分析，Western blotting用兔抗 hGM-CSF為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG為二抗。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因載體pIZT-IE-hGM-CSF的鑒定

構(gòu)建的質(zhì)粒 pIZT-IE-hGM-CSF用EcoRⅠ、KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，可檢測到約1 kb的特異性條帶；以 pIZT-IE-hGM-CSF為模板，p1/p2為引物，進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出約1 kb的特異性條帶，另外對載體進(jìn)行測序，各種結(jié)果均表明轉(zhuǎn)基因載體pIZT-IE-hGM-CSF已構(gòu)建成功。

2.2 pIZT-IE-hGM-CSF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選與鑒定

pIZT-IE-hGM-CSF轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下可以明顯觀察到部分細(xì)胞呈綠色熒光(圖2A)，表明質(zhì)粒DNA已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，gfp基因已正確表達(dá)；轉(zhuǎn)染4 d后開始用博萊霉素篩選，隨著篩選時(shí)間的延長，熒光細(xì)胞比例逐漸增加。1個(gè)月后，熒光細(xì)胞比例可達(dá) 70%以上(圖2B)，表明Zeocin抗性基因以及GFP基因已正確表達(dá)。并可在維持這一熒光比例的情況下穩(wěn)定傳代大約10次(圖2C)，所獲的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系命名為IE-hGM-CSF。為了鑒定外源DNA是否已整合至細(xì)胞基因組，以抗生素篩選2個(gè)月的熒光細(xì)胞基因組為模板，分別以p1/p2和 hGM-CSF-1/hGM-CSF-2為引物，可分別檢測到約1 kb和430 bp的特異性產(chǎn)物，表明ie-1啟動(dòng)子控制的hGM-CSF基因已整合進(jìn)細(xì)胞基因組(圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染pIZT-IE-hGM-CSF后經(jīng)zeocin篩選的轉(zhuǎn)化BmN細(xì)胞Fig.2 Transformed cells screened from BmN cells transfected with pIZT-IE-hGM-CSF by using Zeocin.(A)24 hours after transfection.(B)One month after transfection.(C)Two months after transfection.

2.3 SDS-PAGE和Western blotting檢測

為了分析hGM-CSF在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，收集博萊霉素篩選 2個(gè)月的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE分析，未檢測到Zeocin-GFP和hGM-CSF特異性條帶，而Western blotting檢測結(jié)果顯示，在22 kDa處有明顯的特異性條帶出現(xiàn)(圖4)，表明hGM-CSF已在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中正確表達(dá)。

2.4 ELISA檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中hGM-CSF的表達(dá)水平

根據(jù)hGM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA檢測數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，取轉(zhuǎn)化細(xì)胞用ELISA試劑盒檢測hGM-CSF的表達(dá)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果：hGM-CSF在轉(zhuǎn)基因 BmN細(xì)胞中的表達(dá)水平為 2 814.7 pg/106個(gè)細(xì)胞，而正常BmN細(xì)胞中基本未檢測到。

圖3 轉(zhuǎn)化BmN細(xì)胞基因組的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of transformated BmN cells.M:DNA marker; 1: detection of IE-hGM-CSF from the genome of transformated cells; 2: detection of hGM-CSF from the genome of transformated cells; 3,4: detection of hGM-CSF and IE-hGM-CSF from the genome of normal cells.

圖4 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blotting analysis of transformed cells.M: protein marker; 1,2: SDS-PAGE detection of normal BmN cells and transformed cells respectively; 3,4:Western blotting detection of nomal BmN cells and transformated cells, respectively; the concentrations of the stacking gel and the separating gel were 5% and 15%,respectively; the primary antibody was rabbit anti-hGM-CSF and the secondary antibody was HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG.

圖5 ELISA檢測hGM-CSF標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Calibration curve of hGM-CSF tested by ELISA.

3 討論

利用轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞表達(dá)外源基因雖然沒有BEVS的表達(dá)水平高[2]，但是轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有它自身的優(yōu)勢。例如，BEVS系統(tǒng)中外源基因的表達(dá)多數(shù)在病毒感染細(xì)胞的晚期，這時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)異常，往往致使表達(dá)產(chǎn)物不能得到有效的翻譯后加工，從而導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的活性不高[15]。而通過昆蟲轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)，整個(gè)過程沒有病毒DNA的污染和病毒蛋白的表達(dá)，得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，并且整個(gè)表達(dá)過程都是在細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下進(jìn)行的，這樣不僅使得產(chǎn)物的安全性大大提高，而且還可以使產(chǎn)物得到更加有效的加工，提高了產(chǎn)物的活性，如果借助無血清細(xì)胞培養(yǎng)和分泌表達(dá)技術(shù)，表達(dá)產(chǎn)物極易純化，并且可以滿足工業(yè)上的大規(guī)模培養(yǎng)要求。

目前轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞載體多是轉(zhuǎn)座子載體和非轉(zhuǎn)座子載體，其中包含有P轉(zhuǎn)座子、mariner轉(zhuǎn)座子、piggyBac等轉(zhuǎn)座子，其中在昆蟲個(gè)體及昆蟲細(xì)胞中piggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用較為成熟。piggybac屬于Ⅱ類可移動(dòng)元件，首次從粉紋夜蛾Trichoplusia niTN-368細(xì)胞系中分離[16]，它已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因家蠶研究。李曦等[17]構(gòu)建了pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA–fib-L-intron1，然后轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞，并通過G418篩選獲得了穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)化BmN細(xì)胞系，不過外源基因表達(dá)水平不高；趙越等[8]構(gòu)建了基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的載體，成功獲得轉(zhuǎn)基因家蠶并表達(dá)外源基因人胰島素樣生長因子(hIGF-Ⅰ)；薛仁宇等[18]同樣構(gòu)建了piggyBac轉(zhuǎn)座子的載體，包含有新霉素抗性基因(neo)、gfp、hIGF-Ⅰ。

pIZT/V5-His是Invitrogen公司開發(fā)的一種能在昆蟲Sf9細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)外源基因的非轉(zhuǎn)座子載體，該載體利用黃杉毒蛾核型多角體病毒(Orgyia pseudotsugatanucleopolyhedrovirus，OpNPV)的ie-1和ie-2啟動(dòng)子分別控制Zeocin-GFP的融合表達(dá)與外源基因的表達(dá)，當(dāng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過一定濃度的博萊霉素篩選可獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞系。目前該載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種外源基因的表達(dá)，Wang等[10]將鱟屬的 C因子的基因克隆至載體pIZT/V5-His然后轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了該基因的穩(wěn)定表達(dá)；孫延波等[11]構(gòu)建重組載體pIZT/V5-His-mlL-4，轉(zhuǎn)染 Sf9細(xì)胞，獲得了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系；韓鳳麗等[19]把對蝦的酚氧化酶原基因克隆進(jìn)入載體 pIZT/V5-His，然后誘導(dǎo)大腸桿菌BL21，使得酚氧化酶原基因成功表達(dá)。由此可以看出該載體可以在多種不同種類細(xì)胞中表達(dá)不同種類的蛋白。本研究中，hGM-CSF在BmN細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)表明OpNPV的ie-1啟動(dòng)子在家蠶BmN細(xì)胞中也具有活性，pIZT/V5-His可以用于在家蠶BmN細(xì)胞中表達(dá)外源基因，進(jìn)一步可以推測該載體也有可能用于昆蟲種系轉(zhuǎn)化研究。

該載體轉(zhuǎn)染時(shí)與piggybac不同，轉(zhuǎn)化過程不需要輔助質(zhì)粒，直接將重組的載體加脂質(zhì)體配成轉(zhuǎn)染液即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且隨機(jī)插入宿主基因組，轉(zhuǎn)染效率高，24 h之內(nèi)即可看到綠色熒光細(xì)胞。Piggybac轉(zhuǎn)座子一般在宿主基因組的TTAA處插入[13,18,20-22]，迄今為止還沒有關(guān)于載體 pIZT/V5-His插入具有偏愛性的報(bào)道，該方面還需要進(jìn)一步研究。從轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光觀察結(jié)果顯示，不同轉(zhuǎn)化細(xì)胞所表現(xiàn)的綠色熒光強(qiáng)度存在明顯差異，這可能是gfp表達(dá)元件在不同細(xì)胞中的拷貝數(shù)不同或由于整合在細(xì)胞基因組的位置不同從而表達(dá)水平不同。由此可以推測，通過對外源DNA插入?yún)^(qū)域的基因序列分析，有可能會(huì)獲得新的增強(qiáng)子或者沉默子。

BmN細(xì)胞大約 3 d傳代 1次。本研究用質(zhì)粒pIZT-IE-hGM-CSF轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，24 h后可觀察到一小部分綠色熒光細(xì)胞，隨著使用Zeocin抗生素的篩選，熒光細(xì)胞比例逐漸增加，從圖2可看出，到1個(gè)月時(shí)熒光細(xì)胞可達(dá) 70%以上，我們在該基礎(chǔ)上繼續(xù)篩選至 2個(gè)月，綠色熒光細(xì)胞可以維持該比例穩(wěn)定遺傳。gfp在細(xì)胞傳代大約10次后不但沒有減弱，而且可以比較穩(wěn)定地遺傳。由此可以初步表明外源基因不是游離的，而是成功整合進(jìn)了細(xì)胞的基因組內(nèi)。

從本研究的Western blotting結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在大約22 kDa處檢測到特異性條帶，而正常的BmN細(xì)胞樣品則沒有檢測到，條帶大小比大腸桿菌中表達(dá)的hGM-CSF的分子量(16.3 kDa)稍大，而與桿狀病毒介導(dǎo)的hGM-CSF在BmN中表達(dá)的分子量是一致的，這可能是hGM-CSF產(chǎn)物在家蠶細(xì)胞中經(jīng)過翻譯后修飾的結(jié)果。這些結(jié)果說明外源基因hGM-CSF在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中得到了成功表達(dá)，從而推測該載體也可用于轉(zhuǎn)基因家蠶的研究。通過本研究中SDS-PAGE及ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，hGM-CSF在BmN細(xì)胞中的表達(dá)水平很低，提高外源基因的表達(dá)水平仍是一個(gè)急需解決的問題。我們設(shè)想通過提高外源基因拷貝數(shù)，使用增強(qiáng)子增強(qiáng)外源基因的表達(dá)水平，篩選表達(dá)水平高的細(xì)胞克隆，并通過分泌表達(dá)等方法來提高外源基因的表達(dá)水平。

REFERENCES

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Expression of hGM-CSF in transformed silkworm BmN cells mediated by non-transposon vector

Huimei Chen, Guangli Cao, Renyu Xue, and Chengliang Gong
College of Pre-clinical Medical and Biological Science, Soochow University, Suzhou 215123, China

Received:January 5, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:National Key Basic Research Program of China(973 Program)(No.2005CB121000), Key Fostering Projec for Application Research of Soochow University(No.Q3134991).

Corresponding author:Chengliang Gong.Tel/Fax: +86-512-65880183; E-mail: gongcl@suda.edu.cn國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)(No.2005CB121000)，蘇州大學(xué)重大應(yīng)用研究培育項(xiàng)目(No.Q3134991)資助。