毛竹Mariner-like element自主轉(zhuǎn)座子的鑒定與生物信息學(xué)分析*

謝佳敏 周明兵

(浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

轉(zhuǎn)座子廣泛分布在生物基因組內(nèi)，是生物基因組成的重要部分，在有些植物中轉(zhuǎn)座子含量可以高達80%以上(Sergeevaetal.，2011)，如在小麥(Triticumaestivum)基因中轉(zhuǎn)座子含量為88%(Chouletetal.，2010)，在玉米(Zeamays)基因中轉(zhuǎn)座子含量為84%(Schnableetal.，2009)。轉(zhuǎn)座子在基因組內(nèi)的活動可以對生物基因組產(chǎn)生巨大的影響，主要表現(xiàn)為：轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活動造成基因插入突變，同時，轉(zhuǎn)座過程中也產(chǎn)生新基因，因此轉(zhuǎn)座子的活動被認(rèn)為是生物進化的重要動力之一(Kazazian，2004)。

根據(jù)轉(zhuǎn)座子在生物基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座模式的不同，將轉(zhuǎn)座子分為ClassⅠ和ClassⅡ 2類。ClassⅠ類轉(zhuǎn)座子又叫逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(RNA轉(zhuǎn)座子)，在生物體內(nèi)以RNA為中間體進行轉(zhuǎn)座，其轉(zhuǎn)座模式為“復(fù)制-黏貼”；ClassⅡ類轉(zhuǎn)座子又叫DNA轉(zhuǎn)座子，在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)座模式為“剪切-黏貼”。根據(jù)序列的相似性，DNA轉(zhuǎn)座子又可以分為12個不同的超級家族：Tc1/Mariner，hAT，Mutator，Merlin，Transib，P，Piggybac，PIF，CACTA，Crypton，Helitron以及Maverick(Wickeretal.，2007)。

DNA轉(zhuǎn)座子根據(jù)能否發(fā)生自主轉(zhuǎn)座又可分為自主轉(zhuǎn)座子和非自主轉(zhuǎn)座子。自主轉(zhuǎn)座子由于其結(jié)構(gòu)完整，具有編碼完整轉(zhuǎn)座酶的能力，所編碼的轉(zhuǎn)座酶可以促使自身發(fā)生轉(zhuǎn)座；而非自主轉(zhuǎn)座子與自主轉(zhuǎn)座子相比，其內(nèi)部的轉(zhuǎn)座酶編碼序列有所缺失，不能編碼轉(zhuǎn)座酶，必須依靠相應(yīng)的自主轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶作用才能轉(zhuǎn)座。非自主DNA轉(zhuǎn)座子既可以是自主DNA轉(zhuǎn)座子缺失部分序列所產(chǎn)生的衍生物，也可以是僅僅帶有與對應(yīng)自主DNA轉(zhuǎn)座子相似的末端倒置重復(fù)序列(Terminal Inverted Repeats，TIR)(Liuetal.，2009)。

Mariner-like elements (MLE)家族轉(zhuǎn)座子是DNA類轉(zhuǎn)座子Tc1/Mariner超級家族中的重要成員，最早是在研究毛里塔尼亞果蠅(Drosophilamauritiana)白眼基因的一個不穩(wěn)定突變時發(fā)現(xiàn)的(Haymeretal.，1986；Jacobsonetal.，1986)。完整的MLE轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)比較簡單，主要包括轉(zhuǎn)座子末端被轉(zhuǎn)座酶識別并結(jié)合的末端顛倒重復(fù)序列(TIRs)、中間編碼轉(zhuǎn)座酶開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)和轉(zhuǎn)座子插入靶基因組時存在的靶位點重復(fù)序列(target site duplications,TSDs)(Robertson，1993)。其中，TIR結(jié)構(gòu)是在基因組中，兩端前后倒置互補的重復(fù)DNA序列，TIR是轉(zhuǎn)座酶所識別及結(jié)合的區(qū)域。轉(zhuǎn)座酶的編碼區(qū)一般包含2個功能區(qū)域，HTH結(jié)構(gòu)域(螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋空間結(jié)構(gòu))與DDD(3個天冬氨酸組成的保守空間結(jié)構(gòu))功能結(jié)構(gòu)域，其中HTH結(jié)構(gòu)域的功能是識別和結(jié)合基因組中對應(yīng)的TIR結(jié)構(gòu)，DDD功能域是催化轉(zhuǎn)座的催化區(qū)域，具有剪切轉(zhuǎn)座子并整合入基因組的功能。

MLE轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)簡單，在轉(zhuǎn)座酶的催化作用下，含有其結(jié)合序列的TIR結(jié)構(gòu)就有概率發(fā)生轉(zhuǎn)座(Lampeetal.，1996)。利用MLE轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座必需元件和轉(zhuǎn)座酶可以分離的特征，可以構(gòu)建二元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，該轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有高載量、高轉(zhuǎn)座效率、高安全性等突出優(yōu)點，可將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、基因功能研究、基因治療等領(lǐng)域。如在鮭魚(Oncorhynchusketa)中發(fā)現(xiàn)的Sleeping Beauty，在經(jīng)過人工改造后，構(gòu)建成為具有高活性的轉(zhuǎn)座子(Izsvaketal.，2000；Ivicsetal.，2006)，它能在大多數(shù)脊椎動物細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)座(Liuetal.，2006)，還可使所攜帶的基因在動物體內(nèi)實現(xiàn)穩(wěn)定整合和長期表達(Horieetal.，2003)。同時利用該轉(zhuǎn)座子的定向點特異性修復(fù)能力與干細(xì)胞的多向分化性相結(jié)合，就可通過基因修復(fù)來治療多種疾病，且無需進行體外細(xì)胞培養(yǎng)(Vandendriesscheetal.，2009；Dupuyetal.，2002)，是目前利用最廣泛的轉(zhuǎn)座子基因工具。

毛竹(Phyllostachysedulis)占我國竹類種植面積的近74%，約有627.7萬hm2，是非木材產(chǎn)品中最豐富的自然資源(Jiangetal.，2007)。最新的毛竹基因組測序結(jié)果表明，毛竹基因組中轉(zhuǎn)座子含量高達63.24%(Zhaoetal.，2018)。本課題組從毛竹基因組中克隆得到2個MLE轉(zhuǎn)座子并成功構(gòu)建了2個MLE轉(zhuǎn)座子的體外表達體系(Zhouetal.，2015；2016；2017)。本研究利用最新的毛竹基因組數(shù)據(jù)系統(tǒng)地鑒定了毛竹基因組中MLE自主轉(zhuǎn)座子，及對應(yīng)非自主轉(zhuǎn)座子，并分析它們的進化模式，研究結(jié)果有助于毛竹的基因組進化研究與新的植物轉(zhuǎn)座子工具開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 毛竹MLE轉(zhuǎn)座子完整序列的鑒定 下載最新版的毛竹全基因組序列文件(http:∥bamboo.bamboogdb.org)，使用IRF307(Warburton，2004)，對毛竹基因組中的TIR結(jié)構(gòu)進行篩選，參數(shù)設(shè)置為TIR序列長度大于20且小于100，兩側(cè)TIR序列的相似度在80%以上。

根據(jù)兩端TIR序列坐標(biāo)，提取坐標(biāo)間包括TIR的完整DNA序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)布的植物中完整MLE轉(zhuǎn)座酶序列，使用Fasta36軟件構(gòu)建本地MLE蛋白數(shù)據(jù)庫，使用Fasty36功能，將提取的核酸序列進行翻譯，將e值小于-10、閱讀框連續(xù)且具有正常的起始密碼子和終止密碼子的序列視為MLE自主轉(zhuǎn)座子。使用DNAMan分析獲得的完整MLE自主轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶ORF，使用在線工具HELIX-TURN-HELIX MOTIF PREDICTION(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr)進行HTH結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，使用在線工具Swiss model對轉(zhuǎn)座酶的三級結(jié)構(gòu)進行分析，確定其DDD結(jié)構(gòu)域。

1.2 完整MLE轉(zhuǎn)座子的活性分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫下載水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)和毛竹中已報道的、具有轉(zhuǎn)座活性的MLE轉(zhuǎn)座酶(Yangetal.，2014；2006；Jarviketal.，1998；Zhouetal.，2015)。使用Mafft軟件將本次篩選獲得的毛竹MLE自主轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶與下載的活性MLE轉(zhuǎn)座酶進行比對(Feschotteetal.，2003)，驗證所獲得的毛竹MLE自主轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶功能區(qū)域，預(yù)測所得到的MLE轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶是否具有潛在的轉(zhuǎn)座活性。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載已經(jīng)發(fā)表的部分動植物及微生物中的活性MLE轉(zhuǎn)座酶完整序列，將本研究得到的毛竹完整MLE轉(zhuǎn)座酶進行比對構(gòu)建進化樹，分析其在生物中的進化關(guān)系。

1.3 非自主轉(zhuǎn)座子鑒定 將上述鑒定MLE自主轉(zhuǎn)座子的TIR序列與IRF307軟件獲得的TIR序列(含有TIR的序列)數(shù)據(jù)庫進行本地Blast，獲得了高度相似性的TIR序列，提取與MLE自主轉(zhuǎn)座子TIR一致的TIR序列。將提取的序列與MLE自主轉(zhuǎn)座子序列通過在線BlastN進行兩兩比對(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，得到MLE自主轉(zhuǎn)座子與TIR序列內(nèi)部序列一致的TIR序列，視為MLE自主轉(zhuǎn)座子對應(yīng)的非自主轉(zhuǎn)座子。

使用Mafft軟件將獲得的MLE非自主轉(zhuǎn)座子與其對應(yīng)的MLE自主轉(zhuǎn)座子進行比對，分析MLE非自主轉(zhuǎn)座子與自主轉(zhuǎn)座子各部分缺失的情況。

1.4 插入偏好性規(guī)律 根據(jù)MLE自主轉(zhuǎn)座子與非自主轉(zhuǎn)座子的坐標(biāo)，在毛竹全基因組中，提取MLE自主轉(zhuǎn)座子與非自主轉(zhuǎn)座子側(cè)翼25 bp序列，使用TBTools工具的SequenceLogo進行比對和可視化展示(Chenetal.，2020)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個潛在 Mariner-like自主轉(zhuǎn)座子的鑒定 通過IRF307軟件在新版毛竹基因組中共找到了310 845條含有TIR的序列，利用Fasta軟件構(gòu)建的植物MLE轉(zhuǎn)座酶本地數(shù)據(jù)庫，經(jīng)Fasty36進行篩選，獲得了301個含有TIR結(jié)構(gòu)且擁有完整或部分編碼轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)的序列(e值小于5)。篩選得到了2個擁有完整MLE轉(zhuǎn)座酶功能域的MLE轉(zhuǎn)座子，命名為PhV2MLE1A和PhV2MLE2A。PhV2MLE1A全長3 950 bp，TIR長30 bp(5′TIR：CTCCCTCCGTCCCAGTATATAGGGCGTATA；3′TIR：TATATGCCCTATATACTGGGACGGAGGGAG)，閱讀框編碼414個氨基酸(圖1A)；PhV2MLE2A全長12 990 bp，TIR長49 bp(5′TIR：CGACTATGAGG TAGTCGTAGCAAGACTTACGACTATGGGATAGTCGT AG；3′TIR：CTACAACTATATTACAGTCGTAAGATC TCCTACGACTATATTACGGTCG)，閱讀框編碼372個氨基酸(圖1B)。

通過在線工具HELIX-TURN-HELIX MOTIF PREDICTION和Swiss model，將PhV2MLE1A和PhV2MLE2A編碼的轉(zhuǎn)座酶進行結(jié)構(gòu)域的在線預(yù)測，圖1A和圖1B中分別為PhV2MLE1A和PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座酶閱讀框翻譯序列，下劃線依次為預(yù)測得到的HTH結(jié)構(gòu)域和DDD結(jié)構(gòu)域。

圖1 PhV2MLE1A和PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座酶ORF翻譯Fig.1 ORF translation of PhV2MLE1A and PhV2MLE2A transposaseA：PhV2MLE1A轉(zhuǎn)座酶ORF翻譯圖；B：PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座酶ORF翻譯圖。下劃線依次為預(yù)測得到的HTH結(jié)構(gòu)域和DDD結(jié)構(gòu)域。A:ORF translation diagram of PhV2MLE1A transposase;B:ORF translation diagram of PhV2MLE2A transposase.The underline is the predicted HTH domain and DDD domain in sequence.

2.2PhV2MLE1A和PhV2MLE2A具有轉(zhuǎn)座活性 將PhV2MLE1A和PhV2MLE2A的轉(zhuǎn)座酶，與已報道的水稻中的活性MLE轉(zhuǎn)座子Osmar1，Osmar5，Osmar9，Osmar10，Osmar14，Osmar17，Osmar19的轉(zhuǎn)座酶(Osmar5是目前水稻中發(fā)現(xiàn)的唯一擁有天然活性的MLE轉(zhuǎn)座子)，大豆中的活性MLE轉(zhuǎn)座子Soymar1的轉(zhuǎn)座酶，毛竹中的完整活性MLE轉(zhuǎn)座子Phmar1，Phmar2的轉(zhuǎn)座酶，進行比對(圖2)。PhV2MLE1A和PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座酶的HTH結(jié)構(gòu)域和DDD結(jié)構(gòu)域與已報道的活性轉(zhuǎn)座酶的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域高度同源(圖2)，其中，一些在關(guān)鍵位點上的氨基酸完全一致，如在結(jié)合區(qū)域HTH結(jié)構(gòu)的R、T，DDD結(jié)構(gòu)域的DEKWF、QQDNA、PNSPD，這些關(guān)鍵位點的氨基酸決定了轉(zhuǎn)座酶的功能。PhV2MLE1A和PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座子的TIR結(jié)構(gòu)完全符合已報道的活性MLE轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)特征。

圖2 PhV2MLE1A和PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座酶與水稻、毛竹及大豆中完整MLE轉(zhuǎn)座酶的比對Fig.2 Comparison of PhV2MLE1A and PhV2MLE2A transposase with complete MLE transposase in rice,Moso bamboo and soybeanOs:水稻;Soy:大豆;Ph:毛竹。細(xì)框內(nèi)為HTH結(jié)合域，粗框內(nèi)為催化域DDD結(jié)構(gòu)。Os:Oryza sativa;Soy:Glycine max;Ph:Phyllostachys edulis.The HTH binding domain is in the thin frame,and the catalytic domain DDD structure is in the thick frame.

同時發(fā)現(xiàn)，所篩選得到的PhV2MLE1A轉(zhuǎn)座子與已發(fā)表的Phmar2轉(zhuǎn)座子相似性極高，認(rèn)為是同一個MLE轉(zhuǎn)座子；PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座子為全新發(fā)現(xiàn)的一個毛竹MLE轉(zhuǎn)座子。

圖3中轉(zhuǎn)座酶的進化關(guān)系共分為A和B 2個大類。本次篩選獲得的2個完整MLE轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶處在A類，與水稻、大豆等植物中的MLE轉(zhuǎn)座酶十分接近，B類中主要為微生物、昆蟲以及人類中的MLE轉(zhuǎn)座酶。

圖3 PhV2MLE1A和PhV2MLE2A的進化關(guān)系Fig.3 The evolutionary relationship of PhV2MLE1A and PhV2MLE2APh：毛竹；Os：水稻；Soy：大豆；Bm：野桑蠶；Hi：草蛉；Hs：人；Mbou：螞蟻；Am：蜜蜂；Fa：地蜈蚣；Mos：家蠅。Ph:Phyllostachys edulis;Os:Oryza sativa;Soy:Glycine max;Bm:Bombyx mandarina;Hi:Chrysopinae;Hs:Homo sapiens;Mbou:Messor bouvieri;Am:Apis mellifera;Fa:Forficula auricularia;Mos:Musca domestica.

2.3 非自主MLE轉(zhuǎn)座子的鑒定 將PhV2MLE1A和PhV2MLE2A的TIR序列與通過IRF307軟件獲得的毛竹TIR序列數(shù)據(jù)庫，進行本地Blast，獲得了高度相似性的TIR序列，提取對應(yīng)的非自主轉(zhuǎn)座子序列，將對應(yīng)非自主轉(zhuǎn)座子序列與完整的MLE自主轉(zhuǎn)座子序列使用BlastN進行兩兩比對之后，PhV2MLE1A共篩選得到4條結(jié)構(gòu)一致的對應(yīng)非自主轉(zhuǎn)座子(PhV2MLE1NA1，PhV2MLE1NA2，PhV2MLE1NA3和PhV2MLE1NA4)。PhV2MLE2A共篩選得到4條結(jié)構(gòu)一致的對應(yīng)非自主轉(zhuǎn)座子(PhV2MLE2NA1，PhV2MLE2NA2，PhV2MLE2NA3和PhV2MLE2NA4)。圖4為PhV2MLE1A(A)和PhV2MLE2A(B)轉(zhuǎn)座子與對應(yīng)的非自主轉(zhuǎn)座子兩側(cè)TIR結(jié)構(gòu)比對情況。

圖4 PhV2MLE1A(A)和PhV2MLE2A(B)及其非自主轉(zhuǎn)座子的TIR結(jié)構(gòu)Fig.4 TIR structure of PhV2MLE1A(A)and PhV2MLE2A(B)and their non-autonomous transposons

將完整MLE轉(zhuǎn)座子根據(jù)編碼區(qū)域及轉(zhuǎn)座酶的功能分為9個部分：TIR，TIR-M，M-HTH，HTH，HTH-DDD，DDD，DDD-T，T-TIR，TIR(分別為5′TIR結(jié)構(gòu)，5′TIR結(jié)構(gòu)至轉(zhuǎn)座酶起始密碼子M，起始密碼子M至HTH結(jié)構(gòu)區(qū)域，HTH轉(zhuǎn)座酶結(jié)合域，HTH結(jié)合域至DDD功能域的連接區(qū)域，DDD結(jié)構(gòu)功能域，DDD功能域至終止密碼子T，終止密碼子T至3′TIR結(jié)構(gòu))。將2個完整MLE轉(zhuǎn)座子及其非自主轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)比對后，對MLE非自主轉(zhuǎn)座子與其自主轉(zhuǎn)座子的各個區(qū)域的序列分布的情況進行統(tǒng)計(圖5)。發(fā)現(xiàn)除TIR結(jié)構(gòu)依舊完整之外，與完整MLE轉(zhuǎn)座子相比較，其他非自主轉(zhuǎn)座子各個部分DNA序列缺失嚴(yán)重，且缺失情況并不存在規(guī)律。PhV2MLE1NA1和PhV2MLE2NA1保留了大部分HTH和DDD結(jié)構(gòu)域，PhV2MLE1NA2、PhV2MLE1NA3、PhV2MLE1NA4的轉(zhuǎn)座酶缺失比較嚴(yán)重，PhV2MLE2NA2、PhV2MLE2NA3保留了TIR序列及側(cè)翼序列，而PhV2MLE2NA4只具備完整的TIR序列。

圖5 PhV2MLE1A(A)和PhV2MLE2A(B)及其非自主轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)缺失情況Fig.5 PhV2MLE1A (A)and PhV2MLE2A (B)and their non-autonomous transposons structure deletion

2.4 轉(zhuǎn)座子插入偏好性規(guī)律 對鑒定到的2個MLE自主轉(zhuǎn)座子及其對應(yīng)的非自主轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼20 bp序列進行比對分析(圖6)，PhV2MLE1A和PhV2MLE2A以及它們的非自主轉(zhuǎn)座子插入位點上下游均為2 bp的TA，MLE轉(zhuǎn)座子在插入基因組的過程中存在著明顯的插入偏好性。

圖6 PhV2MLE1A及其非自主轉(zhuǎn)座子(A)和PhV2MLE2A及其非自主轉(zhuǎn)座子(B)兩側(cè)側(cè)翼序列富集分析Fig.6 Sequence enrichment analysis on flanking of PhV2MLE1A and its non-antonomous transposon (A)and PhV2MLE2A and its non-antonomous transposon (B)

3 討論

本次研究從MLE轉(zhuǎn)座子具有特征性的TIR序列入手，首先對新版毛竹全基因組中全部含有TIR結(jié)構(gòu)的序列進行了發(fā)掘，再分析具有MLE轉(zhuǎn)座酶的MLE轉(zhuǎn)座子序列，全面鑒定了毛竹MLE自主轉(zhuǎn)座子，也對相應(yīng)的MLE非自主轉(zhuǎn)座子進行了鑒定和分析。

MLE轉(zhuǎn)座子在進化過程中以垂直傳遞為主，也可通過橫向傳遞的方式侵入其他物種基因組中，頻繁轉(zhuǎn)座，大量擴增自身的拷貝數(shù)，從而在宿主基因組長期進化中保留下來(Miskeyetal.，2005；Lampeetal.，2001；Hartletal.，1997)。一個轉(zhuǎn)座子從侵入宿主基因組到在宿主基因組穩(wěn)定下來一般要經(jīng)歷5個階段：1)外源轉(zhuǎn)座子的侵入；2)高頻轉(zhuǎn)座以擴增拷貝數(shù)；3)通過物種雜交在群體里廣泛擴散；4)大量轉(zhuǎn)座子積累點突變和插入/缺失突變喪失活性；5)通過轉(zhuǎn)座子的隨機丟失，宿主基因組和轉(zhuǎn)座子達到生態(tài)平衡。處在第2)階段的MLE轉(zhuǎn)座子活性最強，目前在基因組鑒定的MLE轉(zhuǎn)座子大部分處在4)或5)階段，積累了或多或少的突變，部分或全部喪失了轉(zhuǎn)座能力，成為低活性或非活性的轉(zhuǎn)座子“化石”。本研究從新版毛竹基因組中共找到了310 845個TIR結(jié)構(gòu)，在這些TIR結(jié)構(gòu)中找到了301個可編碼完整或者部分MLE轉(zhuǎn)座酶的DNA序列(e值小于-5)，但是只有2個可被鑒定為潛在自主轉(zhuǎn)座子。說明在毛竹的基因組中分布著大量的MLE轉(zhuǎn)座子，在毛竹進化過程中，絕大多數(shù)的MLE轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)發(fā)生了缺失，這可能是毛竹進化過程中對于轉(zhuǎn)座子活動的一種調(diào)控，通過對MLE轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)進行了干預(yù)，使其MLE轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)缺失，從而喪失轉(zhuǎn)座能力(Mtésetal.，2009)。

本次共找到2條結(jié)構(gòu)完整的MLE轉(zhuǎn)座子PhV2MLE1A和PhV2MLE2A，將它們的轉(zhuǎn)座酶與水稻、大豆以及毛竹中已經(jīng)報道的MLE轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶比對，發(fā)現(xiàn)PhV2MLE1A和PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座酶具有完整的功能結(jié)構(gòu)。通過與動植物中的MLE轉(zhuǎn)座酶比對構(gòu)建進化關(guān)系，PhV2MLE1A和PhV2MLE2A轉(zhuǎn)座酶與同屬禾本科(Gramineae)的水稻中的MLE轉(zhuǎn)座酶相似性非常高，而這些轉(zhuǎn)座酶已經(jīng)被確定具有轉(zhuǎn)座活性。PhV2MLE1A轉(zhuǎn)座子(Phmar2)已經(jīng)證明具有轉(zhuǎn)座活性，因此PhV2MLE2A很可能也具有自主轉(zhuǎn)座活性，是下一步重點研究對象。Zhou等(2015)報道的另一個毛竹Phmar1轉(zhuǎn)座子在本次篩選中沒有發(fā)現(xiàn)，可能原因是本研究毛竹全基因組測序中所選取的毛竹樣品與Zhou等(2015)克隆轉(zhuǎn)座子所用毛竹植株存在差異，在不同毛竹個體中MLE轉(zhuǎn)座子的活動及分布狀態(tài)有較大差異。

將結(jié)構(gòu)完整轉(zhuǎn)座子PhV2MLE1A和PhV2MLE2A序列與其非自主轉(zhuǎn)座子進行比對后發(fā)現(xiàn)，非自主轉(zhuǎn)座子的缺失情況并不存在規(guī)律，轉(zhuǎn)座子內(nèi)部的編碼區(qū)與非編碼區(qū)都存在著序列缺失的情況。這些在進化過程中喪失自主轉(zhuǎn)座能力的MLE轉(zhuǎn)座子，當(dāng)其對應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶表達時，可以借助轉(zhuǎn)座酶的催化作用發(fā)生轉(zhuǎn)座，此特性已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和酵母(Saccharomycescerevisiae)等模式生物中驗證(Zhouetal.，2016)。

通過對2個MLE自主轉(zhuǎn)座子PhV2MLE1A和PhV2MLE2A，及其對應(yīng)非自主轉(zhuǎn)座子插入位置側(cè)翼DNA序列比對發(fā)現(xiàn)，MLE轉(zhuǎn)座子插入位點兩側(cè)都是2 bp的TA，說明MLE轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座過程中存在著明顯的特異性，插入位點選擇有偏好TA的現(xiàn)象(Feschotteetal.，2005)。

4 結(jié)論

毛竹基因組資源豐富，是很好的植物基因庫。而轉(zhuǎn)座子活動是生物進化的重要動力，毛竹基因組中MLE轉(zhuǎn)座子的分布情況，對研究毛竹基因組的構(gòu)成與進化有著重要的意義。本研究從毛竹基因組中篩選得到的MLE自主轉(zhuǎn)座子PhV2MLE1A和PhV2MLE2A，擁有高度保守的TIR結(jié)構(gòu)與完整的編碼轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)，可以為基因標(biāo)簽的開發(fā)提供新的選擇。另一方面，從自主轉(zhuǎn)座子與非自主轉(zhuǎn)座子角度出發(fā)，研究了MLE轉(zhuǎn)座子在基因組中的分布與缺失特點，MLE轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組中的分布與缺失情況并無明顯規(guī)律，探究MLE轉(zhuǎn)座子的活動規(guī)律有助于揭示MLE轉(zhuǎn)座子在毛竹進化過程中的演變規(guī)律。