抗壞血酸、表皮生長(zhǎng)因子和促卵泡素對(duì)綿羊卵巢皮質(zhì)體外培養(yǎng)的影響

彭夏雨，汪立芹，楊梅，陳童，郭志勤

1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000 2 新疆畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000 3 大連市金州區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生防疫監(jiān)督管理局，大連 116037

抗壞血酸、表皮生長(zhǎng)因子和促卵泡素對(duì)綿羊卵巢皮質(zhì)體外培養(yǎng)的影響

彭夏雨1,2，汪立芹2，楊梅3，陳童2，郭志勤2

1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000 2 新疆畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000 3 大連市金州區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生防疫監(jiān)督管理局，大連 116037

本研究旨在評(píng)估抗壞血酸(VC)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、促卵泡素(FSH)對(duì)綿羊原始卵泡體外培養(yǎng)的影響以及它們之間的相互關(guān)系。實(shí)驗(yàn)按照 2×2×2因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為 8組，分別為：MEM(對(duì)照組)，MEM+VC(50 μg/mL)，MEM+EGF(100 ng/mL)，MEM+FSH(50 ng/mL)，MEM+VC+EGF，MEM+VC+FSH，MEM+EGF+FSH，MEM+VC+EGF+FSH。在培養(yǎng)0(未培養(yǎng)對(duì)照組)、2、6、12 d后，對(duì)培養(yǎng)的卵巢皮質(zhì)薄片進(jìn)行組織學(xué)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)檢測(cè)以及透射電鏡(TEM)觀察。結(jié)果表明，與未培養(yǎng)組(發(fā)育卵泡比例 15.4%±1.9%，正常卵泡比例 88.2%±4.6%)比較，所有培養(yǎng)組中發(fā)育卵泡比例顯著增加(P＜0.05)，正常卵泡比例下降(P＜0.05)。培養(yǎng)12 d后，與對(duì)照組(卵泡直徑(34.5±3.3)μm，卵泡存活比例(38.9%±3.9%))比較，MEM+VC+FSH 和 MEM+EGF+FSH 組中卵泡直徑(分別為(39.7±3.4)μm 和(42.5±5.1)μm)和卵泡存活比例(分別為 58.5%±4.3%和 59.3%±3.7%)都顯著提高(P＜0.05)；各處理組中，培養(yǎng)12 d后，MEM+VC+EGF組中發(fā)育卵泡比例(49.3%±3.2%)和卵泡直徑((32.3±2.3)μm)最低，顆粒細(xì)胞PCNA陽(yáng)性卵泡比例(26.4%±1.2%)也最少，而MEM+VC+EGF+FSH組中卵泡存活率(59.7%±6.1%)和卵泡直徑((42.5±5.1)μm)都顯著增加(P＜0.05)，顆粒細(xì)胞 PCNA(43.5%±4.1%，P＜0.05)表達(dá)增加。電鏡結(jié)果表明，VC+EGF+FSH組能夠維持與正常卵泡類似的超微結(jié)構(gòu)，而在MEM 和MEM+VC+EGF組卻顯示不同程度的退化特征。本研究結(jié)果提示在培養(yǎng)中聯(lián)合添加VC與EGF抑制卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)，而聯(lián)合添加VC、EGF和FSH可能是促進(jìn)綿羊原始卵泡體外激活和生長(zhǎng)，維持卵泡存活以及結(jié)構(gòu)完整的最有效的處理手段之一。

綿羊，原始卵泡培養(yǎng)，抗壞血酸，促卵泡素，表皮生長(zhǎng)因子

Abstract:In this study, we evaluated the effects of ascorbic acid(VC), epidermal growth factor(EGF)and follicle stimulating hormone(FSH)onin vitroculture of sheep ovarian cortical tissue.Using 2×2×2 factor experimental design, we cultured sheep ovarian cortex fragments in 8 media with MEM(control), MEM+VC(50 μg/mL), MEM +EGF(100 ng/mL),MEM+FSH(50 ng/mL), MEM+VC+EGF, MEM+VC+FSH, MEM+EGF+FSH, MEM+VC+EGF+FSH.After 0(non-cultured control), 2, 6, 12 days of culture, the pieces of ovarian cortex were proceed to histological and proliferating cell nuclear antigen(PCNA)examination, or observed by transmission electron microscopy(TEM).The percentages of developing follicles were increased(P＜0.05)and the percentages of healthy follicles were reduced(P＜0.05).When compared to the MEM group, the addition of FSH with VC or EGF promoted a significant increase of follicles diameter and follicles survival rate(P＜0.05), and stimulated the proliferation of granulosa cells.After 12 days of culture, medium supplemented with MEM+VC+EGF resulted the lowest proportion of developing follicles(49.3%±3.2%), follicles diameter((32.3±2.3)μm), follicles survival rate(41.6%±3.1%)and the proportion of PCNA stained follicles(26.4%±1.2%,P＜0.05).In contrast, MEM+VC+EGF+FSH resulted the highest follicles diameter((42.5±5.1)μm), follicles survival rate(59.7%±6.1%)and proportion of PCNA stained follicles(43.5%±4.1%,P＜0.05).Ultrastructural analysis confirmed the integrity of follicles cultured in VC+EGF+FSH group, while follicles cultured in MEM+VC+EGF groups showed more degeneration characters.In conclusion, the addition of VC and EGF to culture medium inhibited follicular development, VC+EGF+FSH was the most effective treatment to maintain follicular integrity and promote sheep primordial follicular activation and growth during in vitro culture.

Keywords:sheep, ovarian tissue, ascorbic acid, follicle stimulating hormone, epidermal growth factor

哺乳動(dòng)物卵巢皮質(zhì)內(nèi)含有大量的原始卵泡，它們代表著雌性的繁殖潛力。而在生理?xiàng)l件下，這些卵泡只有少部分能被激活并發(fā)育至成熟排卵階段，其余在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)生閉鎖而退化[1]。研究原始卵泡在體外模式下的激活和發(fā)育可以為體外胚胎的生產(chǎn)提供大量潛在的同種卵母細(xì)胞來(lái)源，對(duì)于提高遺傳和經(jīng)濟(jì)價(jià)值動(dòng)物的繁殖潛力，以及瀕危物種的保存具有十分重要的意義。

促性腺激素和生長(zhǎng)因子在卵巢功能調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用。促卵泡素(FSH)是一種調(diào)節(jié)卵巢功能的關(guān)鍵激素，能夠刺激顆粒細(xì)胞增殖，內(nèi)固醇激素的合成以及EGF和LH受體的表達(dá)，在竇腔形成和卵泡成熟排卵過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[2]。在羊卵巢皮質(zhì)體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加FSH可以促進(jìn)卵泡和卵母細(xì)胞直徑的增長(zhǎng)[3]，維持卵泡超微結(jié)構(gòu)完整和促進(jìn)原始卵泡的激活和生長(zhǎng)[4]。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)也參與卵巢發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)，包括顆粒細(xì)胞增殖、分化和類固醇激素的生成[5]，其受體在人和倉(cāng)鼠的原始卵泡到初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中均有表達(dá)[6-8]，而在次級(jí)階段主要在顆粒細(xì)胞上表達(dá)，具有促進(jìn)初級(jí)卵泡向次級(jí)卵泡發(fā)育時(shí)顆粒細(xì)胞有絲分裂的作用[9-10]。最近研究表明，EGF能夠與FSH協(xié)同作用，促進(jìn)卵泡和卵母細(xì)胞直徑的增大，以及卵泡的發(fā)育[3,11]。抗壞血酸(VC)是一種抗氧化劑，在生理?xiàng)l件下行使多種細(xì)胞保護(hù)功能[12]。在卵巢的顆粒細(xì)胞、內(nèi)膜細(xì)胞、黃體細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均有蓄積，可以促進(jìn)卵泡發(fā)育進(jìn)程中膠原的合成，維持卵泡基底膜完整，參與類固醇激素的分泌[13]。卵泡體外培養(yǎng)中添加 VC可以降低卵泡細(xì)胞的凋亡[14-15]。最近Rossetto等報(bào)道VC可與FSH在體外培養(yǎng)中協(xié)同作用維持羊卵泡超微結(jié)構(gòu)完整和促進(jìn)原始卵泡的激活和生長(zhǎng)[2]。但是VC與EGF，以及VC、EGF與FSH是否能同樣促進(jìn)綿羊原始卵泡在體外的生長(zhǎng)和發(fā)育還未見報(bào)道。本研究的目的是通過(guò)在體外培養(yǎng)中單獨(dú)或聯(lián)合添加 VC、EGF和 FSH，研究它們?cè)诰d羊卵巢原始卵泡體外發(fā)育中的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 卵巢的采集與處理及試劑來(lái)源

成年綿羊卵巢組織取自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)(n=5)，采集的卵巢組織保存于 27℃～32℃添加有 100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的PBS緩沖液中，1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。去除卵巢附屬物如脂肪、筋膜等，經(jīng)洗滌后，從中間對(duì)分卵巢，在體視顯微鏡下分離皮質(zhì)和髓質(zhì)，去除可見大卵泡。把分離的皮質(zhì)切割成1～2 mm3大小，每個(gè)樣本隨即選取2～3塊組織用4%多聚甲醛-PBS液或2.5%戊二醛固定，作為新鮮組織未培養(yǎng)對(duì)照進(jìn)行組織學(xué)和電鏡觀察，其余組織進(jìn)入體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)中如無(wú)特殊標(biāo)注，所有化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 組織培養(yǎng)及分組

對(duì)照組培養(yǎng)基為MEM，添加 0.23 mmol/L丙酮酸鈉、2 mmol/L谷氨酰胺、2 mmol/L次黃嘌呤、3 mg/mL BSA、ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒：胰島素10 μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白 5 μg/mL，亞硒酸鈉 6.25 ng/mL)，100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。在對(duì)照組基礎(chǔ)上單獨(dú)或聯(lián)合添加 100 ng/mL EGF，50 ng/mL FSH，50 μg/mL抗壞血酸，分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為 MEM+VC、MEM+EGF、MEM+FSH、MEM+VC+EGF、MEM+VC+FSH、MEM+EGF+FSH、MEM+VC+EGF+FSH。

處理過(guò)的卵巢皮質(zhì)薄片隨機(jī)放入預(yù)先制好和消毒調(diào)平的金屬格柵培養(yǎng)體系中，此體系由不銹鋼網(wǎng)格支架(25 mm×25 mm×4 mm)和3 mg/mL膠原蛋白預(yù)涂層的微孔濾膜(孔徑 0.45 μm，Millipoll)以及35 mm培養(yǎng)皿組成。培養(yǎng)時(shí)組織塊置于微孔濾膜上，間隔5 mm，每個(gè)膜上放6塊；然后在培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液至與組織塊下端齊平，每個(gè)組織塊上滴50 μL培養(yǎng)液。放入5% CO2、38.6℃增濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天換液1次。在培養(yǎng)的第2、6、12天隨機(jī)取同等數(shù)量(n=2)的組織塊進(jìn)行固定，共培養(yǎng)12 d。所有試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 組織學(xué)檢查

培養(yǎng)前和培養(yǎng)2、6、12 d后的卵巢組織薄片用4%多聚甲醛-PBS液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，7 μm連續(xù)切片，HE染色后光鏡觀察、計(jì)數(shù)。卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[16]，分為原始卵泡(卵母細(xì)胞外包繞單層扁平狀顆粒細(xì)胞)和發(fā)育卵泡包括過(guò)渡卵泡(單層扁平和立方形顆粒細(xì)胞混雜的卵泡)，初級(jí)卵泡(1層立方形或柱狀顆粒細(xì)胞)，次級(jí)卵泡(2層以上立方形顆粒細(xì)胞)。形態(tài)正常卵泡具有完整的卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)固縮細(xì)胞核，異常卵泡卵母細(xì)胞皺褶或顆粒細(xì)胞分布雜亂與基底膜分離，核固縮。每個(gè)樣本切片中每10張計(jì)數(shù)一次，分別記錄各種卵泡數(shù)量，每個(gè)處理計(jì)數(shù) 150個(gè)卵泡(每次計(jì)數(shù)30個(gè)，作5次重復(fù))。用與Nikon光學(xué)顯微鏡配套的圖像處理軟件(Nikon DP2-BSW)測(cè)量正常卵泡直徑(卵母細(xì)胞兩端顆粒細(xì)胞膜之間最大距離，垂直交叉測(cè)量2次，平均值為所測(cè)卵泡直徑)。為避免重復(fù)計(jì)數(shù)，每次記錄由相鄰切片確定。

1.4 細(xì)胞增殖PCNA檢測(cè)

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟復(fù)水后，用0.1%檸檬酸抗體修復(fù)液進(jìn)行抗體熱修復(fù)，PBS清洗后，按照免疫組化染色試劑盒(中杉金橋，SP9002)說(shuō)明在每個(gè)樣本上滴50 μL 3%雙氧水室溫孵育8 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；PBS漂洗后，用正常羊血清封閉 10 min，滴加 1∶50稀釋的鼠抗羊單克隆PCNA抗體(武漢博士德)，4℃過(guò)夜；樣本常溫復(fù)溫后，用PBS漂洗3次，滴加生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG，室溫孵育12 min后用PBS洗3遍，每次3 min；然后再加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素室溫孵育15 min，PBS洗后DAB染色5～7 min(光鏡下觀察細(xì)胞核呈棕黃色時(shí)終止)，自來(lái)水沖洗，經(jīng)蘇木素復(fù)染后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。顆粒細(xì)胞棕黃判定為PCNA陽(yáng)性卵泡。

1.5 卵泡超微結(jié)構(gòu)的評(píng)估

綿羊卵巢組織小塊在 2%多聚甲醛+2.5%戊二醛的0.1 mol/L PBS緩沖液中固定3～4 h經(jīng)PBS洗后，在1%四氧化鋨溶液中固定1 h，PBS漂洗3次，梯度丙酮脫水后，用環(huán)氧樹脂浸透包埋，3 μm切片，甲苯胺藍(lán)染色光鏡下定位形態(tài)正常卵泡，經(jīng)檸檬酸三鈷和醋酸雙氧鈾電子染色后在透射電鏡(JEOL TEM-1230)下觀察卵泡超微結(jié)構(gòu)變化，如胞質(zhì)電子密度和完整性、顆粒細(xì)胞細(xì)胞器、空泡化、基底膜和核膜的完整性等。

1.6 數(shù)據(jù)分析

為了評(píng)估卵泡激活和生長(zhǎng)的情況，只有健康卵泡統(tǒng)計(jì)卵泡大小和比例。分別用發(fā)育卵泡比例，正常卵泡比例和卵泡直徑來(lái)評(píng)估各組中原始卵泡激活、存活和生長(zhǎng)情況。顆粒細(xì)胞的增殖活性通過(guò)統(tǒng)計(jì) PCNA陽(yáng)性數(shù)量來(lái)評(píng)定。除各處理組培養(yǎng)不同天數(shù)后組織中顆粒細(xì)胞 PCNA陽(yáng)性卵泡比例用χ2檢驗(yàn)比較外，其他各數(shù)據(jù)之間的比較均用方差分析和Fisher′s檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算。所有計(jì)算均用SPSS 13.0完成，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，P＜0.05標(biāo)記為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 組織分析結(jié)果

2.1.1 原始卵泡的激活和生長(zhǎng)

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在未培養(yǎng)組織中原始卵泡比例為 84.6%，發(fā)育卵泡的比例為 15.4%。各試驗(yàn)組培養(yǎng)不同天數(shù)后組織中發(fā)育卵泡比例如圖1所示。與未培養(yǎng)對(duì)照組比較，所有培養(yǎng)組中發(fā)育卵泡比例顯著增加(P＜0.05)。VC+EGF組除培養(yǎng)2 d后發(fā)育卵泡比例(45.1%)與 MEM 對(duì)照組(47.5%)之間差異不顯著外(P＞0.05)，在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)其發(fā)育卵泡比例均顯著低于 MEM對(duì)照組和其他試驗(yàn)組(P＜0.05)；其他試驗(yàn)組中發(fā)育卵泡比例與 MEM 對(duì)照組比較，差異不顯著(P＞0.05)。在 FSH和VC+EGF+FSH組培養(yǎng)2、6、12 d后，發(fā)育卵泡比例分別為 59.3%、66.4%、78.2%，55.7%、69.5%、81.0%，各天數(shù)之間比較，差異顯著(P＜0.05)；MEM組和EGF組培養(yǎng)6 d和12 d后發(fā)育卵泡比例分別為64.6%、69.2%、72.7%、77.5%，顯著高于培養(yǎng)2 d后發(fā)育卵泡比例(分別為47.5%、60.4%，P＜0.05)，而在6 d和12 d之間差異不顯著(P＞0.05)；在VC和VC+FSH以及EGF+FSH組內(nèi)培養(yǎng)12 d后發(fā)育卵泡比例分別為74.3%、77.0%、81.0%，顯著高于培養(yǎng)2 d后發(fā)育卵泡比例(分別為58.9%、60.1%、55.7%，P＜0.05)，其他天數(shù)之間差異不顯著；而在VC+EGF組內(nèi)在培養(yǎng)2、6、12 d后，發(fā)育卵泡比例分別為45.6%、41.6%、49.3%，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，卵泡發(fā)育變化不顯著(P＞0.05)。

2.1.2 卵泡活力的評(píng)估

新鮮組織和培養(yǎng)后組織中正常卵泡比例結(jié)果見圖2。形態(tài)正常卵泡(圖3A、3B)具有完整的卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)固縮細(xì)胞核，異常卵泡(圖3C)卵母細(xì)胞皺褶或顆粒細(xì)胞分布雜亂與基底膜分離，核固縮。與未培養(yǎng)對(duì)照組比較(88.2%)，只有VC+FSH組(81.9%)和VC+EGF+FSH(76.6%)在培養(yǎng)2 d后正常卵泡比例沒(méi)有顯著下降(P＞0.05)，其余試驗(yàn)組中正常卵泡比例均顯著下降(P＜0.05)。培養(yǎng)2 d后，各試驗(yàn)組與MEM對(duì)照組(71.8%)比較沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。培養(yǎng) 6 d后 VC、VC+FSH、EGF+FSH、VC+EGF+FSH組中正常卵泡比例分別為64.4%、67.1%、63.5%、65.2%，顯著高于 MEM 對(duì)照組 51.7%(P＜0.05)，而培養(yǎng) 12 d后，除 VC+EGF組(41.6%)外，其余試驗(yàn)組都顯著高于MEM對(duì)照組(38.9%)(P＜0.05)。在各處理組之間比較，培養(yǎng)12 d后，VC+EGF(41.6%)組顯著低于其他處理組(P＜0.05)。在同一試驗(yàn)組內(nèi)，與培養(yǎng)2 d后比較，培養(yǎng)6 d和12 d后所有培養(yǎng)組中正常卵泡比例顯著下降(P＜0.05)，其中MEM對(duì)照組(6 d：52.1%，12 d：38.9%)和 VC+EGF 組(6 d：59.3%，12 d：41.6%)在培養(yǎng)6 d和12 d之間差異顯著(P＜0.05)。

2.1.3 卵泡生長(zhǎng)

添加不同組分培養(yǎng)2、6、12 d后對(duì)卵泡直徑的影響見表1。與新鮮組織(30.8 μm)比較，培養(yǎng)2 d后各處理對(duì)卵泡直徑的增長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)；培養(yǎng) 6 d后，除 VC+EGF 組(30.5 μm，P＞0.05)和MEM組(31.3 μm，P＞0.05)外，其他組卵泡直徑都顯著的增加；培養(yǎng) 12 d后單獨(dú)添加 VC(34.2 μm，P＞0.05)或與 EGF 聯(lián)合添加(32.3 μm，P＞0.05)試驗(yàn)組以及 MEM 組(34.5 μm，P＞0.05)對(duì)卵泡直徑的增長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，而其他各組與未培養(yǎng)對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)。在各培養(yǎng)組之間比較，培養(yǎng)2 d后各組之間差異不顯著(P＞0.05)；培養(yǎng) 6 d后，在培養(yǎng)中單獨(dú)或聯(lián)合添加EGF與 FSH(EGF組：39.0 μm；FSH 組：38.3 μm；EGF+FSH 組：38.4 μm)時(shí)卵泡直徑顯著高于MEM對(duì)照組(33.1 μm)與 VC+EGF 組(31.2 μm，P＜0.05)。同時(shí) VC+EGF組只與 MEM 對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)，而顯著低于其他試驗(yàn)組(P＜0.05)；培養(yǎng)12 d后結(jié)果與培養(yǎng)6 d結(jié)果相似，但是單獨(dú)添加 VC組(34.2 μm)與 VC+EGF組(32.3 μm)之間差異不顯著(P＞0.05)，而顯著低于除FSH組(37.8 μm，P＞0.05)外的其他試驗(yàn)組(P＜0.05)。對(duì)同一培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)不同天數(shù)之間比較，VC+EGF組和MEM對(duì)照組在培養(yǎng)2 d、6 d和 12 d后卵泡直徑分別為 30.5 μm、31.2 μm、32.3 μm 和 31.3 μm、33.1 μm、34.5 μm，各天數(shù)之間差異均不顯著(P＞0.05)；單獨(dú)添加各種因子在培養(yǎng)6 d和12 d后與培養(yǎng)2 d比較，除VC在培養(yǎng)12 d 后(34.2 μm)與其他天數(shù)(2 d：31.7 μm；6 d：37.2 μm)比較不顯著外(P＞0.05)，其他處理中卵泡直徑都顯著增大(P＜0.05)；培養(yǎng) 12 d后EGF+FSH組卵泡直徑(44.0 μm)顯著高于培養(yǎng) 2 d和 6 d 后的卵泡直徑(分別為 34.2 μm、38.4 μm，P＜0.05)。VC+EGF+FSH 組(42.5 μm)培養(yǎng) 12 d 后顯著高于培養(yǎng)2 d后(33.3 μm，P＜0.05)直徑，但與培養(yǎng) 6 d之間差異不顯著(37.6 μm，P＞0.05)，VC+FSH組與此類似。

圖2 新鮮組織與培養(yǎng)2、6、12 d后組織正常卵泡比例Fig.2 Percentages of normal follicles in non-cultured tissue and after 2, 6, 12 days of culture in various treatments.*: different significantly from non-cultured tissue(P＜0.05); #: different significantly from MEM control alone in each day of culture(P＜0.05); a,b: different significantly between treatments at the same day of culture(P＜0.05); A, B, C: different significantly between days of culture in the same treatment(P＜0.05).

圖3 組織學(xué)觀察未培養(yǎng)組織中正常原始卵泡(A)、VC+EGF+FSH組培養(yǎng) 12 d后發(fā)育卵泡(B)和VC+EGF組培養(yǎng)12 d后異常卵泡(C)Fig.3 Histological section of normal primordial follicle in non-cultured tissue(A), and growing follicle cultured 12 days in VC+EGF+FSH group(B), or un-normal follicle cultured 12 days in VC+EGF group(C).

表 1 未培養(yǎng)組和各處理組培養(yǎng)不同天數(shù)后卵泡直徑的變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 1 Mean follicles diameter in non-cultured tissue and in tissue cultured for 2, 6 and 12 days in various treatments(±s)

表 1 未培養(yǎng)組和各處理組培養(yǎng)不同天數(shù)后卵泡直徑的變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 1 Mean follicles diameter in non-cultured tissue and in tissue cultured for 2, 6 and 12 days in various treatments(±s)

Notes: *: different significantly from non-cultured tissue(P＜0.05);a, b, c: different significantly between treatments at the same day of culture(P＜0.05); A, B, C: different significantly between days of culture in the same treatment(P＜0.05).

Mean follicle diameter in non-cultured tissue:(30.8±5.6)μm Treatments Day 2(μm) Day 6(μm) Day 12(μm)MEM 31.3±2.4 33.1±2.3ac 34.5±3.3acVC 31.7±3.6A 37.2±3.2*abB 34.2±2.5acABEGF 32.1±2.0A 39.0±3.8*bB 41.3±2.1*bBFSH 32.2±2.7A 38.3±3.2*bB 37.8±3.5*abBVC+EGF 30.5±2.6 31.2±2.2c 32.3±2.3cVC+FSH 33.7±3.1A 37.3±4.5*ABab 39.7±3.4*BbEGF+FSH 34.2±4.3A 38.4±4.1*Ab 44.0±3.3*BbVC+EGF+FSH 33.3±3.7A 37.6±3.5*ABab 42.5±5.1*Bb

2.2 PCNA檢測(cè)

表 2所示為添加不同因子在培養(yǎng)不同天數(shù)之后PCNA檢測(cè)的結(jié)果。顆粒細(xì)胞被染為棕黃色(圖4A)，判定為PCNA陽(yáng)性卵泡。由表中數(shù)據(jù)可知，與未培養(yǎng)組織(22.5%)比較，在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)VC+EGF+FSH組PCNA陽(yáng)性卵泡比例(培養(yǎng)2、6、12 d后比例分別為39.5%、44.7%、43.5%)都顯著增加(P＜0.05)，VC+FSH組在培養(yǎng)6 d(40.9%)以及EGF+FSH組培養(yǎng)12 d后(39.5%)PCNA陽(yáng)性卵泡比例也顯著增加(P＜0.05)，其他組效果不顯著(P＞0.05)；在各試驗(yàn)組內(nèi)比較，VC+EGF組中陽(yáng)性卵泡比例在培養(yǎng)12 d后(26.4%，P＜0.05)顯著低于 VC+EGF+FSH組(43.5%)和 EGF+FSH組(39.5%)。所有試驗(yàn)組與 MEM 對(duì)照組之間比較，PCNA陽(yáng)性率差異不顯著(P＞0.05)，此外培養(yǎng)天數(shù)對(duì)各組PCNA的表達(dá)也沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。

表2 各因子對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響Table 2 Percentages of follicles with PCNA positive granulose cells in tissue cultured for 2, 6 and 12 days in various treatments

圖4 PCNA陰性對(duì)照(A)與未培養(yǎng)組織(B)、VC+EGF(C)和VC+EGF+FSH(D)培養(yǎng)12 d后陽(yáng)性卵泡(箭頭所指為PCNA陽(yáng)性顆粒細(xì)胞)Fig.4 PCNA-negative control with granulose cells stained blue(A)and PCNA-positive follicle with granulose cells stained Brown(arrow)in non-cultured tissue(B)or tissue cultured for 12 days in VC+EGF(C)and VC+EGF+FSH(D)group.

2.3 超微結(jié)構(gòu)的觀察

為了進(jìn)一步探討VC與EGF以及FSH之間對(duì)卵泡發(fā)育的影響，根據(jù)組織學(xué)分析結(jié)果，對(duì)未培養(yǎng)組織(圖5A)和 MEM 組(圖5B)，VC+EGF 組(圖5C)以及VC+EGF+FSH組(圖5D)，培養(yǎng)12 d后組織中光鏡下顯示正常的卵泡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。結(jié)果顯示只有 VC+EGF+FSH組中卵泡超微結(jié)構(gòu)與未培養(yǎng)組織中卵泡結(jié)構(gòu)類似。這些卵泡具有完整的卵母細(xì)胞和核膜以及較大的卵核，圓形線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均勻分布在胞質(zhì)中，卵質(zhì)中異染色質(zhì)和空泡較少；顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整具有不規(guī)則的細(xì)胞核，占胞質(zhì)的很大一部分，細(xì)胞核長(zhǎng)而大，核內(nèi)染色質(zhì)松弛，外部表現(xiàn)輕度濃染，在顆粒細(xì)胞中觀察到的最多的細(xì)胞器為具有發(fā)育良好的圓形粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。而在VC+EGF組和MEM組中光鏡下形態(tài)正常的卵泡，經(jīng)TEM觀察顯示超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，一些表明卵泡退化的特征出現(xiàn)，這些卵泡表現(xiàn)為卵母細(xì)胞極度空泡化，這些空泡常常聚集成團(tuán)，形成很大的空白區(qū)域，細(xì)胞器隨機(jī)分布在胞質(zhì)中，密度低且大多數(shù)不可辨認(rèn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體膜和嵴被破壞，卵母細(xì)胞核畸形收縮，核膜呈波浪起伏，且異染色質(zhì)成團(tuán)出現(xiàn)，形成電子密度高的濃染區(qū)域，核仁松散呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；顆粒細(xì)胞腫脹，與基底膜及卵母細(xì)胞之間的間隙連接減少或消失。值得注意的是VC+EGF組中卵泡雖然表現(xiàn)退化特征，但顯示與MEM組不同的特征，即卵泡內(nèi)各種膜結(jié)構(gòu)并未顯示異常，顆粒細(xì)胞也未發(fā)現(xiàn)腫脹。

圖5 未培養(yǎng)組織(A)與 MEM(B)、VC+EGF(C)、VC+EGF+FSH(D)組培養(yǎng)12 d后卵泡超微結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Ultrastructural analysis of histology normal follicles from non-cultured tissue(A)and cultured for 12 days in MEM(B), VC+FSH(C)and VC+EGF+FSH(D)groups.NU-nucleus,O-oocyte, m-mitochondria, er-endoplasmic reticulum,GC-granulosa cells.(A)arrow: gap junction.(B)arrows from top to down: vacuolization oocyte and granulose cell; oocyte;oocyte nuclear with abnormity and irregular nuclear membrane,ramified oocyte nucleolus.(C)arrows from top to down: regular nuclear membrane, vacuolization oocyte, normal granulose cell.A, C, D: 6 500×, bar=2 μm; B: 3 000×, bar=5 μm.

3 討論

本研究中，VC與FSH聯(lián)合添加時(shí)不但促進(jìn)卵泡的存活，同時(shí)對(duì)卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)也具有促進(jìn)作用，提示VC與FSH是相互促進(jìn)的關(guān)系。VC是一種還原劑，在卵泡的發(fā)育過(guò)程中，參與膠原蛋白的合成，維持卵泡基底膜的完整，通過(guò)羥化作用參與內(nèi)固醇激素的分泌[15]。在牛[14]和鼠[15]上的研究表明VC可以降低體外培養(yǎng)中卵泡的凋亡。雖然很多研究表明原始卵泡的激活對(duì)FSH是非依賴性的[17-19]，但研究表明它可以通過(guò)作用于大卵泡和間質(zhì)細(xì)胞釋放旁分泌因子，間接參與早期卵泡發(fā)生[20]。2007年Matos等[4]報(bào)道FSH可以維持體外培養(yǎng)中山羊腔前卵泡形態(tài)完整，促進(jìn)原始卵泡激活和生長(zhǎng)。對(duì)于FSH與VC的關(guān)系，一方面研究表明FSH可以正向調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞對(duì) VC的吸收，同時(shí) VC也可以增加顆粒細(xì)胞上FSH受體的表達(dá)[21]，另一方面在Saraiva等[22]的研究中發(fā)現(xiàn) FSH與低濃度的 LH一起添加時(shí)，可以維持山羊卵泡的結(jié)構(gòu)完整，而 VC可以促進(jìn)LH的合成，這可能也表明FSH與VC之間可以借助第三者，影響卵泡發(fā)育。最近Rossetto等[12]報(bào)道在山羊卵巢體外培養(yǎng)中聯(lián)合添加VC和FSH可以促進(jìn)原始卵泡的激活和生長(zhǎng)，維持卵泡結(jié)構(gòu)完整。

研究發(fā)現(xiàn)，VC和EGF一起添加時(shí)顯著地抑制原始卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)，且培養(yǎng)12 d后組織中正常卵泡比例顯著低于單獨(dú)添加VC或EGF組，提示VC與EGF可能存在相互拮抗的作用。目前對(duì)于它們之間這種拮抗的機(jī)制還不清楚?？赡艿慕忉屖且环矫鍱GF只有在被離解素和金屬蛋白激酶(ADAMs)分開后，與EGF受體和ERBB4結(jié)合才能發(fā)揮其對(duì)卵巢卵泡的生理作用[23]。在對(duì)人羊膜細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加 VC可以降低基質(zhì)金屬蛋白激酶(MMP)的活性[24]，2001年Murry等也報(bào)道在鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)中添加低濃度VC能夠在增加MMP產(chǎn)量的同時(shí)顯著增加卵泡中金屬蛋白酶組織抑制劑 TIMP-1的產(chǎn)量[15]，而 ADAMs和 MMP均屬于蛋白激酶家族，提示 VC可能通過(guò)參與調(diào)節(jié)金屬蛋白激酶的合成，降低 EGF與其受體的結(jié)合率，影響 EGF對(duì)卵泡發(fā)育的影響。另一方面在 Park等的研究中表明 EGF信號(hào)途徑可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞膜上 LH受體的表達(dá)，調(diào)節(jié) LH促有絲分裂的能力[25]；而 LH可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生妊娠素，研究表明持續(xù)增加的妊娠素可以阻斷顆粒細(xì)胞對(duì) VC的攝取[26]，因此EGF可能也通過(guò)旁分泌的作用間接影響VC的作用。

有趣的是VC與EGF、FSH三者一起添加時(shí)，VC與EGF之間的相互抑制作用被消除，顯示對(duì)卵泡發(fā)育和生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。其原因可能是由于 FSH能夠促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞的分化增殖，在增殖過(guò)程中MMP的表達(dá)增強(qiáng)[24]，促進(jìn)EGF受體在顆粒細(xì)胞上的表達(dá)，發(fā)揮EGF的作用，促進(jìn)顆粒細(xì)胞有絲分裂和卵泡發(fā)育，Silva等[3]的研究也表明聯(lián)合添加EGF與FSH可以促進(jìn)原始卵泡的生長(zhǎng)。在卵泡細(xì)胞增殖和發(fā)育過(guò)程中需要大量的膠原來(lái)維持基底膜完整，VC可以促進(jìn)膠原的合成[15]。而FSH與VC之間的關(guān)系在前面的討論中已經(jīng)表明它們之間是相互促進(jìn)的。FSH與VC及EGF之間的這種正向調(diào)節(jié)關(guān)系，可能使得VC與EGF之間的拮抗作用被抑制，三者各自之間的作用都得到發(fā)揮，共同作用促進(jìn)卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)。

PCNA是一種37 kDa的蛋白，在細(xì)胞周期S期早期的細(xì)胞核中沒(méi)有表達(dá)，而在S期后期主要在細(xì)胞核中表達(dá)，與細(xì)胞核中DNA的合成密切相關(guān)。在羊、人、鼠上的研究已經(jīng)證實(shí)卵泡中顆粒細(xì)胞PCNA的表達(dá)可以作為顆粒細(xì)胞有絲分裂的可靠標(biāo)記[3]。在本研究中，PCNA分析結(jié)果表明VC與EGF拮抗抑制卵泡發(fā)育和生長(zhǎng)可能是通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞增殖而起作用的，而FSH可以消除它們之間的這種抑制作用，并且能與它們共同作用顯著增強(qiáng)顆粒細(xì)胞的增殖活性。研究表明 FSH可以通過(guò)旁分泌因子如IGF-I和激活素作用促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[20]，而VC能夠使顆粒細(xì)胞中FSH受體增多[15]。EGF具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用，而FSH可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞EGF受體的表達(dá)，當(dāng)它們與 VC一起添加時(shí)，VC加強(qiáng)FSH的作用，從而促進(jìn)EGF對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖作用，使得顆粒細(xì)胞增殖效果優(yōu)于其他組。

利用電鏡技術(shù)，可以對(duì)卵泡在體外發(fā)育中超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行評(píng)估，更好地評(píng)定卵泡的體外發(fā)育質(zhì)量。在本研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)12 d后，參與TEM分析的試驗(yàn)組中，只有VC+EGF+FSH組卵泡超微結(jié)構(gòu)幾種重要的細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核等與正常卵泡超微結(jié)構(gòu)類似。但是在VC+EGF組和MEM組中培養(yǎng)12 d后，雖然卵泡基本結(jié)構(gòu)在形態(tài)上還保持著完整，但是表現(xiàn)出更多的卵泡退化特征，這種表現(xiàn)在 MEM 組中尤為明顯。例如卵母細(xì)胞胞質(zhì)中空泡化極度增多，核形狀不規(guī)則，核膜呈波浪起伏，核中異染色質(zhì)增加。胞質(zhì)空泡化是卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞退化的標(biāo)志，可能表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹或線粒體結(jié)構(gòu)的改變[4]。在羊腔前卵泡中，線粒體腫脹、嵴消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體積增大是卵泡退化的早期標(biāo)志[27]。超微結(jié)構(gòu)的觀察表明VC+EGF可以維持卵泡膜結(jié)構(gòu)的完整，但對(duì)卵泡內(nèi)細(xì)胞器有損傷作用，如細(xì)胞器分布不均勻，空泡化增多，表明卵母細(xì)胞休眠或即將退化。光鏡下評(píng)定卵泡的正常與否精確度較低，常常只在膜結(jié)構(gòu)和基本形態(tài)上判定，不能反映卵泡內(nèi)細(xì)胞器的變化，而這些變化有可能是卵泡退化的關(guān)鍵標(biāo)志，組織學(xué)中VC+EGF組中正常卵泡比例變化明顯，與電鏡觀察結(jié)果一致。

總之，本研究結(jié)果表明FSH與EGF或VC共同作用可以促進(jìn)羊原始卵泡的激活和生長(zhǎng)，VC與EGF一起時(shí)則抑制卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)，F(xiàn)SH可以消除這種抑制，且增強(qiáng)它們對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。這些結(jié)果提示在培養(yǎng)體系中添加激素和生長(zhǎng)因子以外的其他物質(zhì)，研究它們之間的相互影響，可以為研究原始卵泡早期發(fā)生和開發(fā)支持原始卵泡發(fā)育到卵母細(xì)胞成熟和受精的體外培養(yǎng)體系提供更好的思路。

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Effect of ascorbic acid, epidermal growth factor and follicle stimulating hormone on in vitro culture of sheep ovarian cortical tissue

Xiayu Peng1,2, Liqin Wang2, Mei Yang3, Tong Chen2, and Zhiqin Guo2
1 Department of Animal Science, Shihezi University, Shihezi 832000, China 2 Key Laboratory of Reproduction and Breeding Biotechnology of Grass Feeding Livestock, Key Laboratory of Animal Biotechnology,China-Australia Sleep Breeding Research Center, Xinjiang Academy of Animal Science China, Urumqi 830000, China 3 Ainmal Sanitation Administration of Jinzhou District in Dalian City, Dalian 116037, China

Received:December 7, 2009;Accepted:April 6, 2010

Supported by:Projects in the National Science and Technology Pillar Program(Nos.2008BADB2B05-10, 2008ADB2B010-5).

Corresponding author:Zhiqin Guo.Tel: +86-991-4835324; Fax: +86-991-4841417; E-mail: abt.guo@vip.sina.com國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(Nos.2008ADB2B05-10, 2008ADB2B010-5)資助。