實(shí)驗(yàn)教學(xué)中對(duì)魏曦氏細(xì)菌鞭毛染色技術(shù)的改良探索

張瑋 楊風(fēng)琴 廖國玲

作者單位：750004 銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

鞭毛是細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)器官，與細(xì)菌致病力密切相關(guān)。通過觀察細(xì)菌菌體有無鞭毛以及鞭毛在菌體的位置和數(shù)量，可鑒定和鑒別細(xì)菌。由于鞭毛非常細(xì)小，在一般光學(xué)顯微鏡下不易觀察其形狀和數(shù)目等，給細(xì)菌分類鑒定和教學(xué)工作帶來諸多不便。此時(shí)需借助特殊染色方法加粗鞭毛，使鞭毛可在光學(xué)顯微鏡下被觀察到［1］。然而鞭毛的染色過程繁瑣、技術(shù)性強(qiáng)、染色步驟較嚴(yán)格，且傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)鞭毛時(shí)間長(zhǎng)，初學(xué)者不易掌握。本教研室在過去研究基礎(chǔ)上，經(jīng)反復(fù)實(shí)踐摸索出一種鞭毛改進(jìn)染色法，能在較短時(shí)間內(nèi)獲得較好的染色效果。本文以變形桿菌作為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)傳統(tǒng)經(jīng)典的魏曦氏鞭毛染液配方、細(xì)菌的培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行探索，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌種 普通變形桿菌、傷寒桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種，經(jīng)鑒定均符合自身細(xì)菌生物學(xué)特性。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂（批號(hào)：20170911）、克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基（批號(hào)：20180109）和半固體培養(yǎng)基（批號(hào)：20180509）均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司；血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號(hào)：201902）購自英國OXOID 公司。

1.3 染料及試劑 硫酸鋁鉀（批號(hào)：20171011）和鞣酸（批號(hào)：20170105）均購自天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；石炭酸（批號(hào)：20170315）購自天津市化學(xué)試劑三廠；堿性復(fù)紅（批號(hào)：20170805）購自上海士鋒生物科技有限公司。

1.4 儀器 壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50A）購自上海博訊有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH6000BII）和數(shù)碼生物顯微鏡（BK5000 Series）均購自重慶奧特有限公司。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 載玻片處理 將玻片置于肥皂水中煮沸5～10 min，用自來水沖洗后在洗滌液中浸泡0.5～2 h，再用自來水流水沖洗3 h 以上，待干燥后浸于95%乙醇中備用［2］。

1.5.2 改良魏曦氏鞭毛染液配制 A 液：媒染液［3］200 g/L，鞣酸2 mL，飽和硫酸鋁鉀2 mL；B 液：石炭酸復(fù)紅6 mL。在使用前1 周將A 液和B 液按4：6 的比例混合過濾，作為染色應(yīng)用液備用。

1.5.3 菌種培養(yǎng)及制片 將普通變形桿菌和傷寒桿菌于肉湯培養(yǎng)基中復(fù)蘇，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)傳代2 次，再分別接種于半固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂和克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基分別接種3 個(gè)，35 ℃分別培養(yǎng)10 h、15 h、20 h。取潔凈玻片置于平臺(tái)，將新制蒸餾水滴在玻片上，挑選培養(yǎng)好的菌落或菌苔邊緣部分，在水膜上輕輕接觸一下，使細(xì)菌均勻擴(kuò)散，避免攪動(dòng)，以防細(xì)菌鞭毛脫落。自然干燥或置35 ℃溫箱干燥。

1.5.4 鞭毛染色 將制備好的普通變形桿菌和傷寒桿菌涂片置于染色架上，滴加改良鞭毛染色應(yīng)用液染色3～5 min，用蒸餾水緩慢沖洗后晾干鏡檢。菌體和鞭毛均為紅色，若染色時(shí)間長(zhǎng)則鞭毛粗，若染色時(shí)間短則鞭毛細(xì)。

2 結(jié)果

經(jīng)改良鞭毛染色后的菌體完整，易著色，視野清晰，無沉淀顆粒；鞭毛染色以及完整性和伸展性均較好、粗細(xì)適中。

在各培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 h 后培養(yǎng)物的鞭毛染色情況：有鞭毛的細(xì)菌數(shù)量較多，無鞭毛脫落。見圖1。

圖1 培養(yǎng)10 h 鞭毛魏曦氏改良染色情況（油鏡×100）

培養(yǎng)15 h 后培養(yǎng)物的鞭毛染色情況：60%細(xì)菌有鞭毛。見圖2。

圖2 培養(yǎng)15 h 鞭毛魏曦氏改良染色情況（油鏡×100）

培養(yǎng)20 h 后培養(yǎng)物的鞭毛染色情況：20%細(xì)菌有鞭毛，尤其是克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基上有鞭毛的細(xì)菌更少。見圖3。

圖3 培養(yǎng)20 h 鞭毛魏曦氏改良染色情況（油鏡×100）

3 討論

魏曦氏鞭毛染色原配方A 液中的石炭酸與堿性復(fù)紅乙醇飽和液相遇可發(fā)生染料沉淀，導(dǎo)致染料有效成分減少，從而影響染色效果。改良染色配方將原配方A 液中的石炭酸去掉，僅用鞣酸和飽和硫酸鋁鉀；將原配方B 液中的堿性復(fù)紅乙醇飽和液換成石炭酸復(fù)紅，避免了上述情況的發(fā)生。經(jīng)改良的A 液與B 液相遇后出現(xiàn)的沉淀減少。另外，原配方中A 液與B 液按1：9 的比例配制，復(fù)紅染料所占比例較大，兩者混合可出現(xiàn)染料沉渣，導(dǎo)致染色背景臟，不利于鞭毛的觀察。而改良染色配方將A 液與B 液按4：6 的比例配制，減少了染料沉渣的出現(xiàn)。

傳統(tǒng)魏曦氏鞭毛染色法需要先將有鞭毛的細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)種7 代，對(duì)鞭毛進(jìn)行誘導(dǎo)，才能染出滿意的鞭毛［4］。然而經(jīng)過實(shí)驗(yàn)教學(xué)反復(fù)實(shí)踐我們發(fā)現(xiàn)，僅需將細(xì)菌復(fù)蘇至第2 代，之后轉(zhuǎn)種于常用的半固體培養(yǎng)基、血瓊脂、營養(yǎng)瓊脂和克氏雙糖含鐵培養(yǎng)基上，在分離培養(yǎng)鑒定的同時(shí)直接取上述培養(yǎng)物進(jìn)行鞭毛染色，染色后的鞭毛就已清晰可見，且顏色較深，從而簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省了操作時(shí)間。

細(xì)菌鞭毛除了與合適的營養(yǎng)條件和培養(yǎng)溫度有關(guān)外，還與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究報(bào)道的培養(yǎng)時(shí)間為10～24 h［5-6］。本試驗(yàn)設(shè)置了10、15、20 h 3 個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段，取各自時(shí)間段的培養(yǎng)物進(jìn)行鞭毛染色，培養(yǎng)10 h后鞭毛數(shù)量多、粗細(xì)均勻、著色深；15 h 后有鞭毛的細(xì)菌占60%；20 h 后有鞭毛的細(xì)菌僅占20%。由此證實(shí)，細(xì)菌鞭毛染色應(yīng)選擇10 h 培養(yǎng)物，此時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)最旺盛，鞭毛正處于壯年期，鞭毛過長(zhǎng)則菌體趨向衰老，鞭毛脫落則不易觀察到鞭毛［4，7］。

綜上所述，使用改良魏曦氏鞭毛染液配方以及4 種常用培養(yǎng)基的10 h 培養(yǎng)物進(jìn)行鞭毛染色，鞭毛染色效果好，操作簡(jiǎn)單方便，成功率高，具有較好的使用價(jià)值。