HPLC測定市售青黛中靛藍和靛玉紅的含量

白宗利，任玉珍，陳彥琳，杜杰，梁煥，彭秀娟，周林，田壯，屈效源

（中國藥材公司，北京 100195）

HPLC測定市售青黛中靛藍和靛玉紅的含量

白宗利*，任玉珍，陳彥琳，杜杰，梁煥，彭秀娟，周林，田壯，屈效源

（中國藥材公司，北京 100195）

目的：建立青黛中靛藍和靛玉紅含量的測定方法。方法：采用HPLC定量分析，色譜柱為Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm），靛藍流動相為甲醇-水（60∶40），流速為1.0mL·min-1，檢測波長為610nm；靛玉紅流動相為甲醇-水（70∶30），流速為1.0mL·min-1，檢測波長為 292nm。結(jié)果：靛藍在 0.029 6～0.296μg（r＝0.999 9）與峰面積呈良好線性關(guān)系，靛玉紅在0.010 6～0.127 2μg（r＝0.999 9）與峰面積呈良好線性關(guān)系。結(jié)論：HPLC操作簡便、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、專屬性強，可用于青黛中有效成分含量的測定。

青黛；靛藍；靛玉紅；高效液相色譜法

青黛為爵床科植物馬藍Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.、蓼科植物蓼藍Polygonum tinctoriumAit.或十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末、團塊或顆粒。具有清熱解毒，涼血消斑，瀉火定驚的功能。用于溫毒發(fā)斑，血熱吐衄，胸痛咳血，口瘡，痄腮，喉痹，小兒驚癇［1］。青黛的主要有效成分是靛藍和靛玉紅，《中國藥典》2005年版一部中分別采用紫外-可見分光光度法和薄層色譜掃描法對其含量進行測定［2］，但這些方法存在著操作繁瑣、重現(xiàn)性差等問題。我們通過修訂 《北京市中藥炮制規(guī)范》，參考 《中國藥典》2005年版一部蓼大青葉項下 “含量測定”［3］和 《中國藥典》2010年版一部青黛項下 “含量測定”中靛玉紅的含量測定［1］，采用高效液相色譜法分別測定了9批市售青黛樣品中靛藍和靛玉紅的含量，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

waters2695液相色譜儀，DAD2996檢測器；島津uv2550紫外分光光度計；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DENVER電子分析天平（1／10萬，北京賽多利斯儀器系列有限公司）。

1.2 試藥

靛藍對照品（批號110716-200509，供含量測定用）；靛玉紅對照品（批號110717-200204，供含量測定用），均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 試劑與樣品

三氯甲烷、水合氯醛、甲苯、丙酮為分析純；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

青黛樣品分別從北京市5家中藥飲片廠和北京市知名藥店收集，共9批，編號及來源詳見表1。經(jīng)北京市衛(wèi)生學校金世元教授鑒定為爵床科植物馬藍Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.、蓼科植物蓼藍Polygonum tinctoriumAit.或十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末。

表1 青黛樣品編號及來源

2 方法與結(jié)果

2.1 青黛中靛藍含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（60∶40）；柱溫：30℃；流速：1mL·min－1；檢測波長：610nm；進樣量：10μL；理論板數(shù)按靛藍峰計算應(yīng)不低于1 800。2.1.2對照品溶液的制備 取靛藍對照品3.7mg，精密稱定，置250mL量瓶中，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液（取水合氯醛，置硅膠干燥器中放置24h，稱取2.0g，加三氯甲烷至100mL，放置，出現(xiàn)渾濁，以無水硫酸鈉脫水，濾過，即得。）約200mL，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）1.5h，取出，放冷至室溫，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液至刻度，搖勻，即得濃度為0.014 8mg·mL－1的對照品溶液。靛藍對照品HPLC圖見圖1。

圖1 靛藍對照品HPLC圖

2.1.3 供試品溶液的制備 取青黛細粉約25mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液約 20mL，超聲處理（功率 250W，頻率33kHz）1.5h，取出，放冷，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。青黛樣品HPLC圖見圖2。

圖2 青黛樣品HPLC圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2，5，10，12，15，20μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積；以靛藍進樣量為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標作線性回歸，得回歸方程：Y＝350 218 6.2X-322 56.0（r＝0.999 9），結(jié)果表明，靛藍在0.029 6～0.296μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取上述配制的靛藍對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果RSD＝0.5%；精密吸取上述配制的供試品溶液10μL，重復(fù)進樣 6次，測定靛藍峰面積，結(jié)果RSD＝0.7%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，6，8，12h時進樣，測定靛藍峰面積，結(jié)果RSD＝1.6%，表明樣品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批青黛樣品6份，按供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件各進樣10μL測定，結(jié)果靛藍的平均含量為1.86%，RSD＝0.5%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率試驗 取已知靛藍含量的青黛（含量為1.86%）12.5mg，精密稱定，共6份，置25mL量瓶中，分別加入濃度為11.98μg·mL－1的靛藍對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 靛藍加樣回收率試驗

2.1.9 檢測限和定量限試驗 采用信噪比法，先進1針空白溶劑，測出噪音，進已知濃度靛藍對照品，根據(jù)其對應(yīng)的峰高值，將對照品溶液稀釋至約3倍信噪比濃度，測得靛藍的檢測限為0.710 4μg·mL－1；同樣將對照品稀釋至約10倍信噪比的濃度，重復(fù)進樣5～6次，測得靛藍的定量限為2.368μg·mL－1。

2.1.10 樣品靛藍含量測定結(jié)果 取9批青黛樣品，按上述方法進行靛藍含量測定，結(jié)果（以干燥品計）見表4。

2.2 青黛中靛玉紅含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（70∶30）；柱溫：25℃；流速：1mL·min－1；檢測波長：292nm；進樣量：10μL；理論板數(shù)按靛玉紅峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取靛玉紅對照品2.65mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺約45mL，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）至溶解完全，取出，放冷至室溫，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻；精密量取10mL，置100mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，即得0.005 3mg·mL－1的對照品溶液。靛玉紅對照品HPLC圖見圖3。

圖3 靛玉紅對照品HPLC圖

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約50mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺約20mL，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30min，取出，放冷，加 N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。青黛樣品HPLC圖見圖4。

圖4 青黛樣品HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2，4，8，16，20，24μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積；以靛玉紅進樣量為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標作線性回歸，得回歸方程Y＝276 21X－175 72.0（r＝0.999 9），結(jié)果表明，靛玉紅在0.010 6～0.127 2μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取上述配制的靛玉紅對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果RSD＝0.3%；精密吸取上述配制的供試品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，測定靛玉紅峰面積，結(jié)果RSD＝1.0%，表明本方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，6，8，12h進樣，測定靛玉紅峰面積，結(jié)果RSD＝0.7%，表明樣品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批青黛樣品6份，按供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件各進樣10μL測定，結(jié)果靛玉紅的平均含量為0.108 3%，RSD＝1.4%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗 取已知靛玉紅含量的青黛（含量為0.11%）25mg，精密稱定，共6份，置25mL量瓶中，分別加入濃度為0.005 3mg·mL－1的靛玉紅對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 靛玉紅加樣回收率試驗

2.2.9 檢測限和定量限試驗 采用信噪比法，先進1針空白溶劑，測出噪音，進已知濃度靛玉紅對照品，根據(jù)其對應(yīng)的峰高值，將對照品溶液稀釋至約3倍信噪比濃度，測得靛玉紅的檢測限為 0.361μg·mL－1；同樣將靛玉紅對照品稀釋至約10倍信噪比的濃度，重復(fù)進樣5～6次，測得靛玉紅的定量限為1.06μg·mL－1。

2.2.10 樣品靛玉紅含量測定結(jié)果 取9批青黛樣品，按上述方法進行靛玉紅含量測定，結(jié)果（以干燥品計）見表4。

表4 9批次青黛樣品中靛藍和靛玉紅含量測定／%

3 討論

《中國藥典》2005年版一部青黛項下規(guī)定靛藍含量不少于2.0%，靛玉紅含量不少于0.13%。《中國藥典》2010年版雖然修訂了靛藍的含量測定方法，但有關(guān)限度未變。本文測定結(jié)果表明，收集的9批市售青黛樣品中，有1批樣品靛藍含量小于2.0%，有6批樣品靛玉紅含量小于0.13%，說明目前市場流通使用的青黛質(zhì)量問題嚴重，應(yīng)引起有關(guān)部門的重視。 實驗表明，HPLC操作簡便、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、專屬性強，可用于青黛中有效成分含量的測定。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：185.

［2］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：138-139.

［3］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：253.

Determ ination of Indigo and Indirubin in Indigo Naturalis by HPLC

Bai Zongli，Ren Yuzhen，Chen Yanlin，Du jie，Liang Huan，Peng Xiujuan，Zhou Lin，Tian Zhuang，Qu Xiaoyuan
（China National Corp.of Traditional＆Herbal Medicine，Beijing100195，China）

Objective：To determine the contents of indigo and indirubin in indigo naturalis.Methods：The contents of indigo and indirubin were determined by HPLC.The chromatographic column was Diamonsil Cl8（150mm×4.6mm，5μm）.The mobile phase was methanol-water（60∶40）and the flow rate was 1.0mL·min－1with detection wavelength of 610nm for indigo.The mobile phase was methanol-water（70∶30）and the flow rate was 1.0mL·min－1with detection wavelength of 292nm for indirubin.Results：The linear correlation of the indigo was good in the range of 0.029 6～0.296μg（r＝0.999 9）.The Linear correlation of the indirubin was good in the range of 0.010 6～0.127 2μg（r＝0.999 9）.Conclusion：HPLC method is simple and the result is reliable with good repeatability and can be used for the determination of the components in indigo naturalis.

Indigo naturalis；Indigo；Indirubin；HPLC

*白宗利，E-mail：baizl＠sino-tcm.com

2010-03-18）