RP-HPLC同時(shí)測定克銀顆粒中的靛藍(lán)和靛玉紅

劉 梅 葉子晨 王慶偉 徐 媛 黨學(xué)良

1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710038；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，陜西西安 710032

克銀顆粒是由青黛、苦參、白花蛇舌草等九味藥組成的復(fù)方制劑，該藥具有清熱解毒、涼血活血、祛風(fēng)止癢的功效，是第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科治療銀屑病的經(jīng)驗(yàn)方。處方中君藥青黛具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚的功能，用于溫毒發(fā)斑、血熱吐衄、胸痛咳血、口瘡、痄腮、喉痹、小兒驚癇[1-2]。青黛的主要有效成分是靛藍(lán)和靛玉紅，為了有效控制該制劑質(zhì)量，本文采用反相高效液相色譜法同時(shí)測定克銀顆粒中青黛主要藥效成分靛藍(lán)和靛玉紅的含量，結(jié)果顯示，所建立的方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，為克銀顆粒質(zhì)量控制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Agilent 1100 高效液相色譜儀（Agilent 1100 泵，Agilent 1100 DAD檢測器，Agilent 2100 色譜工作站）；BP211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-32000DB型數(shù)控超聲波儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

靛藍(lán)對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110716-200610）、靛玉紅對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110717-200204）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純；克銀顆粒（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科制備，批號(hào)：20100111、20100118、20100125）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量靛藍(lán)對(duì)照品3.29 mg，加N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解并稀釋成164.5 μg/mL的靛藍(lán)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。另精密稱取3.90 mg靛玉紅對(duì)照品，加DMF溶解并稀釋成195.0 μg/mL的靛玉紅對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取克銀顆粒樣品研磨成細(xì)粉，精密稱量 1.0 g，加 50 mL DMF，超聲處理（250 W，33 kHz）30 min，轉(zhuǎn)入100 mL量瓶中并定容；精密吸取1.0 mL續(xù)濾液，用甲醇稀釋至10 mL的量瓶中，用于靛藍(lán)的含量測定；另取續(xù)濾液5 mL，用甲醇稀釋至10 mL的量瓶中，用于靛玉紅的含量測定。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺青黛的克銀顆粒處方制備陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為 Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20，V/V），流速為 1.0 mL/min，柱溫為 30℃；靛藍(lán)的檢測波長為287 nm，靛玉紅的檢測波長為292 nm。理論板數(shù)分別按靛藍(lán)峰和靛玉紅峰計(jì)算均應(yīng)不低于3 000。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取供試品溶液、陰性供試品溶液及適當(dāng)濃度的靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品溶液，于不同波長的色譜條件進(jìn)樣。在靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品相應(yīng)色譜峰位置處無其他色譜峰出現(xiàn)，靛藍(lán)的保留時(shí)間為5.8 min（287 nm），靛玉紅的保留時(shí)間為7.9 min（292 nm）。見圖1～2。

圖1 靛藍(lán)對(duì)照品、陰性對(duì)照樣品、克銀顆粒樣品HPLC色譜

圖2 靛玉紅對(duì)照品、陰性對(duì)照樣品、克銀顆粒樣品HPLC色譜

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.1”項(xiàng)下靛藍(lán)對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇逐步稀釋成0.329、1.650、3.290、8.225、16.450、24.680、32.900 μg/mL，取適量靛玉紅對(duì)照品儲(chǔ)備液逐步稀釋成 0.390、1.850、3.900、9.250、18.500、28.750、39.000 μg/mL 系列濃度的對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，以對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得到靛藍(lán)和靛玉紅靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=56.94C-1.749（r=0.999 8）；Y=119.1C+19.71（r=0.999 9）。結(jié)果表明靛藍(lán)在 0.329～32.900 μg/mL范圍內(nèi)，靛玉紅在0.390～39.000 μg/mL范圍內(nèi)，藥物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，在配制后 0、4、8、12、24 h于靛藍(lán)和靛玉紅的色譜條件下分別進(jìn)樣，靛藍(lán)、靛玉紅峰面積的RSD分別為0.86%和0.79%。結(jié)果表明樣品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 精密度考察

取靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)照品溶液（靛藍(lán)濃度為16.45 μg/mL、靛玉紅濃度為18.50 μg/mL），于各自色譜條件下同一天連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算靛藍(lán)和靛玉紅日內(nèi)RSD分別為0.78%和0.88%；連續(xù)3 d進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算靛藍(lán)和靛玉紅日間RSD分別為1.03%和1.12%。結(jié)果表明儀器與色譜條件具有良好的精密度。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，分別按樣品測定方法測定。每10 g克銀顆粒中靛藍(lán)的平均含量為69.850 mg，RSD=0.92%；靛玉紅的平均含量為2.622 mg，RSD=1.01%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱量已知靛藍(lán)和靛玉紅含量的克銀顆粒（每克顆粒劑含靛藍(lán) 6.985 0 mg，含靛玉紅0.262 2 mg）1.103 g，加 DMF 50 mL，超聲30 min用甲醇定容至100 mL量瓶中，過濾，平行取6份續(xù)濾液各1 mL，分成3組，每組2份，分別加入靛藍(lán)對(duì)照品溶液（82.25 μg/mL）0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。另平行取6份續(xù)濾液各5.0 mL，分成3組，每組2份，分別加入靛玉紅對(duì)照品溶液（97.50 μg/mL）0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。分別于不同波長的色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算靛藍(lán)和靛玉紅的含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 靛藍(lán)和靛玉紅的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取3 批樣品，分別按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，按上述色譜條件分別測定其含量，按外標(biāo)法計(jì)算靛藍(lán)與靛玉紅的含量，結(jié)果3 批樣品中每袋含靛藍(lán)平均值為68.82 mg，靛玉紅平均值為2.54 mg。結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論

《中國藥典》2010年版采用液相色譜測定青黛中的靛藍(lán)和靛玉紅進(jìn)行控制質(zhì)量。靛藍(lán)和靛玉紅為同分異構(gòu)體，脂溶性均較強(qiáng)，在很多試劑中溶解性較差，《中國藥典》2010年版測定青黛中靛藍(lán)的含量時(shí)，用2%水合氯醛的三氯甲烷溶液作為溶劑進(jìn)行超聲處理，以606 nm作為檢測波長，筆者發(fā)現(xiàn)很多液相的紫外-可見檢測器無606 nm的設(shè)置。采用600 nm測定靛藍(lán)的含量，靈敏度低，重復(fù)性差且誤差大，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。故本文采用檢測波長為287 nm和292 nm分別來測定靛藍(lán)和靛玉紅含量，效果較好。

有文獻(xiàn)先用三氯甲烷回流溶解后再用異丙醇和甲醇逐步稀釋的方法配制對(duì)照品，本文先以DMF為溶劑，超聲30 min溶解后再用甲醇逐步稀釋，可確保靛藍(lán)與靛玉紅溶解完全，配制過程中無沉淀析出，最終溶劑與流動(dòng)相相接近。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：185.

[2] 白宗利，任玉珍，陳彥琳，等.HPLC測定市售青黛中靛藍(lán)和靛玉紅的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2010，12（8）：27-32.

[3] 諶立巍，廖婉，楊明，等.HPLC測定青黛中的靛藍(lán)和靛玉紅[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23（6）：714-715.

[4] 彭文進(jìn)，趙士冶，馮秀珍，等.高效液相色譜法測定小兒感冒顆粒中靛藍(lán)與靛玉紅的含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3（6）：1-2.