小尾寒羊PRNP等位基因密碼子136、154和171的多態(tài)性研究

趙春林 ，吳 潤 ，李發(fā)弟 ，柳紀省 ，王 川 ，王 芳

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

小尾寒羊PRNP等位基因密碼子136、154和171的多態(tài)性研究

趙春林1，2，吳 潤1，2，李發(fā)弟3，柳紀省1，王 川2，王 芳2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

為研究小尾寒羊PRNP等位基因密碼子多態(tài)性，本研究以綿羊全血基因組DNA為模版，通過PCR，擴增綿羊PRNP等位基因目的片段，并將其克隆于pMD-18T載體。經(jīng)SSCP法篩選出陽性克隆后測序，確定各綿羊PRNP 136位、154位和171位密碼子等位基因型及頻率分布。在104只綿羊中共檢出15個PRNP 136位、154位和171位密碼子等位基因型，癢病易感基因型占優(yōu)勢(53.85%，56/104）。本研究證明，該綿羊群屬于癢病易感/易發(fā)群體，一旦癢病傳入具有罹患癢病的極大可能性。

綿羊；PRNP等位基因；136，154和171位密碼子；多態(tài)性；PCR-SSCP

綿羊PRNP基因型多態(tài)性研究已經(jīng)證實136，154和171密碼子與綿羊癢病的易感性/抗性存在極相關(guān)性。中國綿羊群體雖以癢病易感性基因型為主[1-3]，但尚未實施綿羊抗癢病育種計劃，具有癢病傳入感染和發(fā)生的極大隱患。目前，國內(nèi)進行綿羊PRNP密碼子136、154和171多態(tài)性研究多局限于單倍型分析，等位基因多態(tài)性及其基因型頻率分布調(diào)查卻很少[1]。因此，用簡便可行且成本低廉的方法來分析綿羊PRNP等位基因多態(tài)性和基因型頻率分布，對抗癢病育種計劃實施具有重要意義。本研究以在甘肅省永昌羊場隨機采集的104只小尾寒羊為研究對象，用PCR-SSCP技術(shù)進行該綿羊群體PRNP等位基因密碼子136、154和171多態(tài)性研究，探明其等位基因型種類及其頻率分布，對該綿羊群體的癢病易感性做出評估，為建立綿羊PRNP等位基因型快速檢測和分型方法提供實驗材料和實驗技術(shù)，并為抗癢病育種工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 血樣及試劑 從甘肅省永昌羊場隨機抽取104只健康小尾寒羊，分別采取頸靜脈血液樣品，按1∶5加入ACD抗凝，分裝并保存于-70℃。全血基因組DNA提取試劑盒、PremixTaq酶、限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體等購自寶生物工程(大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 參照綿羊朊蛋白基因序列，用Primer Premier 5.0在綿羊PRNP完整開放閱讀框(ORF）內(nèi)針對包含136、154和171密碼子的片段設(shè)計引物。引物設(shè)計參照文獻[4]，預(yù)計可擴增PRNP開放閱讀框+360～+627位約為268 bp的目的DNA片段。

1.3 PRNP等位基因DNA片段的PCR擴增和電泳以基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為50 μL，其中 PremixTaq25.0 μL、綿羊基因組 DNA 1.0 μL(50 pmol/L）、上下游引物各 1.0 μL(10 pmol/L）、ddH2O 22.0 μL。離心混勻后置PCR擴增儀中，94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠檢測。

1.4 綿羊PRNP等位基因純合子、雜合子的SSCP分析 2.0 μL PCR擴增產(chǎn)物與8.0 μL變性上樣緩沖液離心混勻后，于98℃變性10 min，立即置于冰浴中10 min后上樣，在文獻[4]的條件下進行擴增產(chǎn)物的SSCP分析。電泳后進行銀染，觀察帶型并判定PRNP等位基因純合子或雜合子綿羊個體。

1.5 綿羊PRNP等位基因的克隆及其篩選與鑒定將目的DNA片段克隆于pMD-18T載體后進行等位基因克隆的篩選及鑒定。對于純合子綿羊個體，在一個平板上挑選3個形態(tài)一致的無色透明菌落，雜合子挑選10個菌落。提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR擴增和雙酶切鑒定后在相同條件下進行基因組擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒擴增產(chǎn)物的SSCP分析鑒定，挑選1個(純合子）或1對(雜合子）等位基因陽性克隆。PRNP密碼子136、154和171等位基因型經(jīng)測序判定后分析其基因型頻率，評估該綿羊群體癢病易感性。檢測除綿羊PRNP 136、154和171外其它已知或未知密碼子突變，并分析其規(guī)律。

2 結(jié)果與討論

2.1 綿羊PRNP等位基因SSCP分析及其隆鑒定在104只綿羊的基因組DNA擴增產(chǎn)物SSCP分析中，依條帶數(shù)共出現(xiàn)4條、3條和2條條帶的3類帶型；呈現(xiàn)4或3條帶的綿羊為雜合子個體，出現(xiàn)2條帶者為純合子個體。預(yù)選陽性克隆重組質(zhì)粒DNA擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中均出現(xiàn)一條大于250 bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小基本符合；瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物，均在250 bp～500 bp之間和大于2 000 bp位置各有一條條帶，與預(yù)期目的片段、載體片段大小基本相符；應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)成功地鑒定并挑選出104只綿羊PRNP等位基因的陽性克隆。

2.2 陽性克隆測序結(jié)果比對及其基因型判定、變異位點分析 104只綿羊的PRNP等位基因密碼子136、154和171純合子基因型占 62.5%(65/104）、雜合子基因型占37.5%(39/104）。其中癢病易感基因型ARQ/ARQ 36.54%(38/104）、ARQ/ARH 10.58%(11/104）、VRQ/ARQ 4.81%(5/104）、ARH/ARH 1.92%(2/104），共計53.85%(56/104）；癢病半抗性基因型ARR/ARQ 11.54%(12/104）、ARR/ARH 0.96%(1/104），共計 12.50%(13/104）；癢病抗性基因型ARR/ARR 22.12%(23/104）；未知與癢病關(guān)系的基因型 AHR/ARQ 0.96%(1/104）、ARK/ARQ 3.85%(4/104）、 ARK/ARH 1.92% (2/104）， TRQ/TRQ、TRQ/ARR、TRQ/ARQ、ARQ/ARP和 ARK/ARK各0.96%(1/104），共計11.54%(12/104）。該群體綿羊癢病易感基因型占絕對優(yōu)勢，具有癢病感染或發(fā)生的高度易感性，具有罹患輸入性癢病的極大可能性，再次證明我國綿羊存在癢病高危群體[1-2，5-6]。研究還發(fā)現(xiàn)了國內(nèi)相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)的極低頻率的ARK/ARK和ARK/ARH基因型[5-6]，其與癢病的關(guān)系至今尚不明了。目前國內(nèi)綿羊PRNP等位基因研究中已發(fā)現(xiàn)密碼子136均為A/A型[5-6]，而本次研究在5只綿羊中發(fā)現(xiàn)了A136V、3只綿羊中發(fā)現(xiàn)了A136T突變；國內(nèi)綿羊中已發(fā)現(xiàn)R154H和Q171R/K/H突變及單倍型ARH[1-2，5-6]，而本研究僅發(fā)現(xiàn)1只綿羊有R154H突變、36只綿羊有Q171R突變、7只綿羊有Q171K突變、16只綿羊有Q171H突變。AHR、AHQ、VRQ和TRQ單倍型在國內(nèi)尚為首次發(fā)現(xiàn)，其頻率很低(＜0.96%）(圖1）。

注綿羊群體PRNP的121位～209位的片段中，除密碼子136、154和171外另發(fā)現(xiàn)18個其他突變位點，其中L141F、R167G、N176Y和Q189L為已發(fā)現(xiàn)突變位點，Y131N、L133P、G134R、E149V、M157T、 Y158H、 N162P、 Y166D、 F178S/L、C182S、E199V/L、N200I、F201S、M209T 為新發(fā)現(xiàn)的14個突變位點。L141F和Q189L在國內(nèi)外已有發(fā)現(xiàn)，而R167G和N176Y突變在國內(nèi)未見報道[1-2，5-6]。以上這些突變的意義不詳，還需今后進一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)4例ARQ(141F）、2例ARK(141F）和2例ARH(141F），這與141F突變經(jīng)常發(fā)生在ARQ單倍型并很可能與該單倍型相關(guān)聯(lián)的結(jié)論[7-9]相類似。另外，在33例中檢出Q189L突變，其中21例為ARQ(189L）等位基因型；發(fā)現(xiàn)8例L141F突變，6例見于ARQ/ARQ基因型，2例存在于ARK/ARQ基因型；發(fā)現(xiàn)9例R167G突變，7例出現(xiàn)于ARQ/ARQ基因型?？梢姡谠摼d羊群體中141F、167G和189L突變多發(fā)生于ARQ等位基因型中，可能與ARQ相關(guān)聯(lián)，對此還需進一步證實。

[1]Zhang L,Li N,Fan B,et al.PRNP polymorphisms in Chinese ovine,caprine and bovine breeds[J].Anim Genet,2004,35(6）:457-461.

[2]Li Y M,Tian B.Chinese little-fat-tail sheep prion protein gene belongs to PrPARH genotype[J].ShengWu HuaXue Yu Sheng Wu WuLi XueBao(Shanghai）,2002,34(1）:62-66.

[3]吳潤，謝慶閣，劉湘濤，等.羊朊蛋白(PrPC）基因的克隆和序列分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36(8）：794-799.

[4]趙春林，王川，吳潤，等.綿羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析條件的優(yōu)化[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(8）：721-727.

[5]Lan Z,Wang Z L,Liu Y,et al.Prion protein gene(PRNP）polymorphisms in Xinjiang local sheep breeds in China[J].Arch Virol,2006,151(10）:2095-2101.

[6]蘭鄒然，中國地方綿羊品種PRNP基因研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2006.

[7]Moum T,Olsaker I,Hopp P,et al.Polymorphisms at codons 141 and 154 in the ovine prion protein gene are associated with scrapie Nor98 cases[J].J Gen Virol,2005,86(1）:231-235.

[8]Bossers A,Schreuder B E C,Muileman I H,et al.PrP genotype contributes to determining survival times of sheep with natural scrapie[J].J Gen Virol,1996,77(10）:2669-2673.

[9]Saunders G C,Cawthraw S,Mountjoy S J,et al.PrP genotypes of atypical scrapie cases in Great Britain[J].J Gen Virol,2006,87(11）:3141-3149.

Polymorphisms of PRNP Alleles in small tail Han sheep

ZHAO Chun-lin1,2,WU Run1,2,LI Fa-di3,LIU Ji-xing1,WANG Chuan2,WANG Fang2

(1.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China;2.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China）

The PRNP allelic fragments in Small Tail Han Sheep were amplified by PCR with specific primers and cloned into pMD-18T vector.Positive clones were confirmed by enzymatic digestion,SSCP and sequenced.Fifteen genotypes of PRNP allele at codon 136,154 and 171 were detected.The high scrapie susceptibility genotypes observed in this breed was 53.85%.The results showed this flock was a high risk population of the scrapie susceptibility/outbreaks.

sheep;PRNP allele;codons 136,154 and 171;polymorphism;PCR-SSCP

S852.2

A

1008-0589(2010）01-0074-03

2008-12-08

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(20060733006）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW-2005-11及GNSW-2007-04）；家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室基金項目(2008-2009）

趙春林(1982-），男，甘肅天水人，博士研究生，從事動物病原微生物分子生物學(xué)及其致病機理研究.

*通信作者：E-mail：wurun@gsau.edu.cn

趙曉巖）