猴頭菇多糖對呼腸孤病毒感染番鴨組織病變及細胞凋亡的影響

陳藝娟，吳異健，黃一帆，吳寶成

(福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州350002)

番鴨呼腸孤病(Muscovy duck reovirus，MDRV)早在1950年國外已有報道[1]。1996年，在我國部分地區(qū)開始出現(xiàn)一種以肝、脾出現(xiàn)多處灰白色壞死點為主要病變特征的急性傳染病，俗稱番鴨肝“白點病”、“花肝病”。1998年在福建、廣東、浙江等省番鴨養(yǎng)殖地區(qū)暴發(fā)流行，病毒感染番鴨主要表現(xiàn)為精神萎頓，軟腳，排深色帶有黏液糞便，部分病鴨趾關節(jié)或附關節(jié)有不同程度的腫脹，耐過鴨生長發(fā)育受阻，內(nèi)臟器官(包括心、肝、脾等)有大量的灰白色呈花斑樣的壞死灶[2-4]，2001年吳寶成等證實該病原為MDRV[5]，并且發(fā)現(xiàn)該病毒可以誘導肝、脾發(fā)生細胞凋亡[3，6]。細胞凋亡是基因控制的無炎癥反應的生理性死亡，細胞凋亡以宿主細胞的“主動”死亡阻止病毒增殖的方式可在機體抗病毒感染中發(fā)揮作用，但另一方面，又可能引起免疫細胞過度凋亡導致機體的免疫功能下降，臨床上出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象；壞死則為病毒感染細胞的被動性死亡，并常伴有炎癥反應的病理性死亡。顯然，病毒感染番鴨臨床致病性的表現(xiàn)程度與細胞壞死和凋亡之間存在密切的關系。近年來，國內(nèi)外研究控制凋亡的藥物有很多，中藥多糖能夠有效調(diào)節(jié)病毒感染后的細胞凋亡并具有抗病毒作用，其中猴頭菇多糖具有抗衰老、抗病毒和降血脂等功能已經(jīng)得到實驗證實[7]?，F(xiàn)代研究表明猴頭菇多糖：一是增強免疫功能；可提高機體巨噬細胞的吞噬功能；并促進溶血素生成，增加體液免疫的能力，促進脾淋巴細胞的增殖。二是防癌抗癌：能抑制黃曲霉素對大鼠的致肝癌作用；多糖對自然殺傷(NK)細胞活性有明顯的激活作用。三是具有抗氧化、抗病毒和降血脂等藥理作用。本實驗擬通過比較分析猴頭菇多糖對MDRV感染雛番鴨組織病變及細胞凋亡的影響，初步探討猴頭菇多糖抗病毒感染有效性的作用機制。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實驗動物 MDRV為福建農(nóng)林大學動物科學院預防獸醫(yī)學實驗室保存的YB分離株。雛鴨來源于福州某鴨場。

1.2 試驗分組 將100只1日齡的健康雛番鴨隨機分A、B、C、D和E組(即猴頭菇多糖高、中、低劑量組，病毒對照組和空白組)每組20只，空白組和其他各組分室隔離飼養(yǎng)。從1日齡起給藥組飲水添加給藥(高、中、低劑量組添加量為0.03%、0.02%、0.01%)直至剖殺之日結束給藥，飼喂雛鴨全價飼料，自由飲水采食。另取20只1日齡雛番鴨每只腿部肌肉注射YB株病毒0.6 mL，3日齡時，A、B、C和D組每組各放5只同居感染(此時定為同居感染第1 d)。

1.3 實驗中藥 猴頭菇多糖(含量80%左右)，上海朝翔技術有限公司惠贈。

1.4 臨床觀察 試驗期間每日進行臨床觀察，記錄臨床癥狀，統(tǒng)計并比較各組發(fā)病情況。

1.5 肝、脾的病理學觀察

1.5.1 剖檢觀察 同居感染后第2 d、6 d、9 d，12 d每組隨機抽取5只鴨心臟采血處死后剖殺，并對發(fā)病死亡的雛鴨剖檢，觀察并記錄各組肝和脾臟等器官的肉眼變化。

1.5.2 HE染色觀察 在剖檢的同時，按常規(guī)方法采取肝脾樣品，用4%的多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色光鏡觀察病記錄病理組織學變化。

1.5.3 細胞凋亡情況 在剖檢的同時，按常規(guī)方法采取肝、脾樣品，用4%的多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，用TUNEL法觀察細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)，以分析病毒感染后給藥組和不給藥組凋亡的變化規(guī)律。凋亡指數(shù)AP%=一定范圍內(nèi)的陽性細胞數(shù)/同一范圍內(nèi)細胞總數(shù)，每張切片在顯微鏡下隨機取5個視野(×400)，計算細胞凋亡指數(shù)，取其平均值[8]。

1.6 血液生化指標的檢測 用相同方法同居感染后12 d每組抽取10只鴨子心臟無菌采血，分離血清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性的測定采用賴氏法進行測定，試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司

1.6.2 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性的測定采用賴氏法進行測定，試劑盒均購自上海榮盛生物技術有限公司

1.7 數(shù)據(jù)處理 用SPSS11.5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用單因素方差分析進行顯著性檢驗。

2 結果

2.1 試驗各組臨床癥狀觀察結果及分析 同居感染各組都出現(xiàn)了比較典型的呼腸孤病毒感染的臨床癥狀。但從表1的數(shù)據(jù)顯示，猴頭菇高、中、低劑量組出現(xiàn)相應的臨床癥狀的時間比病毒對照組晚，其中高劑量組和病毒對照組相比差異不明顯，而中劑量組較明顯。對照組未觀察到臨床癥狀。

2.2 剖檢變化 隨著日齡增大同居感染各組表現(xiàn)出不同程度的肉眼變化，如同居感染第2 d病毒對照組脾臟開始腫大，表面及切面有大量灰白色壞死點。同居感染第6 d病毒對照組肝臟腫大，出血呈淡褐紅色，質(zhì)脆，表面及實質(zhì)有大量肉眼可見灰白色、大小不等的壞死點，有的甚至連成花斑狀。猴頭菇組的肝臟、脾臟有輕微腫大，但無明顯壞死點?？瞻捉M正常。初步結果表明，猴頭菇多糖對病毒感染后的肝脾有一定的保護作用。

表1 實驗各組出現(xiàn)臨床癥狀的時間分布情況Table 1 Time table of clinical symptoms in each group

2.3 HE染色結果分析 MDRV感染后，光學顯微鏡下觀察可見肝、脾、腎、法氏囊等都發(fā)生了不同程度的組織病理學變化，其中以肝和脾器官的出血及不同程度變性壞死為主要特征。肝臟：病毒對照組同居感染2 d后，病毒對照組感染番鴨肝細胞索結構出現(xiàn)紊亂，肝細胞空泡變性，有少量的炎性細胞和淋巴單核細胞浸潤。病毒對照組同居感染6 d后，肝細胞變圓，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，少量肝細胞核碎裂，肝靜脈周圍淋巴細胞大量浸潤，顯示肝細胞嚴重變性和壞死(圖1、圖3)。病毒對照組同居感染9 d后，肝細胞索結構完全消失，肝細胞呈廣泛性脂肪變性和空泡變性，嚴重的造成局灶性壞死，并見大量淋巴細胞、單核細胞浸潤，有些肝細胞間及匯管區(qū)血管周圍有多量的散在炎性細胞浸潤。猴頭菇組同居感染2 d后無明顯變化，在同居感染6 d后見肝細胞水泡變性，但無明顯壞死灶(圖2)。同居感染9 d后血管周圍有少量的散在炎性細胞浸潤(圖4)，但壞死灶很少。脾臟：病毒對照組同居感染2 d后，白髓區(qū)淋巴細胞數(shù)量明顯減少甚至消失，紅髓明顯充血。病毒對照組同居感染6 d后出現(xiàn)明顯的壞死灶(圖5)，并見少量因淋巴細胞消失留下的小空腔。猴頭菇多糖組同居感染6 d后可見白髓網(wǎng)狀細胞增生，淋巴細胞少量減少，壞死灶不多。同居感染9 d后，猴頭菇多糖組比病毒對照組的脾體積明顯增大、數(shù)量增多，淋巴細胞數(shù)目也有所恢復(圖6)。對照組番鴨肝脾臟組織結構正常，未見異常組織學病理變化。

2.4 TUNEL法標記檢測結果分析 MDRV感染后，用TUNEL法染色觀察可見肝、脾等組織都出現(xiàn)了不同程度的細胞凋亡，肝臟：病毒對照組同居感染2 d后，3個劑量的猴頭菇多糖組感染番鴨肝細胞均高于病毒對照組，同居感染后6 d，高、中、低猴頭菇多糖劑量呈下降趨勢，但仍高于病毒對照組，在同居感染后第9 d，高、中、低劑量猴頭菇多糖給藥組對應番鴨的肝細胞凋亡率開始低于病毒對照組。脾臟：病毒對照組同居感染2 d后，3個劑量的猴頭菇多糖給藥組感染番鴨脾細胞均高于病毒對照組，但病毒對照組的凋亡率曲線呈上升趨勢而3個劑量猴頭菇給藥組均有下降的趨勢。同居感染后6 d，病毒對照組的脾細胞凋亡率高于猴頭菇多糖高、中劑量給藥組，同居感染后第9 d、第12 d，病毒對照組感染番鴨的脾細胞的凋亡率均高于其他各組?？瞻捉M對應的肝脾細胞凋亡很少?？傊?，與病毒對照組相比，給藥組的肝脾在病毒感染早期細胞凋亡較多，在同居感染后期細胞凋亡較少，即猴頭菇多糖能促使呼腸孤病毒感染后誘導細胞凋亡的時間提前。具體如圖7，圖8所示：

2.5 血液生化指標的檢測 AST和ALT活性檢測：病毒感染后的番鴨血清的AST和ALT活性，與E組比較，A、B組差異不顯著，C組差異顯著(p＜0.05)，D組差異極顯著(p＜0.01)。 與D組比較，A、B、C組均差異顯著(p＜0.05)，E組差異極顯著(p＜0.01)。表明，病毒感染后，造成肝臟一定的損傷，患鴨血清的AST和ALT活性均有不同程度的升高，猴頭菇多糖高、中、低劑量均能在一定程度上降低患鴨血清的AST和ALT活性。

3 討論

目前真菌多糖的藥理作用已引起醫(yī)藥界的高度重視，國內(nèi)外對多糖研究證實，真菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等功能。如張秀娟等研究表明，靈芝多糖對T細胞及其亞群有明顯的影響，它可增加混合淋巴細胞培養(yǎng)中T細胞的回收量，在增加Lyt2+和L3T4+細胞回收量的同時，還可增強細胞毒T淋巴細胞(CTL)的殺傷功能[9]。唐省三等用猴頭菇、香菇、茯苓3種真菌的多糖，配以葡萄籽多酚和甘草酸，制成復合多糖，研究發(fā)現(xiàn)復合多糖可明顯升高S180肉瘤小鼠腹腔巨噬細胞的活性[10]。還有研究報道多糖對多種病毒，如艾滋病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、流感病毒等有抑制作用[11]。尤其在抗HIV方面，硫酸酯化多糖因為其活性明確，已成為近年來的研究熱點[12]。作為真菌多糖的一種，猴頭菇多糖具有抗衰老、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和降血脂等功能。目前MDRV感染番鴨的臨床治療效果還不甚理想。本實驗表明，添加猴頭菇多糖組的與病毒對照組相比，患鴨感染率和死亡率均有所下降。添加猴頭菇多糖組的番鴨感染呼腸孤病毒后，其脾臟等免疫組織的淋巴細胞數(shù)比病毒對照組均出現(xiàn)不同程度的恢復，脾小結的體積明顯增大、數(shù)量增多，肝脾的壞死灶減少。這與猴頭菇多糖能減輕病毒感染所引起的免疫抑制，促進免疫器官的恢復和發(fā)育有關。此外，猴頭菇多糖的抗氧化作用能清除體內(nèi)過量的自由基，減少其造成的組織損傷。這種解釋與他人研究表明的MDRV感染后引起免疫抑制的發(fā)病機制相一致。

表2 試驗鴨血清AST和ALT活性的變化Table 2 Changes of the serum AST and ATT activity in experimental ducklings

氨基轉(zhuǎn)移酶是目前應用最廣最有價值的實驗室檢測肝功能之一，是肝細胞損害的敏感指標。其中主要是ALT和AST。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶存在于肝、腎、心肌、骨骼肌、胰、脾、肺、紅細胞和血清中，以肝臟含量最高，主要存在于肝細胞漿中，肝內(nèi)含量約為血中的100倍，如果釋放的酶全部保持活力，只要1%的肝細胞壞死，可使血清酶活力增加1倍。AST主要分布于細胞漿和線粒體中，肝臟谷轉(zhuǎn)氨酶活性高于循環(huán)內(nèi)總活性的100000倍，因此血清轉(zhuǎn)氨酶活性變化可以反映肝細胞損害程度[13]。病毒感染后的番鴨血清的AST和ALT活性，與E組比較，A、B組差異不顯著，C組差異顯著(p＜0.05)，D組差異極顯著(p＜0.01)。與D組比較，A、B、C組均差異顯著(p＜0.05)，E組差異極顯著(p＜0.01)。說明猴頭菇多糖能在一定程度上減輕該病毒感染引起的肝臟損傷，輔助受損小鼠的肝功能的恢復。這與試驗猴頭菇多糖組比病毒對照組“肝白點”減少相一致。

但我們發(fā)現(xiàn)，猴頭菇多糖通過調(diào)整細胞凋亡對該病毒感染有一定的控制效果，攻毒各組均能誘導細胞凋亡，但多糖組比病毒對照組出現(xiàn)細胞凋亡的時間提前，這樣的“提前”意義重大，很可能是猴頭菇多糖抗病毒的一個重要原因，也可能成為中藥多糖通過調(diào)控細胞凋亡來防治病毒病的一個新思路。

病毒進入細胞后表達的一些病毒蛋白將會引發(fā)細胞的凋亡過程，而凋亡的發(fā)生對于病毒的大量復制顯然是非常不利的，同時也是對周圍未感染細胞的一種保護性機制。經(jīng)過長期的選擇和進化，很多病毒具有了抗凋亡的機制，為了完成其自身的復制周期，它們或者是通過表達病毒抗凋亡蛋白，或者是通過激活宿主的抗凋亡機制來阻止或者是延遲病毒感染的細胞發(fā)生凋亡，直到它們已經(jīng)產(chǎn)生足夠多的子代病毒。從病毒與宿主的相互作用來看，被病毒感染的細胞發(fā)生凋亡是機體抗病毒的一種防御機制，而病毒產(chǎn)物抑制或者延遲被感染細胞發(fā)生凋亡，則是病毒的一種生存機制[14]。有研究報道，腺病毒在感染過程的不同階段產(chǎn)生不同的凋亡調(diào)節(jié)蛋白：早期產(chǎn)生抑制蛋白，抑制靶細胞凋亡并促進病毒增殖；晚期產(chǎn)生凋亡誘導蛋白，致使靶細胞死亡并促進擴散[15]?？梢?，試驗猴頭菇多糖能在病毒感染早期克服病毒的抗凋亡的機制，誘導感染細胞與病毒“同歸于盡”，并且細胞凋亡不同于壞死，不會引起炎癥反應，這有利于清除病毒和保護其他未感染細胞。猴頭菇多糖還抑制感染后期的細胞過度凋亡，這樣既有利于防治病毒的擴散，也可以防止因感染后期免疫細胞大量凋亡而引起的免疫抑制。具體機制有待進一步研究，但通過多糖來調(diào)控細胞凋亡，從而控制病毒感染，這是抗病毒的一個新思路。

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