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    胸膜肺炎放線桿菌鐵離子攝取的分子機理

    2010-09-10 04:24:22肖國生黃小波曹三杰文心田
    中國預防獸醫(yī)學報 2010年1期
    關鍵詞:系統(tǒng)

    肖國生,李 娟,黃小波,曹三杰,文心田

    (1.重慶三峽學院生物系,重慶 404000;2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院基因芯片實驗室,四川雅安 625014)

    胸膜肺炎放線桿菌鐵離子攝取的分子機理

    肖國生1*,李 娟1,黃小波2,曹三杰2,文心田2

    (1.重慶三峽學院生物系,重慶 404000;2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院基因芯片實驗室,四川雅安 625014)

    胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)是豬胸膜肺炎的病原,可引起各種年齡的豬發(fā)病[1]。目前,App有2個生物型和15個血清型:1型~12型、15型為生物I型,13型和14型為生物II型[2]。所有血清型均能引起豬發(fā)生胸膜肺炎,但生物II型比生物I型的毒力弱,有些血清型毒力明顯更強[1,3]。App致病性強,可通過空氣傳播,各血清型之間交叉保護力低。因此,很難被有效控制,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

    App作為一種高致病性病原,引起豬發(fā)病需要經(jīng)過定植、逃避宿主防御和損傷宿主組織3個基本階段[1]。當該菌粘附于豬呼吸道上皮細胞后,其定居部分取決于細菌獲取生長所有必需營養(yǎng)成分的能力。鐵離子是細菌生長必需的元素,鐵離子常在Fe-S原子簇中與硫結合,作為不同功能酶的催化中心,參與呼吸、ATP合成、DNA復制和修復等。另外,鐵離子也是一種調控許多毒力因子表達的環(huán)境信號分子。但是,在宿主體內(nèi),胞外鐵離子常與糖蛋白、乳鐵蛋白和轉鐵蛋白等外分泌腺分泌物結合,而大部分胞內(nèi)鐵離子則以亞鐵血紅素的蛋白形式存在,如血紅蛋白(Hb)[2]。這種多方式螯合作用降低了自由鐵離子的濃度,其濃度可低于10-24M,遠低于維持細菌生長的水平(10-6~10-8M)[2,4]。App為了抵抗宿主對鐵離子的限制,能在宿主體內(nèi)生存,細菌表達多種與鐵離子攝取有關的因子,進化形成了多種具有高親和性的獲鐵系統(tǒng)以幫助它從豬體內(nèi)攝取生長所必需的鐵離子。這些獲鐵系統(tǒng)都是TonB依賴的,TonB作為能源有促進從細胞表面結合有鐵螯合物的外膜蛋白中鐵離子的吸收。轉鐵蛋白、Hb或嗜鐵素中的鐵離子跨外膜運輸都依賴于ExbB-ExbD-TonB系統(tǒng)。位于細胞質膜的Exb-TonB復合體將來自質子動力勢的能量轉移至外膜上的鐵受體,一旦配體與鐵受體結合,誘導構象發(fā)生變化,構象的變化給配體-受體發(fā)出信號,要求依賴TonB的能量轉移[2]。目前,從App中鑒定出2種TonB系統(tǒng):TonB1系統(tǒng)與tbpBA相關,其基因簇為tonB1-exbB1-exbD1,是該菌特有的;TonB2系統(tǒng)對于App生長在以血紅素、豬Hb或鐵色素(Ferrichrome)作為唯一鐵源是必需的,其基因簇為exbB2-exbD2-tonB2。TonB2毒力作用遠大于TonB1[5]。該菌充分利用宿主內(nèi)源性鐵(轉鐵蛋白、Hb)和外源性鐵源(嗜鐵素、螯合鐵),在能源系統(tǒng)和鐵攝取因子的幫助下通過獲鐵系統(tǒng)攝取鐵離子以克服在感染期缺鐵對細菌生存的影響[2,6-7],見圖 1。

    1 利用轉鐵結合蛋白攝取鐵離子

    App的轉鐵結合蛋白(Tbp)是一種結合轉鐵蛋白的受體,具有宿主專一性,只對豬的轉鐵蛋白具有特異性結合。這個鐵攝取系統(tǒng)由2個鐵離子可抑制性表面成分組成:一個是TbpA蛋白,也稱Tbp1或TfbB,分子量為100 ku,其功能是構成鐵離子通過外膜的跨膜通道;另一個蛋白是TbpB,也稱Tbp2或TfbA,分子量為60 ku,屬脂蛋白,錨定在外膜上,起輔助分子的作用[8-9]。TbpB在不同血清型間表現(xiàn)出高度的差異,具有型特異性免疫反應[6]。2種蛋白都可從細胞表面與豬轉鐵蛋白的C形部位結合,但只有這2種蛋白相互作用才能最佳利用轉鐵蛋白,并以此作為唯一鐵源[10]。TbpB也能與血紅素結合[9]。在該菌中tbpA和tbpB基因與exbBD1基因相連,呈共轉錄[5,11]。ExbB1和ExbD1形成一個內(nèi)膜蛋白復合體,與TonB1相連,為受體提供能量使鐵離子通過外膜,對于該菌利用轉鐵蛋白中的鐵離子是必需的。exbB1和tonB1雙轉座子突變株無毒力,說明ExbB1-exbD1-TonB1復合體在鐵離子攝取中扮演重要作用[12]。Tbps在該菌感染過程中表達卻下調[13]。因此,其它獲鐵系統(tǒng)在該菌感染后期是必要的。

    2 利用血紅蛋白受體攝取鐵離子

    在限鐵條件下,從App外膜蛋白中純化獲得2種分子量大約為75 ku和105 ku的血紅蛋白結合蛋白,為非脂蛋白[14]。75 ku蛋白除能結合Hb外還能結合血紅素,與其它革蘭氏陰性菌的鐵調控外膜蛋白、轉運蛋白和TonB依賴受體有一致性[2]。105 ku蛋白為App的血紅蛋白受體(HgbA),與巴氏桿菌科的HgbA有很高的同源性。hgbA基因長2 838 bp,蛋白分子量為104.9 ku,由946個氨基酸組成,含有一個23氨基酸的信號肽,HgbA突出于外膜的結構為環(huán)狀結構,可能具有與Hb和亞鐵血紅素結合的功能[15]。hgbA基因存在于所有1型~15型菌株中,具有保守性,而HgbA負責從Hb中獲取鐵離子。hgbA基因缺失突變株不能在僅有Hb作為鐵源的培養(yǎng)基中生長,Hb的利用被阻止[15,16],且其毒力減弱,HgbA對該菌的毒力起到了一定作用[17]。但HgbA是以何種方式將Hb中的血紅素轉運至周質,是否還需要其它蛋白共同介導血紅素的轉運仍不清楚。

    HgbA是App唯一的血紅蛋白受體,但不是唯一能結合Hb的物質,75 ku外膜蛋白和LPS也能與Hb發(fā)生結合[14,18]。Deslandes等研究該菌在限鐵環(huán)境下基因轉錄譜時發(fā)現(xiàn)了一個新的基因簇,由2個ORFs組成,它們與腦膜炎奈氏球菌(N.meningitides)的血紅蛋白受體(HmbR)有43%的一致性,HmbR對Hb具有高親和性,能剝奪Hb中的血紅素,然后將血紅素轉運到周質內(nèi)[19]。經(jīng)推定,胸膜肺炎線桿菌的HmbR的分子量為76.7 ku[19],與75 ku蛋白分子量接近。但App的HmbR是否與腦膜炎奈氏球菌的HmbR一樣參與鐵離子的獲取,與已知的75 ku蛋白是否為同種蛋白,待進一步證實。

    3 利用嗜鐵素受體攝取鐵離子

    App除可利用Tbp和HgbA 2個獲鐵系統(tǒng)從宿主內(nèi)源性含鐵物質中獲取鐵離子外,還可以利用嗜鐵素受體(FhuA)從含鐵的嗜鐵素中攝取鐵離子,從而滿足細菌生長的需要[7]。嗜鐵素(Siderophores)是好氧菌和兼性厭氧菌的一種產(chǎn)物,在低鐵離子條件下產(chǎn)生的,分子量小于1 ku,為特異的高親和性鐵螯合劑,能與乳鐵蛋白和轉鐵蛋白競爭鐵離子。Fhu系統(tǒng)也是TonB依賴,由fhuC、fhuD、fhuB和fhuA 4個基因組成一個Fhu操縱子,編碼的蛋白與大腸桿菌等其它幾種細菌的Fhu系統(tǒng)的蛋白同源[20]。fhuA基因長約2 088 bp,其推導的FhuA蛋白分子量為74.75 ku,為一種嗜鐵素受體,屬外膜蛋白,具有與TonB結合的結構,在體內(nèi)表達。與其它鐵攝取系統(tǒng)不同,細菌在低鐵離子的環(huán)境中生長其fhuA基因的表達并不上調,而且不被鐵離子調控[21]。fhuA在1型~15型中保守,fhuA突變株與原代株毒力沒有變化,說明不是App毒力的必要成分[17,22],但當fhuA缺失后其它鐵攝取系統(tǒng)不受影響,而鐵色素的吸收停止[21],F(xiàn)huA對細菌性外源異羥肟酸鐵(Ferric hydroxamate)類物質具有特異性[20]。fhuD基因長954 bp,編碼的FhuD蛋白分子量為35.6 ku,屬周質蛋白,負責將異羥肟酸鐵從外膜轉運至內(nèi)膜;fhuC基因長765 bp,編碼的FhuC蛋白分子量為28.5 ku,fhuB基因長1 953 bp,編碼的FhuB蛋白分子量為69.4 ku,F(xiàn)huC和FhuB屬質膜結合蛋白,為轉運體家族成員。FhuC和FhuB是將異羥肟酸鐵內(nèi)化的ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉運體的組件[17,20]。

    4 Yfe獲鐵系統(tǒng)

    Deslandes等研究發(fā)現(xiàn)在App中可能還存在一個Yfe-ABCD系統(tǒng),它的基因在限鐵時表達上調,其蛋白分別與多殺性巴氏桿菌的YfeABCD有63%、76%、75%和66%的同源性[19]。Yfe系統(tǒng)具有利用螯合鐵的功能[23]。App的Yfe系統(tǒng)的各基因排列與多殺性巴氏桿菌的同源基因不同,yfeB在yfeA的下游,在yfeA上游還有3個ORFs,緊接著反向有2個ORFs,命名為omp64,在第二個omp64下游160 kb才是yfeCD基因[19]。據(jù)推導,YfeA為螯合鐵ABC轉運體,屬周質結合蛋白,目前無法準確定位,但預測不會在胞質內(nèi);YfeB為螯合鐵轉運體,屬ATP結合蛋白;YfeCD為螯合鐵轉運組件,屬膜蛋白,位于胞質膜;Omp64為外膜蛋白,為TonB依賴性受體,位于細胞外膜。根據(jù)蛋白功能的推測,YfeABCD-Omp64可能是該菌一個新的獲鐵系統(tǒng),負責轉運螯合鐵中的鐵離子,但這個系統(tǒng)中各蛋白的更詳功能和定位尚不清楚。

    5 Afu轉運系統(tǒng)將鐵離子轉運至細胞質

    一旦鐵離子從外膜運至周質,要到達細胞質一般都由周質結合蛋白依賴的鐵轉運系統(tǒng)介導完成[1-2]。從App中鑒定出一個afuABC操縱子,它編碼一個ABC轉運系統(tǒng),與已知的周質結合蛋白依賴的鐵轉運系統(tǒng)同源[24]。afuA基因長1 041 bp,編碼的AfuA蛋白為周質鐵結合蛋白,由346氨基酸組成;afuB基因長2 064 bp,編碼的AfuB蛋白由663個氨基酸組成,有24個前導序列,是一個高疏水的胞質膜整合蛋白,含有2個一致的透明質酸酶基序,基序位于胞內(nèi)環(huán),與ATP結合蛋白相互作用;afuC基因長1 047 bp,編碼的AfuC蛋白由348個氨基酸組成,是一個親水的外周質膜蛋白,含有ATP結合基序[24]。仍不清楚該鐵轉運系統(tǒng)是否為該菌唯一一個負責轉運鐵離子通過胞質膜的鐵轉運系統(tǒng)。

    6 脂多糖(LPS)在App捕獲鐵離子中的作用

    LPS屬細胞表面多糖,已知含有3個區(qū):脂質A、寡糖核心和O-抗原。LPS主要起到粘附的毒力作用,使App粘附于豬呼吸道上皮細胞[1-2]。LPS除了具有粘附的毒力作用外,還能結合豬Hb[25]。O-抗原多變,與毒力無關,而寡糖核心是細菌粘附細胞的必需組件,LPS核心突變株則完全無毒[2,26],而與豬Hb結合的區(qū)域是脂質A[25]。LPS與豬Hb結合后能影響LPS某些物理和生物學特性,但與豬Hb結合的具體作用仍不清楚,也許LPS對豬Hb只是起到一個非特異性結合受體的作用,或在鐵轉運過程中起到一個“碼頭”作用,一旦LPS與豬Hb結合后,豬Hb被轉移到特異性受體上,如HgbA[18]。然而,LPS結合豬Hb后是如何參與隨后鐵離子的攝取和轉運,同時還需要哪些外膜蛋白和周質蛋白仍需進一步研究。

    7 Apx外毒素在細菌捕獲鐵離子中的作用

    App可以分泌4種不同的外毒素:ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIVA,它們是引起豬發(fā)病的最重要毒力因子[27-28]。ApxI(105 ku)具有強溶血活性和細胞毒性;ApxII(103 ku~105 ku)具有弱溶血活性和中等細胞毒性[27];ApxIII(120 ku)不能溶解豬紅細胞,但對肺泡巨噬細胞和多核白細胞有很強的細胞毒性[27];ApxIVA(170 ku~202 ku)只能在體內(nèi)表達,具有強免疫原性和弱溶血性[28]。Apx外毒素在該菌捕獲鐵離子過程的作用可能主要是裂解紅細胞釋放Hb和血紅素,為細菌提供必要的內(nèi)源性鐵源,然后通過HgbA、LPS和OMP等獲取其中的鐵離子。但是在轉錄表達研究中發(fā)現(xiàn),在限鐵離子環(huán)境下只有apxIC基因表達呈輕微上調,而apxIABD并不超表達[19]。

    8 其它可能與鐵離子攝取有關的因子

    隨著對App全基因組及其基因表達研究,發(fā)現(xiàn)有更多的基因參與鐵離子攝取和調控。Deslandes等研究發(fā)現(xiàn),該菌在限鐵離子環(huán)境下生長至少有210個基因表達存在差異,其中92個基因表達上調[19],可能還存在尚未被發(fā)現(xiàn)的鐵攝取系統(tǒng)和因子。在研究中他們還發(fā)現(xiàn)了一個由4個ORFs組成的基因簇,第一個ORF命名為fetB2,編碼一個獨特的蛋白,預測其定位于周質,與周質金屬結合蛋白TroA超家簇有相似性[19]。通過序列分析,與其它已知和推測的周質結合蛋白同源,許多同源的周質結合蛋白參與鐵離子的轉運。fetB2下游的3個ORFs可能編碼ABC轉運體的成分,下游第3個ORF可能編碼ATP酶的成分,可能定位于周質或細胞質內(nèi);其它2個ORFs可能位于周質內(nèi)[19]。fetB2是否為兒茶酚型嗜鐵素(Catecholtype siderophore)獲鐵系統(tǒng)的組成部分還需進一步鑒定[19]。

    9 結束語

    App能表達 Tbp、HgbA、LPS、OMP、Fhu、Afu和Yfe等多種因子參與鐵離子的攝取,進化形成了完善的鐵攝取系統(tǒng)來抵抗在感染過程中缺鐵對細菌生存造成的影響。在該菌中可能還存在其它尚未被發(fā)現(xiàn)的鐵離子攝取因子,并且在已知的這些因子中仍有許多功能并不十分清楚。例如,HgbA是以何種方式將Hb中的血紅素轉運至周質,是否還需要其它蛋白共同介導血紅素的轉運?LPS是以何種方式參與鐵離子的攝取,結合豬Hb的具體作用?75 ku外膜蛋白、HmbR、Yfe和FetB2等因子的具體功能和準確定位等都有待深入研究。通過對細菌鐵離子攝取因子及其機制的深入了解,將有助于闡明App的致病機理,獲得有效的免疫成分和采取有效的預防措施。

    [1]Bosse J T,Janson H,Sheehan B J,et al.Actinobacillus pleuropneumoniae:pathobiology and pathogenesis of infection[J].Microbes Infect,2002,4(2):225-235.

    [2]Jacques M.Surface polysaccharides and iron-uptake systems ofActinobacillus pleuropneumoniae[J].Can J Vet Res,2004,68(2):81-85.

    [3]Haesebrouck F,Chiers K,Van Overbeke I,et al.Actinobacillus pleuropneumoniaeinfections in pigs:the role of virulence factors in pathogenesis and protection[J].Vet Microbiol,1997,58(2-4):239-249.

    [4]Braun V.Iron uptake mechanisms and their regulation in pathogenic bacteria[J].Int J Med Microbiol,2001,291(2):67-79.

    [5]Beddek A J,Sheehan B J,Bosse J T,et al.Two TonB systems inActinobacillus pleuropneumoniae:their roles in iron acquisition and virulence[J].Infect Immun,2004,72(2):701-708.

    [6]Wilke M,Franz B,Gerlach G F.Characterization of a large transferrin-binding protein fromActinobacillus pleuropneumoniaeserotype 7[J].J Vet Med B,1997,44(2):73-86.

    [7]Diarra M S,Dolence J A,Dolence E K,et al.Growth ofActinobacillus pleuropneumoniaeis promoted by exogenous hydroxamate and catechol siderophores[J].Appl Environ Microbiol,1996,62(3):853-859.

    [8]Gonzalez G C,Yu R H,Rosteck P R,et al.Sequence,genetic analysis,and expression ofActinobacillus pleuropneumoniaetransferrin receptor genes[J].Microbiology,1995,141(Pt10):2405-2416.

    [9]Gerlach G F,Klashinsky S,Anderson C,et al.Characterization of two genes encoding distinct transferrin-binding proteins in differentActinobacillus pleuropneumoniaeisolates[J].Infect Immun,1992,60(8):3253-3261.

    [10]Fuller C A,Yu R,Irwin S W,et al.Biochemical evidence for a conserved interaction between bacterial transferrin binding protein A and transferrin binding protein B[J].Microb Pathog,1998,24(2):75-87.

    [11]Tonpitak W,Thiede S,Oswald W,et al.Actinobacillus pleuropneumoniaeiron transport:a set of exbBD genes is transcriptionally linked to the tbpB gene and required for utilization of transferrin-bound iron[J].Infect Immun,2000,68(3):1164-1170.

    [12]Fuller T E,Martin S,Teel J F,et al.Identification ofActinobacilluspleuropneumoniaevirulence genes using signature-tagged mutagenesis in a swine infection model[J].Microb Pathog,2000,29(1):39-51.

    [13]Hennig I,Teutenberg-Riedel B,Gerlach G F.Downregulation of a protectiveActinobacillus pleuropneumoniaeantigen during the course of infection[J].Microb Pathog,1999,26(2):53-63.

    [14]Archambault M,Labrie J,Rioux C R,et al.Identification and preliminary characterization of a 75 ku hemin-and hemoglobinbinding outer membrane protein ofActinobacillus pleuropneumoniaeserotype 1[J].Can J Vet Res,2003,67(4):271-277.

    [15]Pawelek P D,Coulton J W.Hemoglobin-binding protein HgbA in the outer membrane ofActinobacillus pleuropneumoniae:homology modelling reveals regions of potential interactions with hemoglobin and heme[J].J Mol Graph Model,2004,23(3):211-221.

    [16]Srikumar R,Mikael L G,Pawelek P D,et al.Molecular cloning of haemoglobin-binding protein HgbA in the outer membrane ofActinobacillus pleuropneumoniae[J].Microbiology,2004,150(Pt 6):1723-1734.

    [17]Shakarji L,Mikael L G,Srikumar R,et al.Fhua and HgbA,outer membrane proteins ofActinobacillus pleuropneumoniae:their role as virulence determinants[J].Can J Microbiol,2006,52(4):391-396.

    [18]Archambault M,Olivier M,Foiry B,et al.Effects of pig hemoglobin binding on some physical and biological properties ofActinobacillus pleuropneumoniaelipopolysaccharides[J].J Endotoxin Res,1997,4(1):53-65.

    [19]Deslandes V,Nash J H,Harel J,et al.Transcriptional profiling ofActinobacillus pleuropneumoniaeunder iron-restricted conditions[J].BMC Genomics,2007,8:72.

    [20]Mikael L G,Pawelek P D,Labrie J,et al.Molecular cloning and characterization of the ferric hydroxamate uptake(fhu)operon inActinobacillus pleuropneumoniae[J].Microbiology,2002,148(Pt 9):2869-2882.

    [21]Mikael L G,Srikumar R,Coulton J W,et al.fhuA ofActinobacillus pleuropneumoniaeencodes a ferrichrome receptor but is not regulated by iron[J].Infect Immun,2003,71(5):2911-2915.

    [22]Baltes N,Tonpitak W,Hennig-Pauka I,et al.Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype 7 siderophore receptor FhuA is not required for virulence[J].FEMS Microbiol Lett,2003,220(1):41-48.

    [23]Bearden S W,Staggs T M,Perry R D.An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11[J].J Bacteriol,1998,180(5):1135-1147.

    [24]Chin N,Frey J,Chang C F,et al.Identification of a locus involved in the utilization of iron byActinobacillus pleuropneumoniae[J].FEMS Microbiol Lett,1996,143(1):1-6.

    [25]Belanger M,Begin C,JacquesM.LipopolysaccharidesofActinobacillus pleuropneumoniaebind pig hemoglobin[J].Infect Immun,1995,63(2):656-662.

    [26]Rioux S,Galarneau C,Harel J,et al.Isolation and characterization of mini-Tn10 lipopolysaccharide mutants ofActinobacillus pleuropneumoniaeserotype 1[J].Can J Microbiol,1999,45(12):1017-1026.

    [27]Frey J.Virulence inActinobacillus pleuropneumoniaeand RTX toxins[J].Trends Microbiol,1995,3(7):257-261.

    [28]Schaller A,Kuhn R,Kuhnert P,et al.Characterization of apxIVA,a new RTX determinant ofActinobacillus pleuropneumoniae[J].Microbiology,1999,145(Pt 8):2105-2116.

    S852.61

    B

    1008-0589(2010)01-0077-04

    2008-11-01

    重慶市教育委員會科學技術研究項目(KJ081108);重慶三峽學院科研項目(2007-SXXYYB-02);重慶市萬州區(qū)科委項目(20081022)

    肖國生(1972-),男,重慶奉節(jié)人,博士,副教授,從事微生物與分子生物學研究.

    *通信作者:E-mail:xgs03@163.com

    (本文編輯:趙曉巖)

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