應(yīng)用Alamar Blue法與試管法測(cè)定α-倒捻子素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素體外抗結(jié)核桿菌活性

趙全民，于 錄，鄧旭明，王春雨，曾凡麗，王全凱*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130118；2.人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吉林大學(xué)人獸共患病研究所，吉林長(zhǎng)春130062)

結(jié)核病是影響人類的最重要的傳染性疾病，世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)2005年全球有8.8百萬人新增結(jié)核病例，其中7.4百萬人在亞洲和撒哈拉以南非洲，導(dǎo)致1.6百萬人死亡；在1980年到2005年間全球約有9千萬結(jié)核患者[1]。結(jié)核病的再次暴發(fā)與人類免疫缺陷病毒(HIV)的出現(xiàn)及耐藥結(jié)核菌的迅速傳播密切相關(guān)[2]，因此，急需開發(fā)有抗結(jié)核潛力的新型藥物。但是由于化學(xué)藥物的開發(fā)周期長(zhǎng)難度大，而來源于天然植物的中藥在治療結(jié)核病時(shí)具有毒性低，副作用小的特點(diǎn)，所以中藥在治療耐藥結(jié)核病方面將大有潛力，已受到越來越多的重視[3-5]。

α-倒捻子素(α-mangostin)是從藤黃科藤黃屬植物山竹子(Garcinia mangostana L.)果殼中分離出的主要生物活性化合物，具有消炎、殺菌、抗阿米巴痢疾和抗?jié)兊幕钚訹6-8]。8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-methoxypsoralen，8-MOP)為中藥補(bǔ)骨脂(Psoralea corylifolia L.)的有效成分之一[7]，8-MOP在臨床上已用于治療白癜風(fēng)及銀屑病等皮膚疾患[9]，并有報(bào)道表明8-MOP有抗微生物活性[10]。本研究通過2種藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法MABA分析與試管法同時(shí)測(cè)定分析α-倒捻子素和8-MOP對(duì)結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌能力，為這2種中藥提取化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用和抗分枝桿菌機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌 株 結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC 27294)、H37R(ATCC 25177)購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 培養(yǎng)基 Middlebrook 7H9肉湯為美國BD Difco公司產(chǎn)品。

1.3 試劑和藥物 α-倒捻子素購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；8-MOP、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(SM)購自美國Sigma公司；利福噴汀(RPT)、卷曲霉素(CAP)、氧氟沙星(OFX)、左氟沙星(LVX)購自中國藥品生物制品檢定所；利福布汀(RBT)購自凱森醫(yī)藥發(fā)展有限責(zé)任公司。INH、EMB和SM的貯存液在去離子水中準(zhǔn)備；環(huán)丙沙星和四環(huán)素在0.01 mol/L鹽酸溶液中準(zhǔn)備；其余藥物的貯存液在二甲亞砜(DMSO)中準(zhǔn)備，充分溶解后以0.22 μm濾膜過濾，-80℃保存。OADC(Oleic acid albumin dextrose catalase)購自美國BD Difco公司；Alamar blue solution購自美國Trek Diagnostics公司。

1.4 Alamar Blue法 在分析之前，在無菌Middle brook 7H9肉湯中稀釋?duì)?倒捻子素、8-MOP和其他9 種 藥 物 (INH、RFP、EMB、SM、RBT、CAP、OFX、LVX、RBT)至4倍最大期望最終檢測(cè)濃度。所有菌在37℃ Middle brook 7H9肉湯(含0.2%甘油和10%OADC)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將此菌液稀釋至1.0麥?zhǔn)瞎軡岫?，然后在Middlebrook 7H9肉湯中進(jìn)一步1∶20稀釋。

按照文獻(xiàn)介紹的Microplate Alamar Blue Assay(MABA)方法進(jìn)行藥物體外抗分枝桿菌活性測(cè)定[11]。簡(jiǎn)述如下：試驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，200 μL無菌水加入微板的外圍孔中。其他孔加入100 μL上述含甘油和OADC的Middlebrook 7H9肉湯，將100 μL工作濃度藥物注入每行的第一孔中，然后對(duì)藥物進(jìn)行二倍系列稀釋。將100 μL接種菌液加入所有檢測(cè)孔中以及無藥物對(duì)照孔中。每孔中DMSO的終濃度為1%(v/v)。同時(shí)，將菌懸液進(jìn)行10∶100和1∶100稀釋，用作10%和1%的細(xì)菌污染檢測(cè)。最后各藥物的檢測(cè)濃度范圍分別為：α-mangostin：6.25 μg/mL～200 μg/mL； 8-MOP： 4 μg/mL ～256 μg/mL； INH：0.0125 μg/mL～0.8 μg/mL；RFP：0.0125 μg/mL～0.4 μg/mL；SM：0.02 μg/mL～0.64 μg/mL；EMB：0.23 μg/mL～3.76 μg/mL；RFF：0.00625 μg/mL～0.2 μg/mL；RBT：0.00625μg/mL～0.2 μg/mL；OFX：0.125 μg/mL～2.0 μg/mL；LVX：0.125 μg/mL ～2.0 μg/mL；GTX：0.03 μg/mL～1.0 μg/mL；MFX：0.03 μg/mL ～1.0 μg/mL； CAP： 0.08 μg/mL ～1.28 μg/mL；CLF：0.03 μg/mL～0.48 μg/mL。37 ℃孵育5 d后，對(duì)照組加入20 μL of Alamar Blue溶液和 12 μL無菌 10%Tween 80，37℃再孵育 24 h。如果板孔變?yōu)榉奂t色，所有孔都以同樣方法加入Alamar Blue Tween溶液，并進(jìn)一步孵育24 h。有確切粉紅色的板孔定義為陽性生長(zhǎng)。最低抑菌濃度(MIC)定義為阻止顏色變?yōu)榉奂t色的最低藥物濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 試管二倍稀釋法 培養(yǎng)基為含0.025%瓊脂的7H9培養(yǎng)基。接種菌的制備、菌液濃度以及各藥物濃度均同上。置37℃培養(yǎng)，4周判定MIC結(jié)果。以無藥物對(duì)照生長(zhǎng)良好，而未見細(xì)菌生長(zhǎng)管的藥物濃度為MIC值。

上述2種方法平行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用相同的菌液和濃度以及藥物在同日內(nèi)操作，進(jìn)行3次。MIC結(jié)果為2次及2次以上相同的MIC值。

2 結(jié)果與討論

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，α-倒捻子素和8-MOP對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra都有很好的抗菌活性，α-倒捻子素對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra的MIC均為6.25 μg/mL。而8-MOP對(duì)結(jié)核分枝桿菌 H37Rv和 H37Ra的 MIC均為 128 μg/mL，H37Rv和H37Ra對(duì)2種藥物不具有耐藥性，而H37Rv相對(duì)于H37Ra對(duì)EMP和LVX 2種藥物存在耐藥性。2種藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法MABA分析與試管法測(cè)定11種藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra的MIC具體數(shù)值見表1。Alamar Blue法與試管法對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的結(jié)果符合率為90.9%(10/11)，2種方法對(duì)H37Ra的結(jié)果符合率也為90.9%(10/11)，均存在1種藥物的MIC結(jié)果在1個(gè)2倍稀釋度范圍內(nèi)的不一致。

表1 α-倒捻子素和8-MOP及陽性對(duì)照藥物抗結(jié)核分枝桿菌活性(μg/mL)Table 1 Antimycobacterial activity of α-mangostin and 8-methoxypsoralen compare to masculine medicine(μg/mL)

目前，植物提取化合物是開發(fā)抗微生物藥物尤其是抗結(jié)核分枝桿菌新型藥物的重要來源。已經(jīng)有多種方法用于植物提取化合物的敏感性檢測(cè)，如紙片法，比例法，及BACTEC 460系統(tǒng)等[12]，但是這些方法有各自的局限性，如費(fèi)用高、樣品需要量大或因耗時(shí)而至藥物變質(zhì)等。本研究使用的基于Alamar Blue微板分析方法是對(duì)純凈化合物和植物粗提物的最好藥敏檢測(cè)方法[13]，微板分析方法僅需要7 d就可以得到結(jié)果；另外，該方法每孔僅需要200 μL即可操作整個(gè)分析，而其他方法要使用9 mL～10 mL固體介質(zhì)。本研究的結(jié)果說明，Alamar B1ue方法測(cè)定藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗菌活性具有快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適用于新型抗結(jié)核化合物的大量篩選。

在本研究中，2種藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法MABA分析與試管法均表明，植物提取單體化合物α-倒捻子素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra均有很好的體外抗結(jié)核活性，有藥物開發(fā)潛力。我們正在通過分子生物學(xué)手段對(duì)它們的抗菌作用機(jī)制進(jìn)行研究。

[1]WHO Report.Global tuberculosis control-surveillance,planning financing[R].WHO/HTM/TB/2007.376.Geneva,Switzerland:WHO,2007.

[2]World Health Organisation.Anti-tuberculosis drug resistance in the world.Report no.2:prevalence and trends[R].WHO/CDS/TB/2000.278.Geneva,Switzerland:WHO,2000.

[3]蔣錦琴，黃衛(wèi)平.中藥結(jié)核丸對(duì)結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)外抗菌效果的觀察[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2005，6(23)：521-522.

[4]吳虢東，王玲.抗結(jié)核中藥的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，6(13)：475-477.

[5]盧潤生，鄭德福，李定越，等.某中藥抗結(jié)核菌藥物效果實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，5(34)：878-879.

[6]Ong H C,Nordiana M.Malay ethno-medico botany in Machang,Kelantan,Malaysia[J].Fitoterapia,1999,70(50):502.

[7]Suksamrarn S,Suwannapoch N.Xanthones from the green fruit hulls of Garcinia mangostana[J].J Nat Prod,2002,65(5):761.

[8]Harrison L J.Xanthones from the heartwood of Garcinia mangostana[J].Phytochemistry,2002,60(5):541.

[9]金萬寶，吳紅，關(guān)福蘭，等.8-甲氧基補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠離體肺動(dòng)脈的選擇性抑制作用[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，4(28)：52-54.

[10]Figueroa M,Rivero-Cruz I,Rivero-Cruz B,et a1.Constituents,biological activities and quality control parameters of the crude extract and essential oil from Arracacia tolucensis var.multifida[J].J Ethnopharmacol,2007,113:125-131.

[11]楊易燦.中藥光敏成分呋喃香豆精抗癌研究進(jìn)展[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，1988，12(2)：55-57.

[12]Caldwell C G,Franzblau S G,Suarez E,et a1.Oleanane triterpenes from Junillia tridens[J].J Nat Prod,2000,63:1611-1614.

[13]Jimenez-Arellanes A M,Meckes M,Ramirez R,et a1.Activity against multidrug-resistantMyocbacteriuntuberculosis in Mexican plants used to treat respiratory diseases[J].Phytotherapy Res,2003,17:903-908.