芝芪菌質(zhì)多糖的制備及其增強(qiáng)免疫活性的初步研究

唐 寧，張敦林，張李陽

(南京曉莊學(xué)院生命科學(xué)系，江蘇南京211171)

芝芪菌質(zhì)是由南京曉莊學(xué)院藥用菌物研究所采用雙向固體發(fā)酵技術(shù)，研制出的新型預(yù)防禽流感和促生長的飼料添加劑[1]。研究發(fā)現(xiàn)，芝芪菌質(zhì)作為飼料添加劑，可顯著促進(jìn)動物生長并提高動物免疫力。以復(fù)合基質(zhì)與中藥的混合基質(zhì)通過真菌發(fā)酵得到的發(fā)酵物作為飼料添加劑可顯著提高肉雞對H5亞型禽流感病毒的免疫力[2]，但其免疫活性成分尚未確定。前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)芝芪菌質(zhì)粗多糖具有明顯的免疫增強(qiáng)作用[3]，本研究對芝芪菌質(zhì)粗多糖進(jìn)一步分離純化，并初步檢測了4種純化多糖的免疫活性，以明確芝芪菌質(zhì)增強(qiáng)免疫力的活性成分。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑 芝芪菌質(zhì)由南京曉莊學(xué)院藥用菌物研究所提供；RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海博升生物科技有限公司；刀豆蛋白A(Con A)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自上海銳聰科技發(fā)展有限公司；Hank's液購自上海超研生物科技有限公司；YAC-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。白細(xì)胞介素2(IL-2)購自大連保稅區(qū)聯(lián)合博泰生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 小鼠，清潔級，體質(zhì)量為18 g～20 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 芝芪菌質(zhì)純化多糖的制備

1.3.1 粗多糖的提取 250 g芝芪菌質(zhì)用沸水提取，過濾，濾液濃縮后Seage法除蛋白質(zhì)，30%、60%、90%乙醇分級沉淀，無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，真空干燥，收集60%～90%乙醇沉淀的芝芪菌質(zhì)多糖粗品GAP902.604 g(前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，60%～90%乙醇沉淀多糖部分免疫活性最強(qiáng))。

1.3.2 多糖的分離純化及純度的鑒定[4]GAP90多糖粗品水溶液過硼酸型DEAE-32纖維素柱(3 cm×60 cm)，分別用水、0.l5 mol/L硼砂溶液、0.5 mol/L NaOH溶液洗脫，平衡流速22 mL/h，洗脫流速20 mL/h，洗脫液用硫酸-蒽酮法檢測，至無糖流出，根據(jù)洗脫曲線，分部收集各芝芪菌質(zhì)多糖洗脫液，得到4種純化多糖 GAP-1、GAP-2、GAP-3和 GAP-4。分別將洗脫液透析、濃縮、凍干。

采用Sephadex G-100凝膠柱色譜，供試品以0.1 mol/L NaCl溶液溶解，以0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，流速為18 mL/h。硫酸-蒽酮法跟蹤檢測糖含量，繪制洗脫曲線，鑒定多糖純度。

1.4 芝芪菌質(zhì)純化多糖的免疫活性初步測定

1.4.1 對小鼠脾細(xì)胞的增殖的影響 將4種純化多糖分別用三蒸水配制成1 mg/mL的多糖溶液。在無菌條件下，用無菌生理鹽水將多糖溶液分別稀釋成10-1mg/mL～10-8mg/mL 8個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)空白對照組。參照按照文獻(xiàn)[5]方法測定570 nm處測吸光度值(OD值)。

1.4.2 對NK細(xì)胞活性的影響 取96孔微量培養(yǎng)板，效靶細(xì)胞比采用50∶1，具體操作參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行，酶標(biāo)儀測定各孔OD490nm值。NK細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD490nm-自然釋放組OD490nm)/(最大釋放組OD490nm-自然釋放組OD490nm)×100%

1.4.3 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響[7]昆明種小鼠78只，隨機(jī)分為13組，每組6只，除對照組外，其他12組分別為芝芪菌質(zhì)多糖GAP-1、GAP-2、GAP-3和GAP-4的溶液低、中、高劑量組，腹腔注射，劑量濃度為25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg，對照組注射等量生理鹽水，每日1次。連續(xù)注射10 d后，迫殺小鼠。沿腹中線注入3 mL冰中預(yù)冷的無菌PBS-H(含10 U/mL肝素和100 g/L小牛血清的PBS)，輕輕按摩腹部5 min，剪開腹壁，吸出滲出液，再用同樣容量的預(yù)冷PBS-H沖洗腹腔，合并滲出液。用預(yù)冷的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌并懸浮細(xì)胞(106/mL)，即得巨噬細(xì)胞懸液。由雞翼下抽取靜脈血；加入5倍量的Alsever's液，用PBS將紅細(xì)胞比容配成5%的濃度制成雞紅細(xì)胞懸液；用巨噬細(xì)胞懸液1 mL，加入0.04 mL雞紅細(xì)胞懸液，1500 r/min離心5 min，棄上清。涂片，吉薩染色，計(jì)數(shù)，計(jì)算吞噬率。吞噬率(%)=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)×200個(gè)巨噬細(xì)胞-1)×100%

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS6.1統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Mantel-Haenszel卡方檢驗(yàn)(Chi-Square)比較對照組與給藥組差異的顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 芝芪菌質(zhì)純化多糖的制備和純度檢測 將60%～90%乙醇分級沉淀得到的芝芪菌質(zhì)多糖粗品GAP902.604 g溶于水，過硼酸型DEAE-32纖維素柱層析分離，分別用水、0.l5 mol/L硼砂溶液、0.5 mol/L NaOH溶液洗脫，得到4種芝芪菌質(zhì)多糖洗脫液，洗脫液透析、濃縮、凍干后得到4種純化多糖GAP-1(0.498 g)、 GAP-2(0.546 g)、 GAP-3(0.666 g)、GAP-4(0.390 g)。4種多糖均為棕褐色絮狀固體，易溶于水，不易潮解，無味，不溶于有機(jī)溶劑。采用Sephadex G-100凝膠柱色譜檢測，4種多糖組分洗脫曲線基本為單一對稱尖峰，表明供試品純度較高，可作為免疫活性測定供試品。

2.2 芝芪菌質(zhì)純化多糖免疫活性的測定

2.2.1 芝芪菌質(zhì)純化多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響4種芝芪菌質(zhì)純化多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表1，以O(shè)D570nm值表示細(xì)胞的增殖程度。4種GAP在10-4～10-1mg/mL濃度范圍內(nèi)能夠顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，在10-3～10-1mg/mL濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴效應(yīng)，其中GAP-3增殖效果最明顯。

2.2.2 芝芪菌質(zhì)純化多糖各組分對NK細(xì)胞活性的影響 如圖1所示，GAP-1、GAP-3和GAP-4在各濃度下均可明顯提高NK細(xì)胞的活性(p＜0.01)，GAP-3在濃度為100 μg/mL時(shí)，NK細(xì)胞的殺傷率為27%，與IL-2陽性對照組比較，有顯著增強(qiáng)作用(p＜0.05)。GAP-4單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，濃度為10 μg/mL和 100 μg/mL時(shí)較明顯地增加 NK細(xì)胞的活性，GAP-2在單獨(dú)應(yīng)用時(shí)則只在濃度為100 μg/mL時(shí)較明顯地增加NK細(xì)胞的活性。

2.2.3 芝芪菌質(zhì)純化多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響 由表2可以看出，4種GAP在25 mg/kg～100 mg/kg劑量范圍內(nèi)能夠顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活性，而且呈劑量依賴性。其中GAP-3增殖效果最明顯，100 mg/kg劑量時(shí)，巨噬細(xì)胞吞噬活性比對照組高出48.6%。

表1 MTT檢測4種芝芪菌質(zhì)純化多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響(OD570nm)Table 1 MTT assay of four purified polysaccharides on splenic lymphocyte proliferation of inoculated mice(OD570nm)

表2 4種芝芪菌質(zhì)純化多糖對巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響Table 2 Effect of four purified polysaccharides on macrophage activity(X±SD，n=6)

非特異性免疫是機(jī)體的第一道防線，作用快速而且范圍廣，而NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞因具有強(qiáng)大的吞噬殺傷功能，在機(jī)體的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)中都起重要的作用，是非特異性免疫的重要組成部分[8]。本研究將粗多糖GAP90過DEAE-32纖維素離子交換柱純化后得到4種純化多糖。初步實(shí)驗(yàn)表明，4種純化多糖均有較好的增強(qiáng)免疫活性作用，其中GAP-3的免疫活性最為顯著，可以認(rèn)定為靈芝發(fā)酵菌質(zhì)的活性成分之一，為靈芝發(fā)酵菌質(zhì)作為新型飼料添加劑提供了理論依據(jù)。

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