2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學(xué)調(diào)查

高玉龍，邵華斌，羅青平，潘 偉，秦立廷，孫芬芬，劉超男，高宏雷，祁小樂，王笑梅*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430065)

禽白血病(Avian Leukusis，AL)是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種重要傳染病，是由AL病毒(ALV)引起的以造血細(xì)胞增生為主的一類腫瘤疾病，包括淋巴細(xì)胞性白血病，成紅細(xì)胞性白血病，成髓細(xì)胞白血病和髓細(xì)胞樣白血病。該病自1908年首次報(bào)道并分離到ALV以來，世界上許多國家都有發(fā)生，但由于該病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失相對較小，并未受到重視。直到1988年，J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)發(fā)生[1]，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。該病的危害主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是直接發(fā)病，病雞產(chǎn)生腫瘤，最終死亡；二是導(dǎo)致感染雞產(chǎn)生免疫抑制，易造成發(fā)病雞繼發(fā)其它病原的多重感染，對疫苗免疫應(yīng)答差，嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能[3]；三是通過垂直傳播危害子代雞，所以祖代或父母代雞場一旦發(fā)病，將會嚴(yán)重影響雞雛的質(zhì)量。因此，ALV對養(yǎng)禽業(yè)造成的危害是多方面的。

禽白血病在我國已廣泛存在，近幾年該病的流行日趨嚴(yán)重，特別是自2009年初以來，湖北、山東等地雞白血病疑似病例頻發(fā)，雞群ALV的感染率高達(dá)60%，病死率高達(dá)50%以上。為了對此次ALV的流行情況和病毒分子特征進(jìn)行研究，我們先后對多個(gè)雞場進(jìn)行調(diào)研采樣，收集了大量疑似ALV的病料，本研究主要對采集到的病料進(jìn)行了檢測，并初步分析了發(fā)病雞群中ALVenv基因的分子特性。

1 材料和方法

1.1 病毒株及被檢樣品 ALV-J原型毒株HPRS-103、ALV-A標(biāo)準(zhǔn)毒株RAV-1和ALV-B標(biāo)準(zhǔn)毒株RAV-2為本實(shí)驗(yàn)室保存。被檢樣品為自2009年1月至11月初從湖北、山東、吉林、遼寧、黑龍江、安徽、寧夏、廣東8個(gè)省區(qū)39個(gè)養(yǎng)雞場采集發(fā)病雞雞的肝、脾、腫瘤等臟器采集共178份(詳見表2)。這些病料均為疑似ALV，發(fā)病日齡在50 d～200 d左右，品種有海蘭褐、羅曼、白羽肉雞、地方品種等，部分雞有內(nèi)臟腫瘤和血管瘤癥狀。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的HPRS103(Z46390.1)、 RAV-1(M19113.1)和 RAV-2(M14902.1)的基因序列，設(shè)計(jì)并合成4對引物(表1)，用于檢測ALV-A、B和J亞群以及擴(kuò)增ALV-J亞群的囊膜基因。引物由上海英俊公司合成。

1.3 前病毒基因組DNA提取 被檢樣品研磨后，按照常規(guī)方法提取DNA：取病料研磨液 100 μL，加入裂解液裂解后，靜止5 min～10 min；酚/氯仿/異戊醇抽提，75%乙醇洗滌，RNA酶消化后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 擴(kuò)增靶基因引物序列Table 1 Target ALV subgroup and oligonucleotide primers used in PCR assay

1.4 樣品的PCR檢測 以提取的前病毒基因組DNA為模板，分別用ALV-A、B和J亞群特異性引物 ALVAF和 ALVAR、ALVBF和 ALVBR、ALVJF和ALVJR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)鑒定后，回收目的片段，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取白色菌落，陽性質(zhì)粒送上海英駿公司測序。

1.5 ALV-J陽性樣品env基因的擴(kuò)增 對檢測ALV-J陽性的樣品用env基因特異性引物ALVJEnvF和ALVJEnvR擴(kuò)增囊膜基因。PCR產(chǎn)物連接到pMD 18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，選取陽性質(zhì)粒送上海英駿公司測序，序列用DNAStar、Clustal X和MEGA 3.1軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測結(jié)果 共檢測了8個(gè)省39個(gè)雞場的178份病料，這些病料多為疑似ALV病料。疑似ALV的雞場雛雞生長緩慢，蛋雞產(chǎn)蛋率偏低、死亡率較高。臨床癥狀主要有消瘦、精神沉郁、食欲不振癥狀，爪部、翅膀及頭部出現(xiàn)血管瘤等病變(圖1)。病雞剖解后，多數(shù)可見肝、脾腫大，部分有腎臟和腺胃腫大，有些在肝臟或脾臟有白色腫瘤(圖1)。

PCR檢測各雞場樣品結(jié)果見表2，結(jié)果表明：124份病料中檢出ALV-J，檢出率為69.7%；25份病料中檢出ALV-A，檢出率為13.9%；7份病料中檢出ALV-B，檢出率為3.9%。檢測的39個(gè)雞場中，有35個(gè)雞場檢測出ALV-J，陽性率為89.7%；有4個(gè)雞場檢測出ALV-A，陽性率為10.3%；有1個(gè)雞場檢測出ALV-B，陽性率為2.6%。

對ALV-J陽性樣品的gp85基因測序后，比較分析表明有3個(gè)毒株在669位～699位之間缺失30 bp。樣品間gp85基因的同源性為85.9%～99.9%，與ALV-J原型株HPRS-103的gp85基因的同源性為88.1%～98.2%。

2.2 ALV-J陽性樣品env基因序列分析 選取14個(gè)ALV-J陽性樣品測定了env基因序列。結(jié)果表明分離株的env基因核苷酸序列同源性為85.5%～99.3%，氨基酸同源性為84.3%～99%；與J亞群原型毒株HPRS-103的核苷酸同源性為87%～98.1%，氨基酸序列同源性為87.3%～98.2%；與其它J亞群env基因核苷酸序列的同源性為85.2%～97%，氨基酸序列同源性為83%～97.4%。遺傳進(jìn)化分析表明(圖2)，14個(gè)ALV-J分離株分別分屬于不同的分支。分離株LJL09DH02與其它分離株的遺傳距離最遠(yuǎn)，與HPRS-103的氨基酸同源性僅為87.3%。4個(gè)分離株(LLN09SY02、LLN09SY11、LSD09DP03和LSD09DP04)的env基因與HPRS-103的氨基酸同源性在93%以下，其他9個(gè)分離株的env基因與原型毒株HPRS-103的氨基酸同源性可達(dá)96.6%以上。

3 討論

根據(jù)病毒的宿主范圍及交叉中和試驗(yàn)等將ALV分為A～J 10個(gè)亞群，其中A～D和J為外源性病毒，E～I(xiàn)為內(nèi)源性病毒。A、B亞群是商業(yè)雞群中最為常見的外源性病毒亞群，而C、D亞群感染率極低，幾乎很難檢測到；ALV-J于1988年由Payne等首次從商品代肉用雞中分離[1]，ALV-J是一外源性ALV與禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜(E51)的重組體[4]，可以通過水平和垂直傳播在雞群中廣泛傳播。我國于1999年首先在江蘇和內(nèi)蒙古的肉雞群中發(fā)現(xiàn)有髓細(xì)胞性白血病，杜巖等在該病例中分離到ALV-J毒株，隨后山東、寧夏等地也有本病發(fā)生的報(bào)道[5-6]。近幾年的J亞群禽白血病的病例報(bào)道表明，發(fā)病日齡比最初報(bào)道的明顯提前。在本研究檢測的病料中，有50日齡的發(fā)病病例，并且表現(xiàn)有明顯的臨床癥狀，這表明ALV-J毒株的致病性明顯增強(qiáng)，自然感染時(shí)引起發(fā)病的日齡逐漸提前。另外，在檢測的178份病料中，ALV-J感染率高達(dá)69.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ALV-A和B亞群的感染。而且檢測的39個(gè)雞場中，有35個(gè)雞場是ALV-J陽性，雞群陽性率高達(dá)89.7%，表明我國目前ALV的感染主要以J亞群為主。另外檢測中還發(fā)現(xiàn)，ALV-A或ALV-B陽性的雞場同樣能檢測到ALV-J，感染率在3.9%～13.9%。

表2 樣品來源及檢測結(jié)果Table 2 Background of clinic samples and the ALV detection by PCR

以前認(rèn)為ALV-J主要引起肉用型雞發(fā)病，商品萊航雞雖然對ALV易感，但不產(chǎn)生腫瘤[7]。最近國內(nèi)的報(bào)道白表明蛋雞發(fā)生骨髓細(xì)胞瘤型J亞群禽白血病病例，該病造成蛋雞產(chǎn)蛋量下降，死亡率明顯增加[8]。ALV-J的宿主范圍逐漸擴(kuò)大，不僅局限于白羽肉雞感染發(fā)病，在蛋雞甚至我國地方品種麻雞也普遍發(fā)生[9-10]。以往報(bào)道ALV-J主要引起成年肉雞骨髓細(xì)胞瘤，但近些年陸續(xù)報(bào)道有血管瘤型J亞群禽白血病病例發(fā)生[11-12]，而且日趨更為常見。在本次調(diào)查中，發(fā)生J亞群禽白血病的雞群以蛋雞為主，發(fā)生血管瘤的病例占多數(shù)，個(gè)別雞場有50%以上的發(fā)病雞有血管瘤病變。

env基因與病毒的抗原性、組織親嗜性以及毒力密切相關(guān)，是ALV致腫瘤性的關(guān)鍵基因[13]。env基因的變異決定了ALV-J毒株的變異，不同ALV-J毒株間的env基因同源性差異很大，而且越是新近分離到的野毒株，其與1988年分離到的英國原型毒HPRS-103的同源性越小[14]。本研究分析了同一時(shí)間不同地區(qū)的14個(gè)分離株的env基因，發(fā)現(xiàn)部分分離株的env基因也表現(xiàn)出明顯的變異。根據(jù)變異程度將14個(gè)分離株分為 3類(I，II和 III)，LJL09DH02分離株屬于I類，env基因與HPRS-103的同源性僅為87.3%，而與2003年美國ALV-J毒株ADOL-7501的同源性低至83%。其它9個(gè)分離株屬于III類，其env基因與HPRS-103的同源性均在96.6%以上，另外4個(gè)分離株(II類)介于I和III類之間。這說明隨著病原長期進(jìn)化導(dǎo)致毒力和致瘤性等特性發(fā)生了改變，從而使得發(fā)病率、臨床腫瘤病變表現(xiàn)越來越多樣化。有關(guān)此次ALV流行，是否是由于病毒變異而引起，還有待于進(jìn)一步研究。

J亞群禽白血病不僅出現(xiàn)發(fā)病日齡提前，宿主范圍擴(kuò)大等特性，而且與其它免疫抑制病混合感染嚴(yán)重[15-16]。本次調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，不僅ALV感染率高，而且與其他免疫抑制病混合感染相當(dāng)嚴(yán)重(結(jié)果另文發(fā)表)。這次禽白血病的流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失，部分雞場面臨倒閉。因而有效防控ALV顯得尤為重要。目前尚無疫苗防制ALV的感染，只能通過防止垂直傳播和二次感染作為控制該病的手段。建議祖代雞場和父母代種雞場加強(qiáng)防控ALV重視程度，做好凈化工作，提高飼養(yǎng)管理水平，并加強(qiáng)日常獸醫(yī)衛(wèi)生管理和消毒措施，控制其它病原的混合感染。

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