HPLC法測(cè)定羅紅霉素分散片含量的測(cè)量不確定度分析

左登平，何亞瓊，汪正宇(.安徽宿州市藥品檢驗(yàn)所，宿州市34000；.安徽宿州衛(wèi)生學(xué)校，宿州市34000)

測(cè)量不確定度是指“表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)”，它是指測(cè)量客觀值在某一量值范圍內(nèi)的一個(gè)評(píng)定，不確定度越小，測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量越高，使用價(jià)值越大[1]。羅紅霉素是一種抗菌譜與紅霉素相似，不良反應(yīng)低于紅霉素的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性是評(píng)定藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)。本文根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》(二部)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]，并參考有關(guān)文獻(xiàn)[3，4]，應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)羅紅霉素分散片進(jìn)行含量測(cè)定的測(cè)量不確定度進(jìn)行分析，以期找出影響不確定度的因素來(lái)進(jìn)行評(píng)估，為該藥品的評(píng)價(jià)檢測(cè)報(bào)告提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10Atvp型高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10Atvp型紫外檢測(cè)器；電子天平(型號(hào):AB 135-S，d＝0.01 mg)。

羅紅霉素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):130557-200502，純度:94.1%)；羅紅霉素分散片(江蘇恒瑞股份有限公司，批號(hào):09121951，規(guī)格:0.15 g)；乙腈為色譜純，水為純化水，其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱:Phenomenex ODS C18(4.6 mm×150 mm、5μm)；流動(dòng)相:水-乙腈-冰醋酸(65∶35∶1)；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm；流速:1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量:20μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取羅紅霉素對(duì)照品適量(對(duì)照品1為24.40 mg，對(duì)照品2為24.30 mg)，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量(A樣97.60 mg，B樣93.50 mg)，置于50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 樣品測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，按外標(biāo)法(峰面積)計(jì)算含羅紅霉素96.8%。

2.5 測(cè)量數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測(cè)定原理和過(guò)程，含量計(jì)算公式為:

其中，Y:羅紅霉素分散片標(biāo)示量的百分含量；A樣:供試品峰面積；A對(duì):對(duì)照品峰面積；W對(duì):對(duì)照品重量(mg)；W樣:供試品重量(mg)；W:供試品平均片重(mg)；f對(duì):對(duì)照品稀釋倍數(shù)(mL)；f樣:供試品稀釋倍數(shù)(mL)；標(biāo)示量為0.15 g。導(dǎo)出方差:

3 不確定度分析

3.1 測(cè)量和分析不確定來(lái)源

3.1.1 玻璃儀器引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:(1)校準(zhǔn)。試驗(yàn)中所用玻璃儀器有:A級(jí)25 mL、50 mL量瓶，由文獻(xiàn)[5]得容量允差分別為±0.03 mL、±0.05 mL。由于標(biāo)定值比極限值出現(xiàn)的可能性更高，按三角分布，由允差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:u(25)＝0.03＝1.22×10－2mL、u(50)＝0.05/＝2.04×10－2。(2)溫度。量瓶和溶液的溫度與校正時(shí)溫度不同和實(shí)驗(yàn)室溫度變化而引起的體積不確定度。由于供試品溶液和對(duì)照品溶液是在相同條件下配制，溫差和溶劑的膨脹系數(shù)相同，故溫度引起的偏差被抵消。玻璃儀器引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(25)＝u(25)/25＝4.90×10－4、urel(50)＝u(50)/50＝4.08×10－4。

3.1.2 對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure(lW對(duì)):(1)天平稱量重復(fù)性不確定度。所用電子天平(d＝0.01 mg)的鑒定證書給出的重復(fù)性誤差為±0.02 mg，按矩形分布:W對(duì)－01＝0.02/＝2.08×10－2。(2)天平示值不確定度。所用電子天平的鑒定證書給出的最大允差為±0.1 mg，按矩形分布:W對(duì)－02＝0.1/＝6.93×10－2mg試驗(yàn)平行稱取對(duì)照品2份，每份對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:對(duì)照品1的ure(lW對(duì)a)＝，對(duì)照品2的urel(W對(duì)b)＝。所以，對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:10－3。

3.1.3 對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A對(duì)):(1)對(duì)照品溶液1測(cè)量5次，峰面積分別為1707730.6、1699434.0、1716899.2、1708867.0、1710052.1，平均峰面積A對(duì)1＝1708596.6，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD＝6241.55urel(A對(duì)1)＝SD/A對(duì)1＝6241.55/1708596.6＝3.65×10－4。(2)對(duì)照品溶液2測(cè)量5次，峰面積為:1711445.0、1711940.4、1687465.6、1697386.5、1709847.5，平均峰面積A對(duì)2＝1703617.0，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD＝10828.9同上可得:urel(A對(duì)2)＝SD/A對(duì)2＝10828.9/1703617.0＝6.36×10－3對(duì)照品溶液色譜峰面積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

3.1.4 對(duì)照品稀釋引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(f對(duì)):對(duì)照品配置過(guò)程中使用2個(gè)A級(jí)25 mL量瓶。由配置引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

3.1.5 對(duì)照品純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure(lS):對(duì)照品純度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(S)屬B類不確定度。羅紅霉素對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，純度為94.1%。由于目前沒(méi)有給出不確定度的其他說(shuō)明，故暫假定其分散區(qū)間的半寬度a＝0.25%[6]，按均勻分布換算:u(S)＝0.25%/＝0.14%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.1.6 供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure(lW樣):(1)天平稱量重復(fù)性不確定度。同“2.6.2(1)”項(xiàng)，W樣－01＝0.02/＝2.08×10－2。(2)天平示值不確定度。同“2.6.2(1)”項(xiàng)，W樣－02＝0.1/＝6.93×10－2。試驗(yàn)平行稱取供試品2份，每份供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:供試品A樣的ure(lW樣a)＝；供試品B樣的urel(W樣b)＝所以，供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:10－3。

3.1.7 平均片重的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel():(1)天平稱量重復(fù)性不確定度。同2.6.2中(1)項(xiàng)，u(1)＝2.08×10－2。(2)天平示值不確定度。同2.6.2中(2)項(xiàng):u(2)＝0.1=6.93×10－2，裝量差異實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，共使用天平20次，=282.1 mg。所以，裝量差異稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel()＝

3.1.8 供試品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A樣):(1)供試品溶液1測(cè)量峰面積5次:1866879.6、1870842.6、1869542.6、1870547.2、1866493.5，平均峰面積A樣1＝1868861.1，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD＝2047.29，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:urel(A樣1)＝SD/A樣1＝2047.29/1868861.1＝1.10×10－3。(2)供試品溶液2測(cè)量峰面積5次:1793703.4、1792799.8、1801896.3、1792561.2、1785297.3，平均峰面積A樣2＝1793251.6，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD＝5892.51，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:urel(A樣2)＝SD/A樣2＝5892.51/1793251.6＝7.33×10－4；供試品溶液色譜峰面積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.1.9 供試品稀釋引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(f樣):供試品配置過(guò)程中使用2個(gè)A級(jí)50 mL量瓶。由配置引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.2 計(jì)算合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的uC(Y)

3.3 計(jì)算擴(kuò)展不確定度u(Y)

取包含因子k＝2(近試95%的置信概率)[7]，擴(kuò)展不確定度為:u(Y)＝2uC(Y)＝1.6%。

3.4 不確定度測(cè)量報(bào)告及各分量所占比例

HPLC測(cè)定羅紅霉素分散片含量的測(cè)量結(jié)果可表示為:(96.8±1.6)%，各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度所占比例見(jiàn)表1。

表1 各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度所占比例Tab 1The precentage of the relative standard uncertainty

4 討論

由表1可見(jiàn)，在引起羅紅霉素分散片含量測(cè)定的不確定來(lái)源各分量中，對(duì)照品的峰面積、對(duì)照品稱量和供試品峰面積引起的不確定度分量所占比重較大。這主要是由于對(duì)照品和供試品稱量及儀器本身不穩(wěn)定等因素引起的。因此，在以后的試驗(yàn)中，可以通過(guò)增加測(cè)定次數(shù)和對(duì)照品的取樣量等措施來(lái)減少不確定度。另外，對(duì)照品和供試品稀釋倍數(shù)引起的不確定度分量所占比重相對(duì)較小。這可能與實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)對(duì)玻璃儀器的保養(yǎng)，使其保持穩(wěn)定的狀態(tài)有關(guān)，同時(shí)要求在實(shí)驗(yàn)中要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的控制以及加強(qiáng)基本操作、標(biāo)準(zhǔn)操作訓(xùn)練，以減少隨機(jī)變化和人為因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響。

本分析得出的擴(kuò)展不確定度為1.6%，表明結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠，本方法可用于測(cè)定羅紅霉素分散片含量的測(cè)量不確定度分析。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].WS-127(X-103)-2005(1).

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:1.

[3]中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)編.化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[M].北京:中國(guó)計(jì)量出版社，2002:1.

[4]魏吳.化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[M].北京:中國(guó)計(jì)量出版社，2002:11.

[5]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].JJG196-2006.

[6]黃諾嘉，楊文紅，黃奕濱.HPLC法測(cè)定蘆薈膠囊中蘆薈苷含量的不確定度評(píng)定[J].中國(guó)藥師，2009，12(9):1318.

[7]王玉，姚克榮.HPLC法測(cè)定非那雄胺片含量及含量均勻度的不確定度分析[J].藥物分析雜志，2005，25(10):1244.