核磁共振內(nèi)標法測定維生素C片中維生素C的含量

陳春麗，田蘭，馬曉麗，孟磊，李新霞(新疆醫(yī)科大學藥學院分析測試中心，烏魯木齊市830054)

維生素C作為維持機體正常生理功能的重要維生素之一，對人體健康有著重要的意義[1]。目前測定維生素C含量的方法很多，主要有滴定分析法、分光光度法、電極法、薄層色譜法、高效液相色譜法等。其中，滴定法操作簡單，但是滴定終點難以準確判斷；分光光度法操作費時；高效液相色譜法靈敏度高、選擇性好，但前期處理較復雜，定量時需要高純度物質(zhì)作對照。

藥物的核磁共振定量分析在我國已有多篇報道[2～6]，美國、英國、歐洲等國和地區(qū)藥典中都已先后引入了核磁共振定量分析方法[7，8]，但有關維生素的相關研究較少。筆者采用核磁共振內(nèi)標法對維生素C片中維生素C含量進行分析，以期建立核磁共振定量分析維生素C的方法。

1 儀器與試藥

Varian unity Inova 600 MHz超導核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；Mettler toledo AB135-S型分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；氘代DMSO(美國CIL公司生產(chǎn)，D2O氘代度＞99.8%，DMSO氘代度＞99.9%)；苯(天津市福晨化學試劑廠，分析純)；維生素C對照品(Sigma公司)；維生素C片(成都錦華藥業(yè)有限責任公司，批號:070505、070524、070613)。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

譜儀測定溫度:21℃；觀察頻率:599.951 MHz；譜寬:9599.2 Hz；脈沖寬度(pw):11.65 μs；采樣時間(at):2 s；延遲時間(d1):5 s；采樣次數(shù)(nt):32次。

2.2 供試品溶液配制

2.2.1 優(yōu)化儀器參數(shù)時的樣品配置:精密稱取維生素C對照品適量，置于5 mm核磁管中，并加入一定體積的內(nèi)標苯及適量的溶劑氘代DMSO，即可進行1H-NMR譜檢測。

2.2.2 定量分析時的樣品處理方法:精確稱取研磨后的維生素C片粉末適量，置于5 mm核磁管中，并加入一定體積的內(nèi)標苯及適量的溶劑氘代DMSO，超聲15 min，使其充分溶解，即得待測溶液。

2.3 譜儀操作方法

將裝有待測樣品的核磁管放入譜儀中，調(diào)整儀器參數(shù)，經(jīng)認真調(diào)諧、勻場、采樣得到1H-NMR譜，再進行譜圖的相位和基線調(diào)整，對樣品和內(nèi)標的定量峰分別進行5次積分，取其平均值，得到積分結(jié)果。

2.4 溶劑和內(nèi)標的選擇

維生素C具有烯醇式己糖內(nèi)酯立體結(jié)構(gòu)，為水溶性化合物，在水中易溶解，但溶劑為D2O時，內(nèi)標較難確定。本研究選用氘代DMSO為溶劑，苯為內(nèi)標，其化學式和1H-NMR譜見圖1。

由圖1可見，樣品、溶劑、內(nèi)標峰完全分離，表明三者未發(fā)生化學反應和產(chǎn)生締合。1H-NMR譜峰歸屬如下:δ11.03 ppm、δ8.31 ppm分別對應羥基1-H、2-H質(zhì)子信號，δ7.37 ppm為內(nèi)標苯的質(zhì)子信號，δ4.85 ppm為羥基3-H、4-H合并在一起的質(zhì)子信號，δ4.72 ppm、δ3.72 ppm分別為次甲基5-H、6-H質(zhì)子信號，δ3.41 ppm為亞甲基-CH2-的質(zhì)子信號，δ2.51 ppm為溶劑氘代DMSO的信號峰。

圖1 以苯為內(nèi)標時維生素C片在DMSO中的1H-NMR譜Fig 11H-NMR spectra of vitamin C with benzene as internal standard in DMSO

2.5 定量峰的選擇

待測藥片的1H-NMR譜見圖2。由于維生素C片中除了主藥外添加了其它輔料，導致譜圖中出現(xiàn)干擾峰，但化學位移為δ4.72 ppm處的雙峰、δ3.72 ppm處的多重峰受輔料影響不大，因此本試驗考慮選擇這2種峰作為樣品定量峰，積分面積分別為As1和As2。在氫譜中，苯只有一單峰，即為內(nèi)標定量峰面積積分為Ar，化學位移為δ7.37 ppm。

圖2 維生素C片的1H-NMR譜Fig 21H-NMR spectra of vitamin C tablets

2.6 儀器參數(shù)的優(yōu)化方法

2.6.1 pw的選擇:不同pw下的As/Ar值見表1。其他儀器參數(shù):nt＝16次，d1＝4 s，at＝1 s。

表1 不同pw對相對峰面積比的影響Tab 1Ratio of pw to As/Ar

由表1可見，隨著pw的增加，樣品定量峰與內(nèi)標定量峰的積分面積比值隨之增大，因此本試驗選取pw＝11.65 μs。

2.6.2 at的選擇:不同at下的As/Ar值見表2。其他儀器參數(shù):nt＝16次，d1＝4 s，pw＝11.65 μs。

表2 不同at對相對峰面積比的影響Tab 2Ratio of at to As/Ar

由表2可見，當at＝1～2 s時，所對應的As/Ar值較大，表明FID已衰減完全，故本試驗選取at＝2 s.

2.6.3 d1的選擇:不同d1下的As/Ar值見表3。其他儀器參數(shù):nt＝16次，at＝2 s，pw＝11.65 μs。

由表3可見，當d1＝5 s時，As/Ar最大，因此本試驗選取d1＝5 s。

表3 不同d1對相對峰面積比的影響Tab 3Ratio of d1 to As/Ar

2.6.4 nt的選擇:測定不同nt下的As/Ar值見表4。其他儀器參數(shù):d1＝5 s，at＝2 s，pw＝11.65 μs。

表4 不同nt對相對峰面積比的影響Tab 4Ratio of nt to As/Ar

由表4可見，As/Ar隨nt增大而增大，nt＞32次后增加趨勢不明顯，為了節(jié)省試驗時間、加快分析速度，本試驗選取nt＝32次。

2.7 1H-NMR譜內(nèi)標法測定維生素C

2.7.1 定量方法:從1H-NMR譜中讀取樣品定量峰和內(nèi)標定量峰積分面積，并用以下公式計算樣品的含量:

其中:As和Ar分別為被測樣品和內(nèi)標物質(zhì)選定定量峰的峰面積；ns和nr分別為被測樣品和內(nèi)標物質(zhì)定量峰包含的質(zhì)子數(shù)；Ms和Mr分別為被測樣品和內(nèi)標的摩爾質(zhì)量；vr為內(nèi)標的體積。

2.7.2 含量測定。制備含有不同質(zhì)量藥品(批號:070505)的待測樣品，分別測定1H-NMR譜，結(jié)果見表5。

表5 維生素C含量的核磁共振數(shù)據(jù)Tab 5The data of the content of vitamin C

由化學位移為δ4.72 ppm處信號峰峰面積As1計算結(jié)果為:5份樣品中維生素C的含量分別為39.1%、40.2%、39.8%、39.9%、41.4%，平均含量為40.1%，RSD＝1.38%。

由化學位移為δ3.72 ppm處信號峰峰面積As2計算結(jié)果為:5份樣品中維生素C的含量分別為41.2%、42.3%、41.9%、44.8%、43.5%，平均含量為42.74%，RSD＝3.54%。

2.7.3 重復性試驗。取3號樣品，在同一試驗條件下連續(xù)做5個1H-NMR譜，并計算維生素C與內(nèi)標的定量峰峰面積比值以考察試驗的重復性。結(jié)果，δ4.72 ppm、δ3.72 ppm處定量峰計算所得RSD分別為0.29%和0.76%，表明重復性較好。

2.7.4 回收率試驗。分別在2、3、4、5號樣中加入維生素C對照品8 mg，振蕩使其充分溶解后測定1H-NMR譜，定量峰確定為δ4.72 ppm處信號，計算回收率，平均值為100.9%。加樣回收率試驗數(shù)據(jù)見表6。

批號為070524、070613的樣品含量測定方法同上(定量峰δ4.72 ppm處為雙峰)，維生素C含量分別為43.6%、42.9%。

3 討論

由于核磁共振定量分析是以結(jié)構(gòu)分析為基礎的分析方法，結(jié)構(gòu)(包括構(gòu)型和構(gòu)象)分析、定性分析、定量分析可同步完成，方法自身具有簡單、準確、專一性高和不破壞樣品等優(yōu)點。

表6 加樣回收率試驗數(shù)據(jù)Tab 6Results of recovery test

1H-NMR譜法中內(nèi)標的作用不同于常規(guī)方法中內(nèi)標的作用。常規(guī)分析方法中，內(nèi)標的作用是減少最終帶入結(jié)果的操作誤差，而在此方法中，內(nèi)標是用以定量的依據(jù)。本研究曾選擇2，2，3，3-三甲基甲硅烷基丙酸(TSP)作為內(nèi)標，加入TSP后維生素C中的次甲基峰δ7.36 ppm位移至δ4.80 ppm，幾乎與水峰重疊。由此可知，內(nèi)標TSP與重水發(fā)生了締合，不適合作定量分析。由1H-NMR譜內(nèi)標法與高效液相定量分析方法相比，樣品用量小，前處理方法簡單，一般無需分離，定量時無需化合物的純品作為對照標準，可以對無對照品的藥品進行含量分析和質(zhì)量控制，結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析可同步完成，分析速度快。足夠的at可以保證自由感應衰減信號衰減完全，從而提高分辨率。而合適的d1可保證譜圖強度不會被飽和，有利于對譜峰進行正確的積分。在儀器測試狀態(tài)調(diào)整到最優(yōu)時，該法準確度和精密度可以接近高效液相色譜法。由本試驗數(shù)據(jù)可知，該法簡便、準確，可以用于維生素C的含量分析，也可為后續(xù)研究核磁共振定量分析其它藥物提供參考。

[1]張石革，孫定人.維生素缺乏癥與維生素的補充[J].中國藥房，2002，13(6):382.

[2]王強，汪茂田，張志權.核磁共振法定量測定替米考星含量[J].分析測試學報，2003，22(6):101.

[3]劉英，胡昌勤.核磁共振在抗生素藥物定量分析中的應用[J].藥物分析雜志，2001，21(6):447.

[4]沈文斌，王慶峰，廖海平.藥物對映體含量測定的核磁共振法研究Ⅰ.非洛地平[J].藥物分析雜志，1996，16(4):230.

[5]沈文斌，張燦，王文慶.四氫小檗堿對映體的核磁共振研究[J].中國藥科大學學報，1997，28(3):132.

[6]王慶峰，杭太俊，張正行.核磁共振法測定萘普生對映體相對含量[J].中國藥科大學學報，1999，30(1):31.

[7]United States Pharmacopoeia Commission.USP24/NF19:1221～1222.

[8]United States Pharmacopoeia Commission.USP24/NF19:1959～1965.