異源抗體對接方法預測流感病毒血凝素B細胞構象表位

梁 瑾，王靖飛*，吳春艷，馮寶龍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學繼續(xù)教育中心，黑龍江哈爾濱150030)

抗體通常能夠特異性地識別抗原蛋白質(zhì)表面的特定構象及空間位置，這些抗原蛋白表面的特定構象及空間位置就代表著抗原的表位，因此表位被定義為處于抗原表面維持這些特殊構象及位置的與抗體上抗原結合位點相互作用的氨基酸殘基[1]。表位根據(jù)與抗原受體結合的不同可分為B細胞表位和T細胞表位。B細胞表位是抗原中可被B細胞受體或抗體特異性識別并結合的線性片段或空間構象性結構。從空間結構分析，B細胞表位可分為連續(xù)性的線性表位和不連續(xù)性的空間構象性表位。線性表位，是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成；構象性表位，是由那些在空間結構上接近，但順序上不連續(xù)的氨基酸組成，具有高度的空間依賴性。表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎，準確的預測B細胞表位不僅有助于基礎免疫學研究，而且對疫苗的研究和開發(fā)、疾病的預防和診斷也有重要意義。

目前，絕大多數(shù)B細胞表位的預測方法都是基于蛋白質(zhì)的一級或二級結構，但這些方法只能用來預測由連續(xù)的氨基酸殘基構成的線性表位，而基于蛋白質(zhì)的三級結構的構象表位預測方法相對較少。分子對接是近幾年發(fā)展起來的從構象上研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法之一，主要用來分析分子間的相互作用模式，以及預測復合物結構[2]。分子對接一般分為剛性對接和柔性對接，剛性對接是基于蛋白質(zhì)相互作用界面的形狀互補，參與對接的分子構象不發(fā)生變化，僅改變分子的空間位置與姿態(tài)。柔性對接方法在對接過程中允許研究體系的構象發(fā)生自由變化?？贵w結合抗原的區(qū)域大都在互補決定區(qū)(CDR)區(qū)，CDR區(qū)主要與抗原表位發(fā)生相互作用，表位只有具有和CDR區(qū)結構互補的特征才更有利于與CDR區(qū)結合[3]。能否利用剛性分子對接技術來預測B細胞表位是一個值得探索的問題。

本研究選用了PDB數(shù)據(jù)庫中5個非流感病毒的抗體，同已知2個抗原表位的A/Aichi/2/68(H3N2)HA進行分子對接，分析這5個非流感病毒的抗體是否能預測出A/Aichi/2/68(H3N2)HA的2個已知的抗原表位，從而探索這種方法的可行性。

1 材料和方法

1.1 分子對接的受體和配體的準備 受體：從PDB數(shù)據(jù)庫中任意挑選了5個抗原抗體復合物晶體結構中的抗體作為受體，復合物分別為：艾滋病毒包膜糖蛋白GP120-單克隆抗體(MAb)復合物晶體結構(1G9M)、人鼻病毒外殼蛋白-MAb復合物晶體結構(1RVF)、朊病毒蛋白質(zhì)-MAb復合物(1TPX)、N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶-MAb復合物晶體結構(1NCA)、卵清溶菌酶-MAb復合物晶體結構(1A2Y)；配體：選用流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2)的HA三聚體結構即1HGF，取出其中的1個HA單體作為配體。

1.2 A/Aichi/2/68(H3N2)已知表位的確定 A/Aichi/2/68(H3N2)的HA抗原抗體復合物的晶體共有6個，分 別 為 1EO8[4]、 1QFU[5]、 1KEN[6]、 2VIT(2VIR 2VIS)[7]，這些晶體中抗體實際作用于2個表位：分別是1EO8、1QFU復合物中MAb所結合的表位及1KEN、2VIT(2VIS 2VIR)復合物中MAb所結合的表位。本研究將1EO8及2VIT的表位定義為A/Aichi/2/68(H3N2)的已知表位，用于預測結果的分析，分別定義為Epitope 1和Epitope 2。

1.3 受體和配體的處理 受體：1HGF為三聚體形式，取其單體形式，由于抗原表位在HA1上，為了增加運算速度，只保留HA1，存為1HGF-HA；配體1G9M、1RVF、1TPX、1NCA、1A2Y均為抗原抗體復合物，只保存其抗體，分別命名為1G9M-Ab、1RVF-Ab、1TPX-Ab 、1NCA-Ab、1A2Y-Ab。

1.4 抗體和HA的分子對接 在Discovery studio2.1軟件包中的Dock Proteins(ZDOCK)模塊中，1G9MAb、1RVF-Ab、1TPX-Ab 、1NCA-Ab、1A2Y-Ab分別與1HGF-HA通過ZDOCK進行分子對接[8]，其中抗體作為配體，而1HGF-HA作為受體。對受體和配體中不能參與表位形成的氨基酸做了對接限制。從ZDOCK輸出的文件中，所有的Pose都用Refine dock proteins(RDOCK)程序進行優(yōu)化[9]。

1.5 表位的確定 根據(jù)對X射線衍射所確定的抗原抗體復合物推斷，有3種對表位定義的方法[10]：(1)當抗體結合到抗原上后，抗原上的任何一個原子所屬殘基的表面可及性面積與原來相比增加了1埃，這樣的殘基可以被認為是表位殘基；(2)對接復合物中與抗體上任何原子的作用距離小于等于4埃的抗原上的任何原子所在的氨基酸殘基被認為是表位殘基；(3)對接復合物中與抗體上任何原子的作用距離小于等于5埃的抗原上的任何原子所在的氨基酸殘基被認為是表位殘基。但這3種不同表位定義的方法并不會造成結果上的差異。在本研究中我們選擇第2種確定表位的方法。一些研究者證明閾值設為4埃能夠準確的確定92%的表位殘基，并且僅有1%的非表位殘基被確定為表位殘基[11]。

1.6 預測結果分析 結果準確性分析主要通過對作用表面氨基酸的結構以及種類進行統(tǒng)計，前者利用Discovery studio2.1計算均方根偏差(RMSD)來衡量，后者則用預測結果中和實際表位一致的氨基酸數(shù)量除以已知表位相應氨基酸的數(shù)量獲得。

2 結果

2.1 預測表位的空間構象 將1G9M-Ab、1RVFAb、1TPX-Ab、1NCA-Ab、1A2Y-Ab 與 1HGF-HA對接后經(jīng)過RDOCK優(yōu)化的對接構象分別同1EO8、2VIT晶體結構重疊，做抗原抗體作用表面氨基酸殘基C-α原子的RMSD值，得到抗原抗體作用表面同晶體中的相應表面重疊最好的構象(圖1)及其RMSD值(表1)。從RMSD結果分析，所有通過對接方法確定的可能的B細胞表位與已知表位C-α原子之間的RMSD均小于0.6，表明對接結果同晶體結構中抗原抗體相互作用表面的氨基酸殘基在空間分布上很接近，即用這5個非流感病毒的抗體均對接到A/Aichi/2/68(H3N2)HA上與2個已知的抗原表位非常接近的氨基酸表面(圖2)。

表1 對接構象同1EO82VIT晶體結構重疊后的抗原抗體接觸表面氨基酸殘基C-α原子的均方根偏差Table 1 The Cα atoms RMSD calculation of interface residue after superimposition

2.2 預測抗原表位的氨基酸組成 A/Aichi/2/68(H3 N2)的 2個已知表位(Epitope 1、Epitope 2)分別為1EO8-Ab和2VIT-Ab抗體結合表位，其氨基酸數(shù)量分別為 15和 18。 1G9M-Ab、1RVF-Ab、1TPX-Ab、1NCA-Ab、1A2Y-Ab對A/Aichi/2/68(H3N2)HA的這2個表位預測的準確率在67%～100%之間，平均為77.6%，均高于60%，而且每個抗體均可結合到Epitope 1和Epitope 2。這些結果提示，用1個異源抗體可以對1個抗原蛋白上的不同B細胞表位進行預測；同時，不同的異源抗體也可以對1個抗原蛋白上同1個B細胞表位進行預測(表2、表3)。

表2 A/Aichi/2/68(H3N2)的HA的表位氨基酸組成及預測表位的氨基酸組成Table 2 The epitope residues of hemagglutinin of strain A/Aichi/2/68(H3N2)and the predicted epitope residues

表3 各抗體預測A/Aichi/2/68(H3N2)的HA的表位氨基酸的準確率Table 3 The accuracy of the predicted epitope of the strain A/Aichi/2/68(H3N2)

3 討論

對預測結果的評估主要從兩方面來進行，一方面是抗原抗體作用表面的RMSD值；RMSD值是在結構建模和預測中最為常用的指標，用來測量2個或多個結構數(shù)據(jù)之間的差異程度，RMSD值越小，則建?；蝾A測結果越可靠，Chen等認為預測構象同原晶體構象重疊之后，其蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用表面C-α原子的RMSD如果小于2.5埃，則可認為其預測結果是正確的[12]，從結果中可以看出使用非流感病毒抗體同流感病毒HA進行分子對接，最好的對接結果與原晶體結構重疊后抗原抗體作用表面氨基酸C-α原子的RMSD是小于2.5埃的，符合這個評判標準。另一方面是組成抗原表位的氨基酸殘基預測的準確性；Kulkarni-Kale等認為，如果大于等于60%的抗體結合位點的殘基被預測準確，那么這種預測結果就能被認為是正確的[13]。從結果中可以看出使用非流感病毒抗體同流感病毒HA進行分子對接，最好的對接結果的表位氨基酸殘基預測的準確性均大于60%，符合這個評判標準。

結果顯示，使用非流感病毒抗體能夠比較準確的預測流感病毒HA的抗原表位。但是如果我們在實際中應用這種方法，則會面臨一些問題：首先，最好的構象并不一定在最大的聚類中，比如以1TPX-Ab、1NCA-Ab、1A2Y-Ab為配體的最好的對接構象均不在最大的Cluster中，即使是在最大的Cluster中如以1RVF-Ab為配體的最好的對接構象也不是得分最高的Pose這將對我們篩選出能夠正確預測表位的構象造成一定的困難。其次，對接構象所預測的抗原表位殘基的數(shù)目均多于實際抗原表位殘基，這是由對接過程中抗原抗體的作用距離來決定的，由于僅僅根據(jù)形狀互補做剛性對接，限制條件比較少，因此抗原抗體的作用距離會比較近，則與抗體作用距離為4埃的抗原上的氨基酸殘基的數(shù)目就多，從而預測的抗原表位氨基酸殘基中會有一部分并不屬于真正的抗原表位，如何將這部分氨基酸篩去也是需要解決的問題。因此，如果將這種方法應用于實際中抗原表位的預測，還需增加篩選條件，來解決以上問題，從而提高預測的準確性。

由于目前預測表位方法的準確性均不高于40%[14]，我們期望找到一種能夠比較準確的預測表位的方法。本研究即通過剛性分子對接的方法，從構象上探測僅僅根據(jù)抗原抗體表面的形狀互補是否能準確預測抗原表位。結果表明，這種方法是可行的，并且最好的結果預測表位氨基酸的準確率高于60%。這一結果對以后建立一套完整的異源抗體預測抗原表位的方法具有一定的參考價值，并對正確而詳細地繪制抗原表位圖譜有著一定的指導意義。

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