沙苑子及其炮制品中沙苑子苷A和鼠李檸檬素的含量測(cè)定研究

孫建中， 張 懷， 賈天柱*， 張 希

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600;3.威海市中醫(yī)院，山東威海264200)

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪Astragalus complanatus R.Br.的干燥成熟種子［1］。具有溫補(bǔ)肝腎、固精、縮尿、益肝明目的功能。沙苑子的炮制工藝具有悠久的歷史，鹽炙法是沙苑子最常用的炮制方法?，F(xiàn)代研究表明，本品所含化學(xué)成分主要有氨基酸、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、脂肪酸以及微量元素等［2］。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)［3］記載，沙苑子苷A是沙苑子中主要的生物活性成分之一，具有保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝纖維化形成的作用;鼠李檸檬素對(duì)體外部分腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，而且都隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)［4］。目前還尚未見(jiàn)有同時(shí)測(cè)定沙苑子苷A和鼠李檸檬素的HPLC含量測(cè)定的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以沙苑子苷A和鼠李檸檬素為對(duì)照品，建立了其含量測(cè)定方法，同時(shí)考察了沙苑子炮制前后沙苑子苷A和鼠李檸檬素的變化情況，為沙苑子的炮制研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 series高效液相色譜儀(包括G1314 VWD檢測(cè)器、G1379A真空脫氣機(jī)、G1311A四元泵);LG燒烤型微波爐［S/NO303TA722082，型號(hào):WP700(MG-50037)，產(chǎn)品號(hào):MG-5003TW，額定電壓:220 V-50 HZ，輸出功率:700W，微波輸出功率:1050W，燒烤輸出功率:950W，震蕩頻率:2450 MHZ］;METTLER AE240型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士METTLER);FA1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng));KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);乙腈為色譜純，水為超純水。

沙苑子苷 A［5］、鼠李檸檬素對(duì)照品(自制，HPLC檢測(cè)純度＞99.0%，歸一化法);沙苑子購(gòu)于安徽瀘譙中藥飲片廠(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定教研室翟延君教授鑒定為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus R.Br.)的干燥成熟種子。

2 溶液制備

2.1 沙苑子及鹽沙苑子的炮制 經(jīng)初步篩選，確定沙苑子及鹽沙苑子炮制工藝如下:

A生品:取凈沙苑子50 g，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

B清炒品:取凈沙苑子50 g，置炒鍋中，鍋底溫度120～130℃，炒制60 s，放涼，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

C清水悶潤(rùn)炒干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL清水至密閉容器內(nèi)，悶潤(rùn)2 h，置炒鍋中，鍋底溫度120～130℃，炒制60 s，放涼，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

D鹽水悶潤(rùn)炒干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤(rùn)2 h，置炒鍋中，鍋底溫度120～130℃，炒制60 s，放涼，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

E鹽水悶潤(rùn)烘干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤(rùn)2 h，置于烘箱內(nèi)，溫度為60℃，烘干，4 h后取出，放涼，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

F鹽水悶潤(rùn)蒸后烘干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤(rùn)2 h，取出，置于蒸鍋中，圓氣后蒸60 min后取出，置于烘箱內(nèi)，溫度為60℃，烘干，4 h后取出，放涼，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

G鹽水悶潤(rùn)蒸后炒干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤(rùn)2 h，取出，置于蒸鍋中，圓氣后蒸60 min后取出，置于炒鍋內(nèi)，在鍋底溫度120～130℃下炒制60 s后取出，放涼，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

H鹽水悶潤(rùn)后微波品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤(rùn)2 h，取藥置于微波爐內(nèi)，高火微波6 min后取出，放涼，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取沙苑子苷A對(duì)照品0.00395 g，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，從中精密量取1 mL置于50 mL量瓶中配制成每 1 mL 含沙苑子苷 A0.0079 mg［4］的對(duì)照品溶液;另精密稱(chēng)取鼠李檸檬素對(duì)照品0.00413 g，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，從中精密量取1 mL置于50 mL量瓶中配制成每1 mL含鼠李檸檬素0.00826 mg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備［4］取上述沙苑子生品及炮制品1 g，精密稱(chēng)定，置50 mL三角瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，密塞，超聲30 min，靜置，濾過(guò)，濾紙不棄;同法再次精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，密塞，超聲30 min，靜置，用第一次的濾紙過(guò)濾，殘?jiān)鼡]干石油醚;連同濾紙一起放入三角瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，密塞，稱(chēng)重，超聲30 min，用60%乙醇補(bǔ)至原重，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為 Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.2%磷酸溶液(采用梯度洗脫的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈);流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為337 nm;沙苑子苷A和鼠李檸檬素的保留時(shí)間分別在10 min和30 min左右，且沙苑子苷A和鼠李檸檬素與相鄰成分色譜峰的分離度都在1.5以上，理論塔板數(shù)均大于4000。

分別精密吸取沙苑子苷A對(duì)照品溶液、鼠李檸檬素對(duì)照品溶液與供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，依上述色譜條件，測(cè)定，即得。HPLC圖見(jiàn)圖1。

4 線(xiàn)性關(guān)系考察

圖1 對(duì)照品(A)及沙苑子供試品(B)的HPLC圖

4.1 沙苑子苷A線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密稱(chēng)定沙苑子苷A對(duì)照品0.00395 g，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，從中精密量取1 mL置于5 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度配制成0.0790 mg/mL沙苑子苷A 的對(duì)照品溶液，分別精密吸取 4、8、12、16、20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明沙苑子苷A在0.3160 ～1.580 μg呈線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為 Y=112.14X+16.04，r=0.9999。

4.2 鼠李檸檬素線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密稱(chēng)定鼠李檸檬素對(duì)照品0.00413 g，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，從中精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度配制成0.0413 mg/mL鼠李檸檬素的對(duì)照品溶液，分別精密吸取 4、8、12、16、20 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明鼠李檸檬素在 0.1652 ～0.8260 μg呈線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為 Y=99.005X-2.2，r=0.9997。

5 精密度試驗(yàn)

精密吸取沙苑子苷A和鼠李檸檬素的對(duì)照品溶液各20 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果顯示沙苑子苷A和鼠李檸檬素的RSD分別為1.2%和 1.4%。

6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取沙苑子粉末1 g(過(guò)60目篩)，共6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果顯示沙苑子苷 A和鼠李檸檬素的 RSD分別為0.6%和1.5%，表明本試驗(yàn)測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取沙苑子粉末1 g(過(guò)60目篩)，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在 2、4、6、8、12 h 精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果顯示沙苑子苷A和鼠李檸檬素的RSD分別為0.9%和1.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在12 h內(nèi)供試品溶液化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量(沙苑子苷A和鼠李檸檬素的含量分別為0.0967%，0.0340%)的同一沙苑子正品藥材10 g，6份，分別精密加入沙苑子苷A對(duì)照品溶液(精密稱(chēng)取沙苑子苷A對(duì)照品11.00 mg，50%乙醇超聲溶解并定容至10 mL，即得)2 mL、鼠李檸檬素溶液(精密稱(chēng)取鼠李檸檬素對(duì)照品12.00 mg，甲醇超聲溶解并定容至10 mL，即得)2 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備溶液，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果平均回收率分別為 99.61%、98.98%;RSD 分別為 0.58%、1.28%。表明本法準(zhǔn)確度符合要求，見(jiàn)表1。

表1 沙苑子苷A、鼠李檸檬素回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

9 樣品含量測(cè)定

取上述沙苑子生品及炮制品粉末各1 g，精密稱(chēng)定，按上述色譜條件測(cè)定沙苑子苷A和鼠李檸檬素的含量，每個(gè)樣品皆平行測(cè)定3次，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，其平均值和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 沙苑子的含量測(cè)定結(jié)果

10 討論

10.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取沙苑子苷A對(duì)照品溶液和鼠李檸檬素對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在266 nm及337 nm處均有最大吸收，但在337 nm波長(zhǎng)下，干擾少，重現(xiàn)性好，故選擇337 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

10.2 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)、乙腈-0.4%磷酸 (20∶80)、乙腈-0.2%磷酸(采用梯度洗脫的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈)為流動(dòng)相進(jìn)行了比較，結(jié)果以乙腈-0.2%磷酸(采用梯度洗脫的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈)為流動(dòng)相所得峰形較好，分離度高，故選之。

10.3 方法的選擇 沙苑子種子中含油脂量高，需進(jìn)行脫脂處理，試驗(yàn)中篩選了石油醚(30～60℃)、石油醚(60～90℃)和乙醚3種試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用石油醚(60～90℃)超聲處理既有良好的脫脂效果，又能保留目標(biāo)成分。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還對(duì)供試品溶液的其他提取方法進(jìn)行了考察，最終確定了前述提取方法。

10.4 沙苑子苷A和鼠李檸檬素為苷和苷元的關(guān)系，沙苑子生品中沙苑子苷A的含量遠(yuǎn)高于鼠李檸檬素的含量;炮制品中兩者的含量變化皆不大，其中鹽炙沙苑子中沙苑子苷A和鼠李檸檬素的含量最高，分析其原因主要為在炮制加熱過(guò)程中酶解沙苑子苷A的自生酶被破壞，即“殺酶保苷”原理。而此酶在何種條件下完全失效以保苷以及何種條件下此酶活性最強(qiáng)以利用其苷元的抗腫瘤的作用，有待進(jìn)一步的研究。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:127.

［2］劉春宇，顧振綸.沙苑子的化學(xué)成分和藥理作用［J］.中國(guó)野生植物資源，2002，21(2):1.

［3］張建軍，閆興麗，張玉杰，等.HPLC測(cè)定沙苑子中沙苑子苷A的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30(8):600.

［4］甄漢深，周燕園，袁葉飛，等.青天葵中黃酮類(lèi)化合物的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(3):36.

［5］Cui Baoliang，Nakamura M，Kinjo J.Chemical Constituents of Astragali Semen［J］.Chem Pharm Bull，1993，41(1):178.