藏藥材蓮座薊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳 燕， 易進(jìn)海*， 德 吉， 劉倩伶

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；2.西藏自治區(qū)藏醫(yī)院，西藏 拉薩 850000）

蓮座薊為菊科植物蓮座薊Cirsium esculentum(Sievers)C.A.Mey.的全草。為藏、蒙族習(xí)用藥材，具有散瘀消腫，排膿托毒，止血的功效，用于治療肺膿腫，瘡癰腫毒，皮膚病，肝熱，各種出血［1-2］。主要分布在我國西藏、新疆、內(nèi)蒙古和東北等地，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》第一冊(cè)和《內(nèi)蒙古中草藥》。目前尚無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，其化學(xué)成分也未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的4批蓮座薊藥材化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)預(yù)試，采用3種不同的展開劑和流動(dòng)相對(duì)藥材進(jìn)行了薄層鑒別及HPLC圖譜的定位核對(duì)，發(fā)現(xiàn)蓮座薊藥材中含有綠原酸、蘆丁等化合物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道綠原酸、蘆丁具有抗炎、抗變態(tài)、抗病毒、解熱的作用［3-4］，與蓮座薊的功能主治相符。為此，參照《中國藥典》2005年版一部天山雪蓮項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，采用HPLC法測(cè)定蓮座薊藥材中綠原酸、蘆丁的含量，為蓮座薊藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

顯微鏡:日本奧林巴斯生物顯微鏡、尼康(NIKON)攝影顯微鏡，顯微描繪儀:香港萊卡顯微描繪儀、北京第三光學(xué)儀器廠顯微描繪目鏡。顯微制圖:采用顯微描繪儀繪制，然后取其主要顯微特征，組合成顯微特征圖版，最后采用硫酸紙描繪而成。Waters高效液相色譜儀:包括Waters1525泵，2487雙通道紫外檢測(cè)器，Waters柱溫箱，Breeze液相色譜工作站。Brasson超聲清洗儀。塞多利斯十萬分之一電子天平。

1.2 試劑與樣品

綠原酸、蘆丁對(duì)照品(批號(hào):110753- 200413；100080- 200306；中國藥品生物制品檢定所，含量測(cè)定用)。4批蓮座薊藥材由西藏自治區(qū)藏醫(yī)院提供，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定為菊科植物蓮座薊Cirsiumesculentum(Sievers)C.A.Mey.的干燥全草。甲醇為美國Tedia色譜純，水為超純水，硅膠G(青島海洋化工廠)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

本品粉末綠褐色。用間苯三酚、濃鹽酸染色，置顯微鏡下觀察。結(jié)果可見，本品冠毛主軸由多細(xì)胞組成，直徑36～78 μm；冠毛非腺毛細(xì)長(zhǎng)，單細(xì)胞，直徑22～39 μm，長(zhǎng)至640 μm。苞片表皮細(xì)胞表面觀呈長(zhǎng)條形，直徑10～27 μm，可見稀疏孔溝及斜紋孔。氣孔位于葉表面，呈橢圓形，直徑23～26 μm，不定細(xì)胞型。非腺毛由2～5個(gè)細(xì)胞組成，微彎曲，有的中部微溢縮狀，直徑11～18 μm?；ǚ哿５S棕色，類球形或闊橢圓形，直徑46～55 μm，外壁具鈍齒狀突起及細(xì)網(wǎng)狀雕紋，有的可見三萌發(fā)孔。導(dǎo)管網(wǎng)紋或螺紋，直徑10～65 μm。見圖1。

圖1 蓮座薊藥材顯微特征圖

2.2 薄層鑒別

取4批本品粗粉0.2 g，加甲醇2 mL，超聲處理20 min，靜置，上清液作為供試品溶液。另取蘆丁對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品，各加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，分別條狀點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 蓮座薊藥材TLC圖譜

2.3 綠原酸、蘆丁的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Luna C18(2)(4.6 mm ×150 mm，5 μm)；柱溫:30 ℃；流動(dòng)相:甲醇－1%冰醋酸溶液(32∶68)；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm；流速:1.0 mL/min。理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。在此色譜條件下，綠原酸、蘆丁對(duì)照品、蓮座薊藥材的HPLC圖譜見圖3。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 Hz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置5 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖3 蓮座薊藥材HPLC圖

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品5.34 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密稱取綠原酸對(duì)照品8.51 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL和綠原酸對(duì)照品溶液1.0 mL，置同一10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液(每1 mL中含蘆丁0.02136 mg和綠原酸0.03404 mg)。

2.3.4 線性關(guān)系 精密吸取綠原酸、蘆丁對(duì)照品混合溶液 2、4、6、8、10 μL，注入液相色譜儀中測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸的回歸方程為:Y=2978884.5X－6843，r=0.9997。蘆丁的回歸方程為:Y=4925938X －33651.8，r=0.9998。結(jié)果表明綠原酸在0.06808 ～0.3404 μg、蘆丁在 0.04272 ～0.2136 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取2.3.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液5 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，依法測(cè)定峰面積，結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.83%、0.91%。表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.3.2項(xiàng)下的供試品溶液(批號(hào):01)，精密吸取 10 μL，分別于室溫放置 0、1、2、4、6、24 h后注入液相色譜儀，依法測(cè)定峰面積，結(jié)果綠原酸和蘆丁峰面積穩(wěn)定，RSD分別為0.72%、0.88%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品粉末(批號(hào):01)5份，每份0.5 g，精密稱定，照2.3.2項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定峰面積，測(cè)得綠原酸和蘆丁的含量分別為0.3452%和0.1536%，RSD分別為1.09%和1.14%。表明試驗(yàn)方法良好。

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知綠原酸和蘆丁含量的樣品(批號(hào):01)粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入一定量的綠原酸對(duì)照品(0.3404 mg/mL)2.5 mL、蘆丁對(duì)照品(0.2136 mg/mL)2.0 mL，照含量測(cè)定項(xiàng)下操作，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，綠原酸平均回收率為97.66%，RSD為1.06%；蘆丁平均回收率為97.73%，RSD為1.14%。結(jié)果見表1。

表1 綠原酸和蘆丁加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.3.9 樣品含量測(cè)定 樣品4批，分別依2.3.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依法測(cè)定，綠原酸和蘆丁含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 蓮座薊藥材中綠原酸和蘆丁含量測(cè)定(n=3)

3 討論

提取方法的選擇 本試驗(yàn)對(duì)供試品溶液的不同提取方法(超聲、回流)，不同提取溶劑(甲醇、50%乙醇)及不同提取時(shí)間(20、45 min)分別進(jìn)行考察。結(jié)果50%乙醇25 mL超聲提取20 min綠原酸和蘆丁的含量均較高，雜質(zhì)峰較少，該法簡(jiǎn)便，可控性強(qiáng)。

蓮座薊的薄層色譜鑒別 曾參照2005年版一部天山雪蓮藥材的TLC展開條件乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10 ∶6 ∶1 ∶2)的上層溶液為展開劑［5］，對(duì)樣品進(jìn)行薄層色譜鑒別，發(fā)現(xiàn)色譜斑點(diǎn)間分離度較差，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，采用聚酰胺薄膜板上，以醋酸為展開劑，展開效果較好，薄層色譜斑點(diǎn)清晰、明確。

曾比較研究流動(dòng)相甲醇－0.4%磷酸(38∶62)和甲醇－1%冰醋酸溶液(32∶68)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸對(duì)峰形影響較大，拖尾嚴(yán)重，采用醋酸可改善此現(xiàn)象。

蓮座薊作為藏、蒙族地區(qū)常用藥材，其化學(xué)成分未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)該藥材的顯微鑒別、TLC及綠原酸和蘆丁的含量測(cè)定的研究，初步建立了該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為蓮座薊藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的參考方法。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì)編.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥第一冊(cè)［S］.1995:84.

［2］內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生局編.內(nèi)蒙古中草藥［M］.北京:內(nèi)蒙古自治區(qū)人民出版社，1972:42.

［3］吳衛(wèi)華，康 幀.綠原酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18:691-694.

［4］藏志和，曹麗萍.蘆丁藥理作用及制劑的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，26(7):760-768.

［5］中國藥典［S］.一部.2005:36.