虎杖提取工藝研究及RP-HPLC同時測定虎杖提取物中3個成分的含量

趙鴻賓， 陳華國，2， 周 欣，2*， 龔小見，2， 何 艷， 趙 楊

（1.貴州師范大學天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽 550001；2.貴州師范大學貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州 貴陽 550001）

中藥虎杖為蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)的干燥根和根莖，具有祛風利濕、散瘀定痛、止咳化痰等功效。根據(jù)文獻報道［2］，虎杖的有效成分主要為蒽醌類和二苯乙烯類化合物，其中二苯乙烯類中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷獨特功效引起人們的廣泛關(guān)注；蒽醌類中的大黃素、大黃素甲醚具有抗菌活性和保肝、瀉下作用，臨床應用極其廣泛。目前市場上已有以該植物入藥的中成藥制劑上市，如:天獅活力康膠囊，紫金膠囊，納貝益生膠囊等。隨著醫(yī)藥、化工和食品領(lǐng)域日益增長的需求，對虎杖提取物的需求量也越來越大。文獻關(guān)于白藜蘆醇的提取工藝研究較多，多以白藜蘆醇的含量為指標確定工藝條件，本實驗以白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的含量作為指標考查不同工藝的提取方法和富集方法，并在此基礎(chǔ)上建立了同時測定虎杖提取物中3個主要成分含量的RP-HPLC測定方法。

1 儀器、試劑與藥品

儀器:Agilent 1100高效液相色譜儀(四元泵，DAD檢測器，自動進樣器)；十萬分之一天平(梅特勒托利多)；試劑:甲醇(美國Tedia公司，色譜純；天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)；乙酸乙酯、石油醚(天津大茂化學試劑廠)；重蒸去離子水(實驗室制備)；對照品:白藜蘆醇(批號:111535-200502)、大黃素(批號:0756-9908)、大黃素甲醚(批號:0758-200206)均由中國藥品生物制品檢定所提供；樣品:虎杖提取物來自白藜蘆醇提取工藝所得提取物(1-7號樣品為40%乙醇提取后用石油醚-乙酸乙酯萃取，其余樣品為乙酸乙酯提取后用醇溶水沉除雜)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝路線 (見圖1)

圖1 工藝路線圖

2.2 含量測定方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；流動相:(A)H2O 與(C)CH3OH梯度洗脫；0～20 min，C(%)30→50；20 ～30 min，C(%)50→100；30 ～40 min，C(%)50→100，流速:1 mL/min；柱溫:30℃；檢測波長:303 nm；參比波長360 nm。在上述色譜條件下，供試品中的白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚完全達到基線分離，分離度大于1.5，按白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚峰計算理論板數(shù)均在4000以上。

2.2.2 對照品溶液的制備 取減壓干燥至恒重的白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含白藜蘆醇0.21 mg、大黃素0.04 mg和大黃素甲醚0.03 mg的混合對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取提取物10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，稱重，超聲處理15 min，放冷，搖勻，補足減失重量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.2項下的混合對照品溶液 0.5、1、2、5、10、15、20 μL，按 2.1 項色譜條件分別進樣分析，以對照品的進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程分別為:白藜蘆醇Y=4706.4X+43.323，r=0.9998，表明白藜蘆醇進樣量在0.105～4.2 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；大黃素Y=2595.9X+21.057，r=0.9995，表明大黃素進樣量在0.02～0.8 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；大黃素甲醚Y=2602.8X－2.5468，r=1.0000，表明大黃素甲醚進樣量在0.015～0.6 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下的混合對照品溶液20 μL，按上述色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積，計算平均相對標準偏差，結(jié)果白藜蘆醇RSD=1.8%，大黃素RSD=0.3%，大黃素甲醚RSD=0.2%，說明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 精密吸取 20 μL 注入液相色譜儀，測得峰面積，結(jié)果白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為1.2%、1.0%、1.3%，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批號樣品(編號8，乙酸乙酯回流提取)6份，按2.2.3項供試品溶液的制備方法分別制備供試液，測定3個成分的含量，結(jié)果白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為:24.7%、14.9%、3.4%；RSD分別為 1.02%、0.95%、0.87%，結(jié)果表明，該試驗重復性良好。

2.2.8 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱定已知含量的虎杖提取物，分別加入一定體積的白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按2.2.1項下的色譜條件進行測定，結(jié)果白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚回收率分別為98.9%、98.3%、102.3%，RSD分別為2.3%、1.8%、2.2%(見表1～3)。

表1 白藜蘆醇回收率實驗結(jié)果

表2 大黃素回收率實驗結(jié)果

表3 大黃素甲醚回收率實驗結(jié)果

2.2.9 樣品測定 取10批虎杖提取物，按照上述含量測定方法測定，測定結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果(n=3)

2.2.10 主成分分析(PCA) 對2.1項下不同提取工藝所得提取物樣品進行主成分分析，分析結(jié)果如下(見圖3):

圖3 PCA圖

由主成分分析結(jié)果可見:10個提取工藝被分為兩類，工藝8、9、10分為一類，其余為一類。

2.2.11 聚類分析(HCA) 對2.1項下不同提取工藝所得提取物樣品進行主成分分析，分析結(jié)果如下(見圖4):

由聚類分析結(jié)果可見:10個提取工藝被分為兩類，即工藝2、3、5分為B類，其余為A類；在A類中工藝8單獨為一類，即A-2類，其余為A-l類。

圖4 HCA圖

3 討論

3.1 通過對2.1項下不同提取工藝所得提取物進行主成分分析，結(jié)果顯示選用40%乙醇與乙酸乙酯作為提取溶劑，白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的提取率和在提取物中含量有較大差異，采用乙酸乙酯提取時，3個成分的提取率和含量相對較高。而在聚類分析中，大致分為兩類，即A、B類；在A類中，8、9、10 號樣品采用乙酸乙酯提取，在 B 類中，2、5、3號樣品采用40%乙醇回流，同樣顯示了提取溶劑對提取效果的影響較大，結(jié)果是選用乙酸乙酯提取效果較好。

3.2 通過分析可知，醇溶水沉(9、10號樣品)對粗提物中各成分的含量影響不大，而選用石油醚-乙酸乙酯進行萃取有助于白藜蘆醇的純化，減小有機溶劑的極性(1、2、3號樣品)可同時提高3種成分的含量，而白藜蘆醇的含量變化最大，由此可知提取物中水溶性的成分含量較高。通過對4、5號樣品結(jié)果分析表明萃取過程中乳化現(xiàn)象對各成分的含量會有較大影響，所以為防止乳化可對粗提物進行浸提。

3.3 本工藝在前人的基礎(chǔ)上進行了改進，既提高了提取物中有效成分的含量，又使工藝簡單化；此含量測定方法能準確、快速地測定虎杖提取物中白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的含量，且分離效果好，可用于虎杖提取物質(zhì)量控制。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:145.

［2］劉 丹，湯海峰，張三奇，等.虎杖中有效成分提取方法的研究［J］. 中成藥，2007，29(4):516-521.

［3］齊 輝，張 勉，王崢濤.HPLC同時測定虎杖中4種成分的含量［J］. 中國中藥雜志，2006，31(23):2003-2005.

［4］江 曙，朱蓉蓉，張 芳，等.虎杖中白藜蘆醇提取方法及工藝的優(yōu)化［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2006，22(3):197-199.

［5］楊漢榮，李來生，陳雄泉.高效液相色譜法測定虎杖中白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和游離大黃素［J］.理化檢驗 －化學分冊，2008，44(3):234-236.