藍(lán)莓葉總黃酮提取物的定性分析和抗油脂氧化

李穎暢，孫建華，孟憲軍

(1.渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161)

油脂在氧化過(guò)程中會(huì)形成大量的自由基，進(jìn)一步分解生成醛、酮、醌、游離脂肪酸等有害物質(zhì)，產(chǎn)生酸敗，從而降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。油脂含量高的食品需添加抗氧化劑來(lái)防止脂肪氧化，目前常用的抗氧化劑均為人工合成，如BHA(丁基羥基茴香醚)、BHT(二丁基羥基甲苯)和PG(沒(méi)食子酸丙酯)，實(shí)驗(yàn)證明人工合成抗氧化劑對(duì)人體有一定的毒副作用[1-3]，近年來(lái)上述化學(xué)合成抗氧化劑被發(fā)現(xiàn)有不同程度的累積致癌作用，目前BHT在美國(guó)和日本已被禁止使用，BHA在日本也已經(jīng)禁用，以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品添加劑的發(fā)展趨勢(shì)。

藍(lán)莓，又稱越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)多年生落葉或常綠灌木[4]。藍(lán)莓作為一種藥用植物，以葉入藥，性溫、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于風(fēng)濕、痛風(fēng)[5]。藍(lán)莓葉中含有豐富的黃酮類化合物，大量研究證明黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥等廣泛的生物活性[6-10]。我國(guó)有著豐富的藍(lán)莓資源，但對(duì)藍(lán)莓葉的加工利用極少，大部分當(dāng)做廢棄物，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。目前藍(lán)莓葉總黃酮的研究主要集中在提取和抗腫瘤等方面[11-12]，但作為油脂的抗氧化劑尚未見(jiàn)報(bào)道，研究開(kāi)發(fā)高效、安全、保健的天然抗氧化劑，使其在食品工業(yè)得到廣泛應(yīng)用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究藍(lán)莓葉總黃酮抗油脂和脂質(zhì)體氧化能力，旨在為進(jìn)一步利用藍(lán)莓葉資源提供有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藍(lán)莓葉總黃酮提取物：將藍(lán)莓葉(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)院藍(lán)莓種植基地提供) 50℃烘干，粉碎后過(guò)40目篩，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液按1:20(m/V) 50℃浸提2h后抽濾，收集濾液，濃縮，石油醚脫脂，AB-8大孔樹(shù)脂純化，40℃減壓濃縮，真空干燥得到黃色粉末，純度為78.04%[13]。

豬油：新鮮豬板油熬制。

無(wú)水乙醇 北京化學(xué)試劑公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸 沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫代巴比妥酸、抗壞血酸、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于95.5%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大豆卵磷脂(生化試劑) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；BHT(食品級(jí)) 濟(jì)南世紀(jì)聯(lián)興經(jīng)貿(mào)有限公司；HPD-600大孔樹(shù)脂 河北寶恩化工有限公司。

7200可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯有限公司；UV-1600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；PHS-25型酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋常州國(guó)華電器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；SHZ-IIIB型循環(huán)水真空泵 上海華琦科學(xué)儀器有限公司；玻璃層析柱(1cm×30cm) 上海青浦滬西儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津?qū)嶒?yàn)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)莓葉提取物的定性檢驗(yàn)

氨顯色反應(yīng)、 鋁鹽反應(yīng)、 鐵鹽反應(yīng)參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行測(cè)定。

藍(lán)莓葉總黃酮的紫外-可見(jiàn)吸收光譜：分別稱取一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和藍(lán)莓葉總黃酮，用70%乙醇溶液溶解，定容至50mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液1mL，放置6min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1mL，放置6min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液10mL，加去離子水至刻度，搖勻，放置15min，在波長(zhǎng)400～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.2 藍(lán)莓葉總黃酮抗豬油氧化性能研究

不同添加量藍(lán)莓葉總黃酮的抗豬油氧化性能研究：準(zhǔn)確稱取一定量藍(lán)莓葉精制總黃酮、BHT，分別加入到50g豬油中，攪拌均勻。同時(shí)以不加添加物的豬油作空白。將所有樣品放置于(60±1)℃的干燥箱中，每隔一定時(shí)間攪拌一次，并交換它們?cè)诟稍锵渲械奈恢谩０凑誈B 5538—2005《油脂過(guò)氧化值測(cè)定方法》測(cè)定過(guò)氧化值(POV)，以POV大小表示油脂的氧化速度，POV值以每千克樣品中活性氧的毫摩爾數(shù)表示，進(jìn)而衡量抗氧化劑的活性。

藍(lán)莓葉總黃酮與其他物質(zhì)的協(xié)同抗氧化作用：選用抗壞血酸(VC)、檸檬酸為協(xié)同增效劑，與藍(lán)莓葉總黃酮在豬油中進(jìn)行協(xié)同抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 藍(lán)莓葉總黃酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定[15-16]

1.2.3.1 試液的配制

脂質(zhì)體PBS(磷酸緩沖液)分散系：300mg卵磷脂溶解于30mL 10mmol/L pH7.4 PBS(磷酸緩沖液)，用超聲波處理一定時(shí)間，周圍以冰水冷卻，制得人工脂質(zhì)體。

三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液：15g TCA、0.37g TBA、2.1mL濃鹽酸依次放入100mL水中。

1.2.3.2 測(cè)定步驟

分別于樣品管中依次加入1mL脂質(zhì)體分散系、1mL 0.4mmol/L硫酸亞鐵、1mL樣品，混勻。避光于37℃水浴60min，加入2mL TCA-TBA-HCl混合液，90～100℃水浴15min，迅速冷卻，以3000r/min離心l0min，取上清液在波長(zhǎng)535nm處測(cè)定吸光度(As)。對(duì)照管以1mL重蒸水代替1mL樣品，操作方法同樣品管，可測(cè)得對(duì)照管的吸光度(Ac)，參比管中以1mL重蒸水代替1mL卵磷脂，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：Ac為對(duì)照吸光度；As為藍(lán)莓葉總黃酮樣品吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類物質(zhì)定性檢驗(yàn)

氨顯色反應(yīng)：將藍(lán)莓葉乙醇提取液滴于濾紙上風(fēng)干，以揮發(fā)氨熏濾紙，立刻產(chǎn)生了深黃的顏色，當(dāng)濾紙放置久后，因氨的揮發(fā)而褪色，這是黃酮類化合物的典型反應(yīng)。

鋁鹽反應(yīng)：向藍(lán)莓葉乙醇提取液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%三氯化鋁溶液，有一種黃色可溶性物質(zhì)生成，可使溶液吸光度增大，說(shuō)明有黃酮類物質(zhì)存在。

鐵鹽反應(yīng)：向藍(lán)莓葉乙醇提取液中加入氯化鐵溶液后，生成了墨綠色的沉淀， 放置一段時(shí)間之后溶液的顏色基本褪去，由此說(shuō)明藍(lán)莓葉提取物中含有酚基。酚基是黃酮類化合物的官能團(tuán)之一，故判斷藍(lán)莓葉提取物屬于黃酮類。

2.2 藍(lán)莓葉總黃酮的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析

按1.2.1節(jié)加入顯色劑，對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮和蘆丁進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描可知(圖1)，藍(lán)莓葉總黃酮和蘆丁的可見(jiàn)吸收光譜相一致，在波長(zhǎng)400～800nm處有吸收，最大吸收波長(zhǎng)為500nm，由此說(shuō)明藍(lán)莓葉提取物中有蘆丁，屬于黃酮類物質(zhì)。

圖1 藍(lán)莓葉總黃酮的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of flavonoids from blueberry leaves

2.3 不同添加量藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)豬油的抗氧化作用

油脂暴露在空氣中易氧化形成自由基，自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使油脂繼續(xù)氧化?？梢詼y(cè)定油脂的POV來(lái)評(píng)價(jià)其氧化程度，POV越高，氧化程度越高。由圖2可以看出，藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)豬油有明顯的抗氧化作用，隨著藍(lán)莓葉總黃酮添加量的增加，其對(duì)豬油的抗氧化作用增強(qiáng)，時(shí)間越長(zhǎng)，效果越顯著，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%精制總黃酮抗豬油氧化能力較強(qiáng)，略低于添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%BHT。藍(lán)莓葉總黃酮抗豬油氧化性原因是黃酮類化合物作為還原體，失去氫離子，提供給氧化過(guò)程中的自由基，使其形成惰性化合物，從而終止豬油的氧化。藍(lán)莓葉總黃酮作為油脂的天然抗氧化劑是可行的，具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

圖2 不同添加量藍(lán)莓葉總黃酮抗豬油氧化性能Fig.2 Protecting effects of the refined folavonoid extract from blueberry leaves at different dosages against the lipid oxidation in lard

2.4 藍(lán)莓葉總黃酮與其他物質(zhì)的協(xié)同抗豬油氧化作用

圖3 藍(lán)莓葉總黃酮與抗壞血酸、檸檬酸混合使用抗氧化性能的比較Fig.3 Synergistic protecting effects between ascorbic acid or citric acid and the extract against the lipid oxidation in lard

從圖3可以看出，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%藍(lán)莓葉總黃酮分別和0.05%檸檬酸、0.05%抗壞血酸合用的抗氧化性高于0.1%藍(lán)莓葉總黃酮的抗氧化性，低于0.02% BHT的抗氧化性。檸檬酸、抗壞血酸對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮有協(xié)同增效作用，并且抗壞血酸的增效作用強(qiáng)于檸檬酸。檸檬酸對(duì)金屬離子有鰲合作用，形成金屬鹽，能促進(jìn)氧化的微量金屬離子鈍化，不再具有催化能力，從而降低了油脂的氧化作用。抗壞血酸除具有一定的抗氧化作用外，還具有很強(qiáng)的還原性，可與油脂中的氧反應(yīng)生成脫氫抗壞血酸，降低油脂中氧濃度，減緩自動(dòng)氧化反應(yīng)的速度；抗壞血酸的強(qiáng)還原性可使酚類抗氧化劑生成的酚氧自由基還原，使酚類抗氧化劑再生，抗氧化劑與抗壞血酸合用可充分地發(fā)揮其協(xié)同抗氧化作用。

2.5 藍(lán)莓葉總黃酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力

圖4 藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig.4 Inhibition effects of the crude extract from blueberry leaves and its refined counterpart against the lipid peroxidation in soybean lecithin liposomes

由圖4可見(jiàn)，由Fe2+引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體體系中，藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)脂質(zhì)體有明顯的抑制作用，抑制率隨總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增大。不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)脂質(zhì)體過(guò)氧化的抑制率差異顯著，精制總黃酮對(duì)脂質(zhì)體的抑制作用明顯高于粗總黃酮。當(dāng)精制總黃酮質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí)，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率為33.36%，當(dāng)精制總黃酮的質(zhì)量濃度為100μg/mL時(shí)，抑制率已達(dá)到83.36%，再增加精制總黃酮質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率增長(zhǎng)緩慢。藍(lán)莓葉總黃酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力明顯優(yōu)于抗壞血酸(圖5)。精制總黃酮的IC50為67.46 μg/mL，粗黃酮的IC50為121.65μg/mL，抗壞血酸IC50為4.74mg/mL。

圖5 抗壞血酸對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition effect of ascorbic acid against the lipid peroxidation in soybean lecithin liposomes

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定性檢驗(yàn)確定藍(lán)莓葉提取物的主要組分是總黃酮，并通過(guò)測(cè)定豬油的過(guò)氧化值和對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率研究藍(lán)莓葉總黃酮的抗油脂氧化能力。藍(lán)莓葉總黃酮具有抗豬油氧化能力，且有劑量效應(yīng)關(guān)系，0.4%精制總黃酮抗豬油抗氧化能力較強(qiáng)，略次于0.02%BHT?？箟难帷幟仕釋?duì)藍(lán)莓葉總黃酮均具有協(xié)同增效作用。藍(lán)莓葉總黃酮具有抗脂質(zhì)體過(guò)氧化能力，隨著總黃酮溶液質(zhì)量濃度逐漸增大，抑制能力逐漸增強(qiáng)，并且明顯優(yōu)于抗壞血酸。藍(lán)莓葉精制總黃酮IC50為67.46 μg/mL，藍(lán)莓葉粗總黃酮的IC50為121.65μg/mL，抗壞血酸IC50為4.74mg/mL。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定藍(lán)莓葉總黃酮抗氧化效果弱于合成抗氧化劑BHT，這可能與藍(lán)莓葉總黃酮的純度及其含有的總黃酮種類有關(guān)，若進(jìn)一步提高藍(lán)莓葉黃酮純度，抗氧化性能將更強(qiáng)。研究和開(kāi)發(fā)藍(lán)莓葉資源，使其總黃酮類物質(zhì)成為合成抗氧化劑替代品，具有重要意義。

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