纖維素酶和果膠酶對番茄紅素提取的影響

袁春龍，張 金

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

纖維素酶和果膠酶對番茄紅素提取的影響

袁春龍1,2，張 金1

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

以番茄組織為材料，用含體積分數2%二氯甲烷的石油醚為提取溶劑，研究添加果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的實驗。結果表明，果膠酶和纖維素酶混合使用比單一酶的提取效率高，且果膠酶的提取效果比纖維素酶要好。在果膠酶和纖維素酶混合質量比為2:1時，提取番茄紅素的最佳條件為A3B2C2D4，即混合酶用量0.6g/100g、酶解溫度35℃、pH5.0、酶解時間5h，然后2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min離心10min。因此，添加果膠酶和纖維素酶，用2%二氯甲烷的石油醚提取，可以提高番茄紅素的提取率。

番茄紅素；纖維素酶；果膠酶

番茄紅素(lycopene)是一種在動植物體中廣泛分布的類胡蘿卜素(carotenoids)，呈紅色，因最先發(fā)現于番茄中而得名。過去番茄紅素由于不具備VA的活性，而被認為是一種不重要的類胡蘿卜素，一直未被重視。然而，近年來，隨著人們健康意識的提高，以及新的科學技術的發(fā)展，研究人員發(fā)現番茄紅素具有抗氧化、消除人體自由基、防癌、抗癌[1-3]、抗衰老、預防心血管疾病[4-5]、防輻射及紫外線、提高男性生育能力等多種生理功能，其抗氧化性在類胡蘿卜素中最強，防癌、抗癌的效果明顯優(yōu)于α-和β-胡蘿卜素(carotene)，是一種很有發(fā)展前途的功能性天然色素[5-6]。

目前，我國番茄紅素的生產和研究均處于起步階段，其生產工藝上主要有浸提法[7-8]、酶反應法[9]和超臨界CO2流體萃取法[10-12]、高速逆流色譜法、微波輻射萃取法及利用工程菌株發(fā)酵法生產番茄紅素[13-14]。浸提法常用有機溶劑乙酸乙酯、氯仿等；酶反應法采用外加纖維素酶等來提高番茄紅素的提取速度和提取量；超臨界CO2流體萃取法具有能耗低、無毒、易回收、可低溫處理等優(yōu)點，得到的番茄紅素無異味，無溶劑殘留，提取番茄紅素的收率可達90%以上，但成本過高，不適合大規(guī)模生產；高速逆流色譜法、微波輻射萃取法及利用工程菌株發(fā)酵法，仍處在實驗研究階段。本實驗通過外源添加果膠酶、纖維素酶，研究混合酶用量及其比例、酶促反應的溫度、pH值及酶解時間對番茄紅素提取率的影響，并通過正交試驗獲得提取番茄紅素的最佳工藝，為合理充分利用番茄資源，提取番茄紅素提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

番茄(新鮮、成熟) 楊凌某農貿市場。

果膠酶(酶活力≥10萬U/g) 天津市酶制劑廠；纖維素酶(酶活力≥8萬U/g) 上海東風生化技術有限公司；85%磷酸、96%氫氧化鈉、99%二氯甲烷、石油醚(沸程60～90℃)(均為分析純) 西安化學試劑廠。

高速組織搗碎機 深圳泰康達科技有限公司；PH-29A型酸度計 北京賽多利斯儀器系統有限公司；恒溫電熱水浴鍋 北京長風儀器儀表廠；SP2102UV紫外-可見光光度計 上海江星儀器有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠；恒溫水浴鍋 北京泰克儀器公司。

1.2 方法

新鮮番茄清洗并稱其質量，在100℃左右的水浴中熱燙去皮，然后用高速組織搗碎機打漿，打到無大的片狀、團狀物為止。在85℃的水浴鍋中鈍化20min，并且不時用玻璃棒攪拌，然后冷卻至室溫備用。

1.2.1 果膠酶和纖維素酶單獨使用提取番茄紅素的實驗

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在5個250mL的帶塞三角瓶中，加入果膠酶0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g，40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含體積分數2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長472nm處測定吸光度，以確定果膠酶的最佳用量。再按上述方法確定纖維素酶的最佳用量。

1.2.2 果膠酶和纖維素酶混合比例的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在5個250mL的帶塞三角瓶中，加入果膠酶和纖維素酶質量比3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，總酶量為0.8g/100g，于40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長472nm處測其吸光度，以確定混合酶的最佳比例。

1.2.3 果膠酶和纖維素酶混合用量的確定

稱取20g鈍化后番茄汁，分別裝在5個250mL的帶塞三角瓶中，在最佳比例下，分別加入總酶量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g，于40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長472nm處測其吸光度，確定最佳混合酶用量。

1.2.4 果膠酶和纖維素酶混合使用時pH值的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在5個250mL的帶塞三角瓶中，調整pH值依次為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在一定的混合酶最佳比及其用量，于40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長472nm處測其吸光度，確定最佳pH值。

1.2.5 果膠酶和纖維素酶混合使用時酶解時間的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在6個250mL的帶塞三角瓶中，加入一定的混合酶最佳比例及其用量，于40℃酶解2、3、4、5、6、7h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長472nm處測其吸光度，確定酶解的最佳時間。

1.2.6 果膠酶和纖維素酶混合使用時酶解溫度的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在4個250mL的帶塞三角瓶中，加入一定的混合酶最佳比例及其用量，分別在30、35、40、45℃條件下酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長472nm處測其吸光度，確定酶解的最佳溫度。

1.2.7 果膠酶和纖維素酶酶解最佳提取條件的確定

在單因素試驗基礎上，確定果膠酶和纖維素酶的質量比為2:1，通過混合酶用量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間4個主要因素，進行四因素四水平的L16(44)正交試驗設計(表1)，以確定酶解提取番茄紅素的最佳條件。

表1 果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的正交試驗Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次，數據取平均值，采用Excel處理。

2 結果與分析

2.1 果膠酶、纖維素酶單獨用量對番茄紅素提取的影響

由圖1可見，單獨使用果膠酶酶解提取番茄紅素時，隨著酶用量的增多，吸光度逐漸增大，說明番茄紅素的提取量逐漸增加，果膠酶最佳用量是0.8g/100g；而纖維素酶隨著酶用量的增加，提取量先升高，而后逐漸下降，最佳用量是0.4g/100g，而且果膠酶的效果比纖維素酶好。

2.2 果膠酶和纖維素酶混合比例對番茄紅素提取的影響

圖4 pH值對番茄紅素提取的影響Fig.4 Effect of pH on lycopene extraction

圖2 果膠酶和纖維素酶混合比例的確定Fig.2 Effect of pectinase/cellulase ratio on lyopene extraction

由圖2可知，隨著果膠酶和纖維素酶的比例的逐漸降低，吸光度也逐漸下降，比例越低，其吸光度亦越低，說明果膠酶對番茄紅素的提取作用明顯；二者的比例在3:1、2:1時的吸光度相差不多，從成本上考慮，選擇最佳比例為2:1。

2.3 混合酶用量對番茄紅素提取的影響

圖3 混合酶用量對番茄紅素提取的影響Fig.3 Effect of total dosage of pectinase and cellulase on lycopene extraction

由圖3可見，果膠酶和纖維素酶以2:1的比例混合均勻，隨著混合酶總量的增多，吸光度緩慢升高，至1.0g/100g達到最大，但和0.6g/100g相比，只相差0.013，故選擇最佳用量為0.6g/100g。

2.4 pH值對番茄紅素提取的影響

由圖4可知，在果膠酶和纖維素酶最佳比例2:1，用量0.6g/100g，40℃酶解4h，隨著提取液pH值的升高，吸光度先上升后下降，當pH5.0時，吸光度最大，說明番茄紅素的提取量最高，故選擇最佳pH值為5.0。

2.5 酶解時間對番茄紅素提取的影響

圖5 酶解時間對番茄紅素提取的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on lycopene extraction

由圖5可知，果膠酶和纖維素酶的比例2:1，用量0.6g/100g，在40℃、pH5.0條件下提取番茄紅素，隨著酶作用時間的延長，吸光度迅速增加，當達到4h時，再延長酶解時間，其吸光度趨于穩(wěn)定，所以酶解時間確定為4h。

2.6 酶解溫度對番茄紅素提取的影響

圖6 酶解溫度對番茄紅素提取的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on lycopene extraction

由圖6可見，果膠酶和纖維素酶的比例2:1，用量0.6g/100g，pH5.0，酶解4h，隨著酶解溫度的升高，吸光度先升高再下降，在35℃時達到最大，故選擇酶解溫度為35℃。

2.7 果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的最佳工藝

根據表2正交試驗結果可知，果膠酶和纖維素酶以2:1混合，提取番茄紅素的最佳工藝組合是A3B2C2D4，即混合酶用量0.6g/100g、酶解溫度35℃、pH5.0、酶解5h，然后用含2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min離心10min，所得的提取液番茄紅素最高。由表3方差分析結果表明：影響番茄紅素提取效果的順序大小依次為B＞D＞C＞A，即影響最大的是酶解溫度，其次是酶解時間和pH值，最小的是果膠酶和纖維素酶的酶用量。

表2 果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的正交試驗結果Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3 顯著性分析表Table 3 Results of significance tests

3 結論與討論

番茄紅素是一種開鏈式的不飽和胡蘿卜素，由8個異戊二烯單體組成，分子式為C40H56，有順式和反式兩種異構體，在植物中存在的番茄紅素幾乎都是反式的，而在動物體內存在的番茄紅素，順式異構體占的比例較大。順式異構體比反式更容易被吸收，加熱可以使反式的番茄紅素轉變成順式的，以便利于被吸收利用。由于番茄紅素是一種脂溶性色素，不易滲透穿過細胞壁和細胞膜，很難從細胞壁中溶出，應用酶解破壞細胞壁可以有效地促使各種化學物質從植物組織中釋放出來，包括油脂類[16]、非揮發(fā)性葡萄香氣物質[17]、胡蘿卜素[18]等物質，提高其提取率。Lavecchia等[19]應用果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等處理，在40℃酶解1h，然后加入有機溶劑(丙酮、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷)提取3h，提取率達到77%～98%，而對照只需3%～30%。Choudhari等[15]應用果膠酶和纖維素酶酶解方法提取番茄紅素，認為果膠酶的效果比纖維素酶好的多。本實驗應用含2%二氯甲烷的石油醚為提取溶劑，研究果膠酶和纖維素酶單獨使用和復合使用對番茄紅素提取的影響，結果顯示果膠酶和纖維素酶混合使用比單一酶的提取效率高，而且果膠酶的提取效果比纖維素酶要好。在果膠酶和纖維素酶質量比為2:1時，混合使用這兩種酶提取番茄紅素的最佳條件為混合酶用量0.6g/100g、酶解溫度35℃、pH5.0、酶解時間5h，然后用2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min離心10min。影響番茄紅素提取效果最大的是酶解溫度，其次是酶解時間和pH值，最后是果膠酶和纖維素酶的用量。

關于混合酶用量影響最小的具體原因還不清楚，可能有以下幾個方面：1)酶的加入僅僅是為了破壞細胞壁，促進番茄紅素的溶出，一般認為，細胞壁破壞越嚴重，番茄紅素的溶出就越容易。但并不一定提取的番茄紅素就越高，它還與其提取的溶劑、提取溫度、提取次數、提取時間等因素有關[19]；2)在酶促反應中，當底物濃度遠遠大于酶濃度時，隨著酶添加量的增加，反應速度加快；當底物全部被酶結合，酶用量再大，反應速度不再變化；所以，當酶用量過大時，提取率與酶用量沒有相關性；3)酶的活力不同，對番茄紅素提取的影響也不同。不同的廠家，酶的純度、活性大小是有所差別的；4)不同的番茄組織，酶用量也不相同。對于整個番茄果實，用4～6g/100g纖維素酶和0.25～4g/100g果膠酶處理，結果顯示6g/100g的纖維素酶和0.5g/100g的果膠酶處理獲得的番茄紅素最高，分別為96.3μg/g和90.6μg/g；3g/100g的纖維素酶處理果皮，番茄紅素的產量最佳為424μg/g，而2g/100g的果膠酶處理最好，為712μg/g[15]；5)當酶的添加量比較少時，影響酶促反應的因素可能就是酶促反應的溫度、時間和pH值。此外，為了打漿方便，本實驗對果實進行了去皮處理，由于番茄皮中含有較多的番茄紅素[20]，必將影響番茄紅素的提??；另外本實驗只用提取液吸光度的大小反映提取效果，沒有具體含量和提取率，這是本研究的不足之處。

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Synergic Effects of Cellulase and Pectinase on Extraction of Lycopene from Tomato

YUAN Chun-long1,2，ZHANG Jin1
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

In the extraction of lycopene from tomato, petroleum ether containing 2% (V/V) dichloromethane was used as extraction solvent. Lycopene extraction was investigated with respect to the effects of respective and synergic hydrolysis of tomato by cellulase and pectinase. The results indicated that a higher extraction yield of lycopene was obtained when pectinase,instead of cellulase was used for hydrolyzing tomato. More lycopene was extracted from tomato using both of the enzymes than using pectinase alone. The optimal parameters for extracting lycopene using both of the enzymes were determined as follows:pectinase/cellulase ratio 2:1, their total dosage 0.6 g/100 g, and pH 5.0 for 5 h hydrolysis at 35 ℃, followed by extraction for 20 min using the above extraction solvent and centrifugation at 4000 r/min for 10 min.

lycopene；cellulase；pectinase

TS255.4

A

1002-6630(2010)13-0100-05

2009-12-09

楊凌農業(yè)科技開發(fā)基金項目(2004TA21)

袁春龍(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為葡萄與葡萄酒功能性成分。E-mail：yuanchunlong@hotmail.com