堿性蛋白酶限制性水解對(duì)高溫菜籽粕蛋白功能性質(zhì)的影響

王素雅，劉 勝，鞠興榮，嚴(yán)梅榮，袁 建

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003)

堿性蛋白酶限制性水解對(duì)高溫菜籽粕蛋白功能性質(zhì)的影響

王素雅，劉 勝，鞠興榮，嚴(yán)梅榮，袁 建

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003)

為改善高溫菜籽粕蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，用堿性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行限制性水解，并研究不同水解度(DH)高溫菜籽粕蛋白功能性質(zhì)及相對(duì)分子質(zhì)量分布。結(jié)果表明：堿性蛋白酶限制性水解高溫菜籽粕蛋白的溶解度、乳化性和吸油性均有所改善，其中溶解度隨水解度增加而增加，pH7.0時(shí)DH為10%的高溫菜籽粕蛋白的溶解度達(dá)63.82%，是原蛋白溶解度的2.1倍；DH為2.0%的水解蛋白乳化性最好，pH6.0和pH8.0時(shí)乳化指數(shù)分別為0.43和0.49，比原蛋白乳化指數(shù)分別高0.13和0.11；DH為8%的水解蛋白吸油性最好，為4.39g/g。水解后高溫菜籽粕蛋白的某些功能性質(zhì)與其相對(duì)分子質(zhì)量分布有一定的關(guān)系，需控制高溫菜籽粕蛋白水解度以獲得某種良好的功能性質(zhì)。

菜籽粕蛋白；堿性蛋白酶；水解度；功能性質(zhì)

植物蛋白質(zhì)改性的方法有酶法、化學(xué)法、物理法及生物轉(zhuǎn)基因法等，其中酶法與化學(xué)法最常用。與化學(xué)法改性相比，酶法改性具有許多優(yōu)點(diǎn)，如條件溫和、效率高，不破壞氨基酸結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生有害物質(zhì)的可能性小，安全性高等[1]。蛋白質(zhì)限制性水解改性是指利用蛋白酶水解，使蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生改變[2]，從而提高蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善各種功能特性并擴(kuò)大蛋白質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域。然而，過度酶解會(huì)造成某些功能特性減弱甚至完全喪失[3]。已有的研究表明，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小(即肽鏈長(zhǎng)短)與功能特性改善有密切關(guān)系[4-5]。因此限制性水解是獲得良好性能蛋白質(zhì)的重要基礎(chǔ)。

工業(yè)榨油后，菜籽粕中的蛋白質(zhì)由于高溫、有機(jī)溶劑等作用而功能性質(zhì)劣化，因此，采取適宜方法對(duì)高溫菜籽粕蛋白改性，是提高菜籽粕蛋白利用率的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)酶法改善高溫菜籽粕蛋白功能性質(zhì)的研究較少，因此，本實(shí)驗(yàn)用堿性蛋白酶限制性水解高溫菜籽粕蛋白，探討不同水解度高溫菜籽粕蛋白的功能性質(zhì)及相對(duì)分子質(zhì)量變化，以期為高溫菜籽粕蛋白的進(jìn)一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫菜籽粕蛋白 自制；高溫菜籽粕 南京隆盛油脂有限公司；金龍魚菜籽色拉油(精煉一級(jí)) 益江(張家港)糧油工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25型pH計(jì)、722N可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)TDL-5-A 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；501型超級(jí)恒溫器 上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；FJ200-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；AIPHAI-4LD PLUO真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；JJ-1精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市榮華制造有限公司；AKTA purifier全自動(dòng)蛋白質(zhì)分析純化儀 美國(guó)GE Healcare集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 高溫菜籽粕蛋白的提取

以高溫菜籽粕為原料，采用淀粉酶與堿(稀NaOH溶液)提取相結(jié)合的方法提取蛋白。淀粉酶作用條件為加酶量2.5%，料液比1:20(g/mL)，pH7.0，50℃反應(yīng)3h；之后用堿提取，其作用條件為料液比1:12(g/mL)，pH10.0，55℃提取2h。4000r/min離心20min，上清液用稀酸調(diào)至pH4.0使蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀，然后70%乙醇溶液脫色處理后凍干。提取的菜籽粕蛋白中蛋白質(zhì)含量為78.44%，硫代葡萄糖苷含量為0.17mg/g。

1.3.2 堿性蛋白酶限制性水解高溫菜籽粕蛋白

石油工業(yè)部非常重視這項(xiàng)工程。石油部領(lǐng)導(dǎo)明確提出：“用第一流的施工水平，第一流的工程質(zhì)量，為第一流的城市服務(wù)?！辈⒁笕抗こ添毥?jīng)超聲波探傷檢查和20%的X射線檢查。

將一定量的高溫菜籽粕蛋白配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)至相應(yīng)pH值與溫度，用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，其間不斷滴加0.5mol/L NaOH溶液保持反應(yīng)體系pH值穩(wěn)定。當(dāng)達(dá)到預(yù)期水解度時(shí)，將反應(yīng)液置于90℃保溫滅酶。冷凍干燥后即得不同水解度的改性高溫菜籽粕蛋白。

1.3.3 高溫菜籽粕蛋白水解度的測(cè)定

采用pH-stat法測(cè)水解度(DH)[6]。DH定義為蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的比例，水解度計(jì)算如式(1)。

式中：V為消耗堿的體積/mL；c為標(biāo)準(zhǔn)NaOH的濃度/(mol/L)；mp為蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g；htot為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)(取7.8mmol/g)；α為樣品分離蛋白氨基平均解離度。

1.3.4 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白溶解度的測(cè)定

采用雙縮脲法[7]。準(zhǔn)確稱取0.20g樣品溶于20mL水中，分別調(diào)節(jié)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室溫?cái)嚢?0min，然后4000r/min離心20min。采用雙縮法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算高溫菜籽粕蛋白的溶解度。

1.3.5 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

采用濁度法[8]。稱取一定量樣品溶解于不同pH值緩沖液中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的蛋白溶液，室溫磁力攪拌30min后，加入5.0mL大豆油，以10000r/min均質(zhì)60s，立即從底部吸取100μL乳濁液與10.0mL 0.1% SDS溶液混勻，于波長(zhǎng)500nm處測(cè)定吸光度A0，此值記為乳化活性(EA)。10min后重新從靜置的乳濁液底部取樣測(cè)定吸光度At。按式(2)計(jì)算乳化穩(wěn)定性(ES)。式中：△t為兩次測(cè)定乳化活性的時(shí)間間隔/min；本實(shí)驗(yàn)中該值為10min。

1.3.6 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白吸油性的測(cè)定[9]取0.50g蛋白樣品置于10mL離心管中，加入5.0mL大豆油，攪勻后置于40℃水浴中保溫30min，然后4000r/min離心30min，傾去上層未吸附的大豆油，稱蛋白質(zhì)量，計(jì)算每克蛋白質(zhì)樣品的吸油性。

式中：m0為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量/g；m為蛋白質(zhì)吸油后質(zhì)量/g。

1.3.7 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布

采用凝膠排阻層析色譜法[10]。KTA purifier全自動(dòng)層析系統(tǒng)，分離柱為Superose12 10/300 GL(10mm×300mm)預(yù)裝柱，進(jìn)樣體積為500μL，洗脫液為0.15mol/L NaCl，50mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液，洗脫流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白(Mr67000)、細(xì)胞色素 (Mr12700)、鈷胺酰胺(VB12，Mr1355)、Gly-Gly-Tyr-Arg(Mr451.48)。

2 結(jié)果與分析

2.1 限制性水解對(duì)高溫菜籽粕蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的基礎(chǔ)，具有良好溶解性能的蛋白質(zhì)才可能擁有優(yōu)良的乳化性、起泡性和凝膠性，適于食品工業(yè)加工利用。高溫菜籽粕蛋白質(zhì)溶解性差，直接影響到高溫菜籽粕蛋白的應(yīng)用，而限制性水解可有效提高高溫菜籽粕蛋白的溶解性。

圖1 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的溶解度Fig.1 pH dependence of solubility of rapeseed thermoresistant protein with different DHs

由圖1可知，高溫菜籽粕蛋白及其限制性水解物的等電點(diǎn)均在pH4.0附近，其中高溫菜籽粕蛋白溶解性差，pH4.0時(shí)溶解度僅為4.77%。而經(jīng)堿性蛋白酶水解后其溶解度不斷提高，當(dāng)DH為10%時(shí)，水解高溫高溫菜籽粕蛋白溶解度達(dá)34.44%，比原蛋白提高了6倍。在pH7.0時(shí)，DH為10%的水解高溫菜籽粕蛋白的溶解度達(dá)63.82%，是原高溫菜籽粕蛋白的2.1倍。水解高溫菜籽粕蛋白溶解度提高可能是由于多肽鏈斷裂并暴露出離子化的氨基和羧基，使分子極性增強(qiáng)，親水性增加[11-12]；同時(shí)，水解破壞了分子中疏水區(qū)域的結(jié)構(gòu)，增加分子間相互排斥作用，提高了水解物在溶液中的分散穩(wěn)定性，進(jìn)而提高了蛋白質(zhì)的溶解性[13]。

2.2 限制性水解對(duì)高溫菜籽粕蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖2 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的乳化性Fig.2 pH dependence of emulsifying capacity of rapeseed thermoresistant protein with DHs

由圖2可知，限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白的乳化性均受pH值影響，在等電點(diǎn)附近乳化活性最低，偏離等電點(diǎn)則乳化活性提高，該結(jié)果與趙國(guó)華等[13]和Yin等[14]報(bào)道一致。不同水解度高溫菜籽粕蛋白乳化活性不同，其中DH為2%的水解高溫菜籽粕蛋白乳化活性最好，pH6.0、8.0時(shí)乳化活性別為0.43、0.49，比原蛋白分別高0.13、0.11。分析認(rèn)為：制油過程使菜籽蛋白嚴(yán)重變性，溶解性降低，不能夠迅速擴(kuò)散到油/水界面[15]。而限制水解后高溫菜籽粕蛋白溶解性增大，分子柔順性增加，利于蛋白質(zhì)迅速擴(kuò)散而降低油/水界面的自由能。同時(shí)多肽鏈電荷增加，靜電作用阻止了油滴聚集[16]，因此，限制性水解高溫菜籽粕蛋白乳化性得到一定程度改善。但隨著水解度不斷提高，多肽鏈中更多的極性基團(tuán)外露，其降低界面自由能的能力下降，因此乳化活性降低。本實(shí)驗(yàn)中限制性水解不能改善高溫菜籽粕蛋白的乳化穩(wěn)定性，由圖3可知，高溫菜籽粕蛋白乳化穩(wěn)定性最高，水解蛋白的乳化穩(wěn)定性隨DH增大而降低。這可能是由于縮短的多肽鏈在油/水界面上的相互作用能力減弱，在界面上形成的黏彈性膜不能維持界面層平衡，乳化球易于破裂。

圖3 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的乳化穩(wěn)定性Fig.3 pH dependence of emulsion stability of rapeseed thermoresistant protein with DHs

2.3 限制性水解對(duì)高溫菜籽粕蛋白吸油性的影響

圖4 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的吸油性Fig.4 Relationship between oil absorption capacity and DHs of rapeseed thermoresistant protein

本實(shí)驗(yàn)限制性水解可有效改善高溫菜籽粕蛋白的吸油性，由圖4可知，DH為8%的高溫菜籽粕蛋白吸油性最佳，為4.39g/g，比原蛋白的1.53g/g提高約2.9倍。這可能是由于水解使蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，吸油性顯著提高。但當(dāng)水解度進(jìn)一步增大時(shí)，多肽鏈極性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)吸附油滴的能力降低，吸油性又呈下降趨勢(shì)。

2.4 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖5 酶解改性高溫菜籽粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線Fig.5 Molecular weight distribution curves of rapeseed thermoresistant protein with DHs

表1 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of rapeseed thermoresistant protein with DHs

由圖5與表1可知，原蛋白質(zhì)在凝膠層析色譜中出現(xiàn)4個(gè)峰，其中A峰占總峰面積的38.96%，B峰占17.76%，相對(duì)分子質(zhì)量大于5000的大分子蛋白共占56.72%，說明原蛋白質(zhì)以大分子為主。隨水解度的增加，堿性蛋白酶水解蛋白在凝膠層析中A峰面積減小，B峰消失，C峰面積增加，表明高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白逐漸減少，低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白逐漸增多。DH為2%的限制性水解高溫菜籽粕蛋白的C峰面積比例大幅增加，達(dá)到78.73%，A峰面積則下降至16.72%，說明小分子質(zhì)量的寡肽比例相應(yīng)增加。當(dāng)DH為10%時(shí)，限制性水解高溫菜籽粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量則以1500～5000的多肽為主，占峰面積的90%以上，此時(shí)水解高溫菜籽粕蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較小，肽鏈較短。高溫菜籽粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況主要取決于水解度的高低，隨水解度提高，低相對(duì)分子質(zhì)量小肽類物質(zhì)逐漸增多，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，膨脹性降低，蛋白多聚體解聚，使得蛋白質(zhì)的有序性增加，蛋白質(zhì)的表觀體積減小，溶解性增加；另外，蛋白的降解使得肽類分子的離子基團(tuán)增加，相互排斥性增強(qiáng)，這也使得蛋白的溶解性增加。而當(dāng)DH為2%時(shí)，水解高溫菜籽粕蛋白可能處在一種適度松散的狀態(tài)，有利于分散到油/水界面上形成具有高度黏彈性的網(wǎng)絡(luò)膜，阻止油滴間的聚集，進(jìn)而表現(xiàn)出較高的蛋白質(zhì)乳化性；當(dāng)高溫菜籽粕蛋白被進(jìn)一步深度水解時(shí)，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量變小，多肽鏈過短，不能像高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白那樣伸展以形成具有高黏彈性的保護(hù)膜及降低油水界面的界面張力，從而導(dǎo)致乳化性能下降。所以有必要對(duì)蛋白質(zhì)的水解度進(jìn)行控制，保證其相對(duì)分子質(zhì)量處于合理狀態(tài)，以取得較理想的功能性質(zhì)。

3 結(jié) 論

3.1 采用堿性蛋白酶對(duì)高溫菜籽粕蛋白進(jìn)行限制性水解改性后，水解高溫菜籽粕蛋白的溶解度隨水解度增加而增大，pH4.0時(shí)DH為10%水解蛋白溶解度比原蛋白提高了6倍，pH7.0時(shí)DH為10%水解蛋白的溶解度達(dá)63.82%；水解蛋白的乳化性和吸油性也都有所提高，DH為2%的水解蛋白乳化性最好，在pH6.0與pH8.0時(shí)乳化活性分別為0.43與0.49；DH為8%的水解蛋白吸油性最好，為4.39g/g，比原蛋白提高了近2.9倍，但所有改性蛋白的乳化穩(wěn)定性并無改善。

3.2 采用凝膠排阻層析分析了限制性水解高溫菜籽粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布，表明蛋白的某些功能性質(zhì)與相對(duì)分子質(zhì)量分布有一定的關(guān)系。因此，需控制高溫菜籽粕蛋白水解度以獲得某種良好的功能性質(zhì)。

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Effect of Limited Alkaline Protease Hydrolysis on Functional Properties of Rapeseed Thermoresistant Protein

WANG Su-ya，LIU Sheng，JU Xing-rong，YAN Mei-rong，YUAN Jian
(School of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

To improve functional properties, the thermoresistant protein extracted from rapeseed meal was limitedly hydrolyzed by alkaline protease hydrolysis. Also, the relationships between protein functions and degree of hydrolysis (DH)were investigated. The solubility, emulsifying capacity and oil absorption capacity of rapeseed thermoresistant protein all increased after alkaline protease hydrolysis. Its solubility increased with increasing DH, and the solubility of rapeseed thermoresistant protein with 10% DH was as high as 63.82% at pH 7, 2.1 times higher than before hydrolysis. The emulsifying capacity of the hydrolysate obtained at 2.0% DH was the best and the emulsifying index was 0.43 and 0.49 at pH 6.0 and pH 8.0, 0.13 and 0.11 higher than unhydrolyzed rapeseed thermoresistant protein, respectively. The hydrolysate obtained at 8%DH presented the highest oil absorption capacity, 4.39 g/g. Rapeseed thermoresistant protein was decomposed into peptides with a smaller molecular weight after the hydrolysis, so changes in some of its functional properties took place.

rapeseed thermoresistant protein；alkaline protease；degree of hydrolysis；functional properties

TS201.2

A

1002-6630(2010)13-0044-04

2009-10-20

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z331)

王素雅(1969—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wsy_wangsy@sina.com