百菌清人工抗原的制備與鑒定

郭乃菲，高 興，紀(jì)淑娟，于基成*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600)

百菌清人工抗原的制備與鑒定

郭乃菲1,2，高 興1,2，紀(jì)淑娟1，于基成2,*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600)

以殺菌劑百菌清為起始反應(yīng)物，通過兩步化學(xué)反應(yīng)合成百菌清的衍生物(半抗原)；采用活化酯法與混合酸酐法分別將半抗原與載體蛋白(牛血清蛋白、卵清蛋白)進(jìn)行偶聯(lián)，制備百菌清的人工抗原，同時(shí)通過免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定其效價(jià)。利用紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)對百菌清半抗原進(jìn)行表征，并用紫外掃描的方法對人工抗原進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，成功制備出百菌清半抗原及人工抗原，并且半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比分別為27.86:1和12.32:1，抗血清效價(jià)約為1:1.28×104。

百菌清；半抗原；人工抗原；鑒定

百菌清(tetrachloroisophthalonethile，TCPN)，化學(xué)名為2,4,5,6-四氯-1,3-二氰基苯，是一種廣譜保護(hù)性殺菌劑，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要用于防治果蔬類真菌病害。由于百菌清對植物體具有良好的黏著性和使用的廣泛性，因此百菌清及其代謝產(chǎn)物在果蔬、土壤及水中均有較大的殘留，甚至在北極地區(qū)也能檢測到[1]。美國國家環(huán)境保護(hù)總署(U.S.EPA)已經(jīng)把百菌清列為可能使人類致癌的物質(zhì)之一，其對環(huán)境和食品安全具有潛在威脅[2]。目前，國內(nèi)百菌清的檢測方法主要為氣相色譜法(GC)[3]和液相色譜法(HPLC)[4]等儀器分析方法。這些方法均存在樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)、成本高等問題，不適合大量樣品的快速檢測，因此建立一種操作簡便、快速和檢測通量大的方法具有重要意義。ELISA法是目前用于農(nóng)藥殘留分析較為常用的快速檢測法，其原理是利用酶標(biāo)記物同抗原或抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，既保持了酶催化反應(yīng)的靈敏性，又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性，因而極大的提高了靈敏度，其方法建立的關(guān)鍵則是制備出一種或幾種人工抗原，以獲得高效價(jià)的抗血清。本研究以百菌清作為起始反應(yīng)物，經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)獲得具有特定基團(tuán)的百菌清衍生物；并采用活化酯法和混合酸酐法制備其人工抗原，通過免疫新西蘭大白兔獲得兔抗百菌清的血清，以期為建立百菌清殘留檢測的ELISA方法和試劑盒的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百菌清(含量大于90%)；乙二醇、N'N-二甲基甲酰胺(DMF)、丁二酸酐、三丁胺、氯甲酸異丁酯均為分析純；弗氏佐劑、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)均為進(jìn)口分裝分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LABORO 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；IKA-MS1微型旋渦混合儀 德國IKA公司；Free Zone 4.5臺(tái)式冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；IRPrestige-21紅外光譜儀、Icms-20液相色譜-質(zhì)譜儀、UV-2450紫外光譜儀 日本島津公司；Mercury-plus400mHz核磁共振波譜儀 美國瓦里安公司；Bio-Rad 680酶標(biāo)儀 美國伯樂公司；BR-4i臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 法國Jouan公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器 大連科銳生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔(雄性，2～2.5kg) 大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 方法

1.4.1 百菌清半抗原(TCPN-COOH)的合成與鑒定

將百菌清原藥0.5g用20mL乙二醇溶解，攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)物再與等量的丁二酸酐在吡啶環(huán)境下反應(yīng)獲得百菌清半抗原，反應(yīng)流程見圖1。半抗原經(jīng)硅膠柱層析純化后用IR、MS和NMR進(jìn)行表征。

圖1 百菌清半抗原(TCPN-COOH)制備的反應(yīng)路線Fig.1 Synthetic route of TCPN-COOH

1.4.2 百菌清人工抗原的合成

1.4.2.1 活化酯法制備百菌清人工抗原(TCPN-COOHBSA)[5-6]

取0.053g百菌清半抗原溶解于2.0mL DMF中，加入0.023g NHS和0.041g DCC，反應(yīng)5h。離心，上清液中緩慢滴入6.0mL 20.0mg/mL BSA，攪拌。反應(yīng)液經(jīng)離心后取上清液透析并冷凍干燥備用。

圖2 活化酯法制備百菌清人工抗原反應(yīng)路線Fig.2 Synthetic route of TCPN-COOH-BSA by activated ester method

1.4.2.2 混合酸酐法制備百菌清包被抗原(TCPN-COOHOVA)[7]

稱取百菌清半抗原0.05g溶于2.0mLDMF中，依次加入50.0μL三丁胺和30.0μL氯甲酸異丁酯，攪拌反應(yīng)1h后將其緩慢滴入6.0mL 20.0mg/mL OVA中。反應(yīng)液經(jīng)離心、透析和冷凍干燥后備用。

圖3 混合酸酐法制備百菌清包被抗原反應(yīng)路線Fig.3 Synthetic route of TCPN-COOH-OVA by mixed anhydride method

1.4.3 人工抗原的鑒定與偶聯(lián)比的測定

1.4.3.1 人工抗原的鑒定

將百菌清半抗原稀釋至適當(dāng)濃度，在波長200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，獲得半抗原的紫外光譜。

1.4.3.2 人工抗原偶聯(lián)比的測定

采用Bradford法[8]測定人工抗原中的蛋白質(zhì)含量，以紫外光譜法測定抗原中TCPN-COOH含量，按下式估算偶聯(lián)比[9](ε表示摩爾吸光系數(shù))。

TCPN-COOH:BSA/OVA=εTCPN-COOH:εBSA/OVA

1.4.4 抗血清的制備

將TCPN-BSA用生理鹽水稀釋，加入等體積弗氏完全佐劑充分乳化，于新西蘭大白兔背部皮下多點(diǎn)免疫，初次免疫劑量為0.5mg/kg。3周后加強(qiáng)免疫(弗氏不完全佐劑)，免疫劑量為0.1～0.15mg/kg，1次/2周，共4次。從第3次加強(qiáng)免疫開始，免疫后7～10d耳緣靜脈取血，采用間接ELISA法測定抗血清的效價(jià)。加強(qiáng)免疫4次后，頸主動(dòng)脈放血，分離抗血清，于－20℃保存?zhèn)溆肹10-11]。

1.4.5 ELISA法測定抗血清效價(jià)和抗血清親和性測定

用10.0μg/mL包被原(TCPN-OVA)包被酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃溫育3h。經(jīng)PBST洗滌3次，用1%明膠封閉1.5h，150μL/孔，再次用PBST洗滌3次。加入不同稀釋度抗血清(以陰性血清為空白)，100μL/孔，37℃溫育lh。洗板，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:10000)，100μL/孔，37℃溫育lh后洗滌3次。最后加入顯色液(鄰苯二胺)100μL/孔，37℃顯色15 min，加入2.0mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀測定各孔的OD490nm值。當(dāng)OD490nm值為0.8左右時(shí)，抗血清的稀釋倍數(shù)即為抗血清的效價(jià)[12]。在ELISA法測定過程中，分別以TCPN-OVA、BSA包被酶標(biāo)板，按上述步驟測定其OD490nm值，考察抗血清對BSA和TCPN-OVA的親和性。

2 結(jié)果與分析

2.1 百菌清半抗原的鑒定

2.1.1 紅外光譜鑒定

圖4 半抗原TCPN-OH的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of TCPN-OH

由圖4可知，TCPN-OH的紅外光譜可歸屬：O—H伸縮振動(dòng)(3509cm-1)，C—H伸縮振動(dòng)(2950cm-1)，C≡N伸縮振動(dòng)(2248cm-1)，苯環(huán)骨架振動(dòng)(1562～1357cm-1)，C—O—C不對稱伸縮振動(dòng)(1292cm-1)，OH的彎曲振動(dòng)(1245cm-1)，C—O—C對稱伸縮振動(dòng)(1086cm-1)，C—O(伯醇)的伸縮振動(dòng)(1043cm-1)，C—Cl的伸縮振動(dòng)(883cm-1)。其中3509cm-1處的O—H伸縮振動(dòng)及1300～1000cm-1范圍內(nèi)由脂肪醇引起的吸收均為百菌清中所未見的基團(tuán)吸收峰，說明TCPN-OH中醇羥基引入成功[13]。

TCPN-COOH紅外光譜歸屬：寬的O—H伸縮振動(dòng)(3700～2700cm-1)，C—H的伸縮振動(dòng)(2956、2930、2842cm-1)，C≡N伸縮振動(dòng)(2230cm-1)，羰基C==O伸縮振動(dòng)(1736cm-1)，苯環(huán)骨架振動(dòng)(1560～1390cm-1)，C—O伸縮振動(dòng)(1261cm-1)，苯環(huán)上雜原子裂分產(chǎn)生的吸收峰(1155～1090cm-1)，C—Cl的伸縮振動(dòng)(850cm-1)。由紅外光譜圖對比(圖5)可見，TCPN-COOH圖中出現(xiàn)了TCPNOH譜中未見羧酸特征吸收峰，說明羧酸基團(tuán)引入成功。

圖5 半抗原TCPN-COOH的紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of TCPN-COOH

2.1.2 質(zhì)譜鑒定

圖6 半抗原TCPN-OH的質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectrum of TCPN-OH

圖7 半抗原TCPN-COOH的質(zhì)譜圖Fig.7 MS spectrum of TCPN-COOH

TCPN-OH和TCPN-COOH的相對分子質(zhì)量分別為291.508和391.508，由圖6、7可以看出，其[M－]離子峰分別為290.60和390.66，質(zhì)譜分析表明目標(biāo)化合物的相對分子質(zhì)量與理論值相符。

2.1.3 核磁共振波譜表征

TCPN-OH核磁共振波譜歸屬：1H-NMR(400MHz,CD3COCD3,TMS,δ:ppm)：3.8(d,2H,— CH2—)；4.4(t,2H,— CH2—)。13C-NMR(400MHz,CD3COCD3,TMS,δ:ppm)：162.88(C-1 Ar)；141.74(C-5 Ar)；139.48(C-3 Ar)；128.19(C-6 Ar)；111.692(C-4 Ar)；109.649(C-2 Ar)；111.95/112.41(C-9/C-10 CN)；78.47(C-8)；61.39(C-7)。

TCPN-COOH核磁共振波譜歸屬：1H-NMR(400MHz,DMSO,TMS,δ:ppm)：1.271(s,2H,— CH2—)；1.29(s,2H,— CH2—)；4.594(s,2H,— CH2—)。13C-NMR(400MHz,DMSO,TMS,δ:ppm)：181(C-9 C=O)；173(C-12 COOH)；169.19(C-4 Ar)；150.89(C-6 Ar)；142.29(C-2 Ar)；119.59(C-5 Ar)；114.59/115.45(C-13/C-14CN)；107(C-1 Ar)；101(C-3 Ar)；80.83(C-7)；74(C-10)；61(C-11)；59(C-8)。

2.2 人工抗原的鑒定及偶聯(lián)比的測定

圖8 活化酯法和混合酸酐法制得的人工抗原的紫外掃描曲線Fig.8 UV absorption spectra of TCPN-COOH-BSA and TCPN-COOHOVA

由圖8可知，兩種方法合成的抗原與載體蛋白紫外光譜相比，光譜均發(fā)生了明顯變化，且都在230nm附近出現(xiàn)了相應(yīng)的吸收峰，這是TCPN-COOH所特有的吸收峰(最大吸收值)，說明載體分子上已成功連接了一定數(shù)量的TCPN-COOH。根據(jù)Bradford法測定了人工抗原和包被抗原中載體蛋白的含量，并且通過人工抗原、載體蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線及TCPN-COOH的紫外吸收曲線在235nm處的摩爾吸光度，計(jì)算出相應(yīng)的偶聯(lián)比分別為27.86:1和 12.32:1。

2.3 抗血清效價(jià)的測定

由圖9可知，以TCPN-OVA為包被原測定的抗血清OD490nm值明顯高于以BSA為包被原所測得的OD490nm值，說明免疫血清中含有可跟TCPN-OVA反應(yīng)的抗體，制備的抗血清與百菌清具有較高的親和性，而與BSA親和性較差。通過方陣滴定測得抗血清效價(jià)為1:1.28×104，說明人工抗原已具有免疫作用。Xu等[14]獲得的五氯硝基苯多克隆抗體在抗血清稀釋度為1:5×103時(shí)抗血清與五氯硝基苯親和性最好，其檢測的靈敏度為7ng/g。因此，本研究所獲得的抗體效價(jià)可以滿足ELISA檢測對抗體效價(jià)方面的要求，為后續(xù)建立ELISA檢測方法提供資料。

圖9 百菌清抗血清效價(jià)測定曲線Fig.9 Antiserum titer determination curves

3 結(jié)論與討論

3.1 半抗原結(jié)構(gòu)對免疫結(jié)果的影響

半抗原的結(jié)構(gòu)對免疫結(jié)果有直接的影響，因此通常在合成半抗原的過程中都會(huì)盡量多的設(shè)計(jì)出不同結(jié)構(gòu)的半抗原，并通過免疫應(yīng)答反應(yīng)來最終取舍。對于結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的農(nóng)藥分子，在設(shè)計(jì)半抗原前要對其各個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行討論，確定各基團(tuán)在農(nóng)藥作用過程中所起的作用，盡量在輔助的結(jié)構(gòu)區(qū)域上進(jìn)行修飾，增加抗原抗體之間的識(shí)別能力[15]。在本研究中，由于百菌清本身的結(jié)構(gòu)簡單，因而不需要討論其功能分區(qū)。同時(shí)，在半抗原合成過程中，不同長短的連接臂也會(huì)對免疫結(jié)果有一定的影響，過短的連接臂會(huì)使結(jié)構(gòu)比較簡單的半抗原分子包埋在載體蛋白中，影響偶聯(lián)比的測定，降低免疫反應(yīng)的靈敏度；過長的連接臂會(huì)在偶聯(lián)過程中發(fā)生折疊，同樣使半抗原分子被包埋，或者免疫產(chǎn)生的抗體對結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的連接臂更具有識(shí)別能力[16]。

3.2 人工抗原偶聯(lián)方式對免疫結(jié)果的影響

對于同一種半抗原分子與載體蛋白偶聯(lián)時(shí)，通常存在兩種或兩種以上的方法，但是不同的連接方法對載體蛋白的修飾程度不同，即偶聯(lián)比的多少會(huì)有所差異，進(jìn)而對免疫結(jié)果產(chǎn)生影響[17]。而且有的偶聯(lián)過程會(huì)引入幾個(gè)碳原子的連接臂，例如戊二醛法，因此在選擇偶聯(lián)方法時(shí)要根據(jù)半抗原自身的結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇[18]。在本研究中采用活化酯法將半抗原與BSA相偶聯(lián)制備了百菌清的人工免疫抗原；混合酸酐法將半抗原與OVA偶聯(lián)制備了百菌清的包被抗原，采用紫外-可見光譜法測定了人工抗原和包被抗原的偶聯(lián)比分別為28.76:1和12.32:1。選用這兩種方法是由于半抗原本身的偶聯(lián)臂長度已經(jīng)足夠，且偶聯(lián)臂末端為羧基基團(tuán)，因而不用通過其他方式增加偶聯(lián)臂的長度。

3.3 免疫過程對免疫結(jié)果的影響

在對動(dòng)物進(jìn)行活體免疫時(shí)，免疫的劑量、次數(shù)，佐劑的選擇均會(huì)對免疫的結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，本研究選擇對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，全程的免疫劑量控制在1mg/kg，共免疫5次，采用ELISA法測定其抗血清的效價(jià)在1:1.28×104。另外，免疫的劑量和次數(shù)過大或過于頻繁都會(huì)造成動(dòng)物的免疫耐受現(xiàn)象，使得抗體的效價(jià)大幅下降，同時(shí)根據(jù)免疫對象的不同來選擇合適的佐劑，對動(dòng)物免疫時(shí)大多采用弗氏佐劑。

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Preparation and Identification of Tetrachloroisophthalonethile Artificial Antigen

GUO Nai-fei1,2，GAO Xing1,2，JI Shu-juan1，YU Ji-cheng2,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

In this work, tetrachloroisophthalonethile (TCPN) was derivatized into TCPN-COOH through two-step chemical reactions to prepare a hapten. TCPN artificial antigens, TCPN-COOH-BSA and TCPN-COOH-OVA were prepared from the hapten separately conjugated with carrier proteins, i.e., bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) by activated ester and mixed anhydride methods. An antisera was obtained through the immunization of New Zealand white rabbits using TCPNBSA. Antiserum titer was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Meanwhile, TCPN-COOH and its intermediate product TCPN-OH were characterized by IR, MS and NMR methods, and TCPN-COOH-BSA and TCPNCOOH-OVA were qualitatively analyzed by UV/Vis spectrophotometry. TCPN-COOH, TCPN-COOH-BSA and TCPNCOOH-OVA were successfully synthesized, and the coupling ratios between TCPN-COOH and BSA or OVA were 27.86 and 12.32, respectively. The antiserum titer was about 1:1.28×104.

tetrachloroisophthalonethile；hapten；artificial antigen；identification

R392.7

A

1002-6630(2010)13-0214-05

2009-11-10

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20072916)；大連民族學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(20086203)

郭乃菲(1983—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量控制。E-mail：guonaifei1983@126.com

*通信作者：于基成(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全。E-mail：yujc@dlnu.edu.cn