百菌清污染土壤生物修復研究進展

唐麗偉，盧滇楠，劉永民

（1.遼寧石油化工大學 化學化工與環(huán)境學部，遼寧 撫順 113001；2.清華大學 化學工程系工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，北京 100084）

進展綜述

百菌清污染土壤生物修復研究進展

唐麗偉1，盧滇楠2，劉永民1

（1.遼寧石油化工大學 化學化工與環(huán)境學部，遼寧 撫順 113001；2.清華大學 化學工程系工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，北京 100084）

針對百菌清具有在土壤中藥效穩(wěn)定、不易分解、代謝周期長、長期大量施加導致土壤嚴重污染等特點和問題，簡要介紹了百菌清的毒性作用機制?？偨Y(jié)了降解土壤中百菌清的物理法、化學法和生物法的原理及優(yōu)缺點。重點闡述了生物修復百菌清污染土壤的主要降解菌株及其效果、降解途徑以及降解產(chǎn)物及其毒性，分析了土壤性質(zhì)、微生物種類、溫度、土壤含水率等因素對百菌清降解效果的影響。指出今后的研究重點應為降解中間產(chǎn)物的毒性分析及其進一步的降解與轉(zhuǎn)化問題，而復合菌制劑或多酶復合體系可實現(xiàn)百菌清的徹底降解和無害化。

百菌清；污染土壤；生物修復；降解菌株；降解途徑；降解產(chǎn)物

百菌清可防治植物的黑斑病、炭疽病等，是使用廣泛的殺真菌劑。在墨西哥，百菌清每年噴灑50次左右，施藥量高達1.41 kg/hm2［1-2］，在中國，百菌清年產(chǎn)量接近9 000 t。百菌清在土壤中藥效穩(wěn)定，不易分解，長期大量施加百菌清會導致嚴重的土壤污染問題［3-7］。百菌清可以很好地附著在植物上，很難被雨水沖洗掉，在土壤中代謝周期長，若

微生物種群數(shù)量少時半衰期可達半年［8］。百菌清對水生無脊椎動物有劇毒，在嚙齒動物體內(nèi)存在明顯的毒性蓄積［9］。接觸百菌清會引起皮膚炎癥，它會嚴重刺激人的眼睛和腸胃，增加人類繁衍后代的致畸率，美國環(huán)保署已將百菌清列為潛在的致癌物質(zhì)［10］。

本文綜述了百菌清的毒性作用機制、百菌清的降解方法、百菌清污染土壤的生物修復效果。重點闡述了微生物對百菌清的降解機理，總結(jié)了降解產(chǎn)物并分析了產(chǎn)物毒性。展望了生物修復百菌清污染土壤今后的研究方向。

1 百菌清的物理性質(zhì)及其毒性作用機制

百菌清化學名稱為四氯間苯二甲腈，室溫時為白色粉末，微溶于水，易溶于有機溶劑，相對分子質(zhì)量為265.91，沸點為350 ℃，熔點為251 ℃，密度為1.8 g/cm3?？煞€(wěn)定存在于常溫和弱酸堿性介質(zhì)中，強堿性時會發(fā)生分解［11］。

百菌清通過與細胞呼吸和谷胱甘肽相關(guān)酶接觸，抑制致病細菌細胞的葡萄糖氧化、胍霉菌孢子萌發(fā)、菌絲生長和產(chǎn)孢［12-14］。Godard等［15-16］研究發(fā)現(xiàn)，百菌清可與含巰基的酶反應，抑制此類酶的生物活性，中斷糖酵解，從而影響提供細胞生命活動能量的物質(zhì)（ATP）的生成，特別是抑制磷酸甘油醛脫氫酶的活性。

2 百菌清的降解方法

百菌清在土壤中積聚過多，使其降解速率減慢，半衰期延長［17］。目前降解土壤中百菌清的方法包括物理法、化學法和生物法［18-19］，其原理及優(yōu)缺點見表1。

表1 百菌清的降解方法、原理及優(yōu)缺點

物理法和化學法成本較高，不適宜用做面源污染的修復，不僅工作量大，還易造成二次污染。微生物分布廣泛，有很強的適應能力和多種代謝途徑，生物法成為降解殘留農(nóng)藥的主要方法。下面重點介紹采用生物修復技術(shù)處理百菌清污染土壤的相關(guān)研究進展。

3 百菌清污染土壤的生物修復效果

3.1 降解菌株及其效果

近年研究發(fā)現(xiàn)，土壤中有多種微生物可降解百菌清，如黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum lupini）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、微球菌屬（Micrococcus）等［24］。Wang等［25］發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬可通過水解脫氯降解百菌清。曲迪［26］使用克雷伯氏菌屬等3株混合菌降解含量為200 mg/kg的百菌清污染土壤12 d后，百菌清降解率為80.68%。梁斌［27］篩得的CTN-11對百菌清含量為50 mg/kg的滅菌土壤和未被滅菌土壤降解3 d后，均檢測不到百菌清。Wang等［25］采用銅綠假單胞菌降解含量為20 mg/kg的百菌清污染土壤，降解4 d后檢測不到百菌清。本課題組也發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌可高效降解百菌清，但該菌株是國家明令禁止使用的生物肥料，因此在選用菌株降解百菌清時需考察其生物毒性，以免影響原土著微生物的生存和生長。

3.2 功能酶與降解途徑

微生物降解百菌清主要通過酶的催化作用，將百菌清吸到胞內(nèi)，通過分泌胞內(nèi)或胞外降解酶來降解百菌清，其中伴隨水解、氧化還原等過程［28］。微生物對百菌清的主要降解途徑有：

1）百菌清苯環(huán)上的氰基通過水合作用形成酰胺或被進一步氧化成羧酸基團［29-36］。

2）在巰基（—SH）和谷胱甘肽（GSH）存在的條件下，百菌清苯環(huán)上的氯原子被谷胱甘肽催化，即被巰基取代，形成絡合物，這個過程中百菌清苯環(huán)上最多可有3個氯原子被脫除［34，37］。

3）苯環(huán)上氯原子被甲硫基取代［29-30，32，35-36］。

4）苯環(huán)上氯原子被甲氧基取代［29-30，32，35，36］。

5）在百菌清水解脫氯酶（Chd）存在時水解脫氯形成被羥基取代的百菌清［29-35］。

6）苯環(huán)上的氯原子被氫原子取代，再進一步礦化為水、CO2和其他無機物，具體途徑如下。礦化是最理想的降解途徑，該過程的缺點是大多數(shù)菌株需在其他碳源存在時才能發(fā)揮降解作用。

研究表明［35，38］，好氧時百菌清降解率增大，百菌清可通過水解和巰基取代、還原的方式脫氯降解［39-40］。Carlo-Rojas等［40］研究發(fā)現(xiàn)，厭氧時百菌清通過苯環(huán)羧化和還原脫氯來降解。常見的降解酶有氧化還原酶和水解酶。水解酶不需其他輔酶和輔助因子，生物降解性能較佳。氧化還原酶對百菌清也有很好的降解效果［28］。Kim等［37］從Ochrobaerrum sp.SH35中克隆谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）基因在大腸桿菌中成功表達后，形成百菌清與谷胱甘肽結(jié)合的絡合物。Wang等［25］從百菌清高效降解菌Pseudomonas sp.CTN-3中成功克隆到Chd基因，水中的羥基取代苯環(huán)上的氯原子，且無需能量和輔助因子。

3.3 降解產(chǎn)物分析

Ríos-Montes等［35］發(fā)現(xiàn)，單一微生物無法將百菌清徹底礦化成CO2。目前文獻報道的百菌清代謝產(chǎn)物主要有：4-羥基-2，5，6-三氯異二苯腈、間苯二腈、三氯苯二甲腈、3-氰基-四氯苯甲酰胺、1，3-二酰胺-四氯苯等［41-42］。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌在無其他碳源時，處理48 h后對含量為20 mg/L的百菌清降解率為97.38%，對百菌清含量為10 mg/kg、含水率為40%的土壤中的百菌清降解率為99.21%，使用液質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物為巰基百菌清、羥基百菌清。Motonaga等［43］篩得的TBI菌株降解百菌清后產(chǎn)物是羥基百菌清和 Cl-。Liang等［44］檢測到 Ochrobactrum sp.CTN-11降解百菌清的產(chǎn)物為羥基百菌清。史秀珍［28］利用蒼白桿菌（Ochrobact rum lupini）TP2D1降解百菌清的產(chǎn)物為4-羥基-2，5，6-三氯異二苯腈和 1，3-二酰胺-四氯苯。通過查閱化學品毒性資料發(fā)現(xiàn)，降解產(chǎn)物中三氯苯二腈的大鼠經(jīng)口LD50大于300 mg/kg，4-羥基-2，5，6-三氯異二苯

腈LD50大于332 mg/kg，間苯二腈LD50大于860 mg/kg，這些產(chǎn)物毒性都大于百菌清（百菌清LD50大于10 000 mg/kg）。其中停留時間更長、移動性更好的4-羥基-2，5，6-三氯異二苯腈可溶于水，其毒性是百菌清的30倍左右，會抑制土壤中微生物的呼吸作用。4-巰基百菌清會產(chǎn)生腎毒性，是對嚙齒類動物引起腎損傷的主要誘因。羥基百菌清對魚類和無脊椎動物毒性很低，但不能進一步降解為水、CO2或其他無機物。質(zhì)量分數(shù)為1%的間苯二腈被國際癌癥研究機構(gòu)（ IARC）鑒別為可能的人類致癌物，間苯二腈和三氯苯二腈等其他產(chǎn)物均會對呼吸道、眼睛和皮膚產(chǎn)生刺激或腐蝕，但暫無這些產(chǎn)物的生態(tài)毒性、土壤中的遷移性、持久性和降解性數(shù)據(jù)資料。如上所述，部分降解產(chǎn)物有毒甚至毒性高于百菌清本體，因此需分析百菌清降解后產(chǎn)物毒性，以免造成更大的毒害。

3.4 其他影響因素

土壤本身的理化性質(zhì)、溫度以及水分、微生物的種類等都會對修復百菌清污染產(chǎn)生影響。Shi等［30］發(fā)現(xiàn)含水率60%、溫度為30 ℃時，微生物對百菌清降解率最高。另外，百菌清在真菌和腐殖質(zhì)的作用下降解速率會提高［45］。溶液pH大于8時，pH越大百菌清降解率越高［27］。Bending等［46］發(fā)現(xiàn)，隨著土壤中有機質(zhì)含量的增加，百菌清降解率增大。

4 結(jié)語與展望

與物理法和化學法相比，生物法降解百菌清是一種高效、易行、廉價的降解方法，對修復百菌清污染土壤具有突出優(yōu)勢。依據(jù)目前土壤中百菌清降解研究現(xiàn)狀和本課題組前期研究成果，今后研究重點應該集中在降解中間產(chǎn)物毒性分析及其進一步降解與轉(zhuǎn)化。而單一菌株可能無法實現(xiàn)百菌清的徹底降解和無害化，復合菌制劑或多酶復合體系可能是實現(xiàn)這一研究目標的有效途徑之一。此外，研究百菌清降解關(guān)鍵酶實現(xiàn)環(huán)保高效降解也是今后的研究方向。采用生物修復實現(xiàn)百菌清徹底降解和無害化有望為農(nóng)藥殘留治理和食品安全提供堅實保證。

［1］Chaves A，Shea D，Cope W G. Environmental fate of chlorothalonil in a Costa Rican banana plantation［J］.Chemosphere，2007，69（7）：1166-1174.

［2］DeLorenzo M E，Wallace S C，Danese L E，et al.Temperature and salinity effects on the toxicity of common pesticides to the grass shrimp，palaemonetes pugio［J］.J Environ Sci Health，Part B，2009，44（5）：455-460.

［3］張滿云，滕應，朱燁，等.百菌清重復施用后在土壤中的殘留及其對微生物群落的影響［J］.土壤，2014，46（5）：839-844.

［4］褚意新，張仟春，鄭萍，等.百菌清含量測定的氣相色譜分析［J］.價值工程，2015，34（7）：324-326.

［5］Fernández-García J C，Arrebola J P，González-Romero S，et al.Diabetic ketoacidosis following chlorothalonil poisoning［J］.Occup Environ Medic，2014，71（5）：382-382.

［6］楊曉梅，塔娜，徐永明，等.中國有機氯農(nóng)藥的監(jiān)測現(xiàn)狀［J］.化工環(huán)保，2013（2）：123-128.

［7］Bae H K，Cha C G.Biodegradation of chlorothalonil，fenobucarb and methidathion in Nakdong River，South Korea［J］.Asian J Water，Environ Pollut，2015，12（3）：71-74.

［8］昝樹婷，楊如意，李靜，等.百菌清對土壤微生物特性和水稻生物量的影響［J］.生物學雜志，2015，32（3）：42-45.

［9］Kwon H，Kim T K，Hong S M，et al.Effect of household processing on pesticide residues in fi eld-sprayed tomatoes［J］.Food Sci Biotechnol，2015，24（1）：1-6.

［10］王光利.假單胞菌菌株CTN-3對百菌清污染土壤的生物修復［J］.Chin J Appl Ecol，2012，23（3）：807 -811.

［11］谷曉明，魏朝俊，賈臨芳，等.百菌清降解菌 BJQ2的分離，鑒定及影響因素研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2012，31（2）：306-311.

［12］Okorski A，Pszczó?kowska A，Oszako T，et al.Current possibilities and prospects of using fungicides in forestry［J］.Forest Res Paper，2015，76（2）：191-206.

［13］萬陽芳，李慧穎，劉俊果，等.農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留化學降解方法研究進展［J］.河北工業(yè)科技，2014，31（2）：148-151.

［14］袁大偉，呂衛(wèi)光，李雙喜，等.農(nóng)藥在蔬菜中的殘留動態(tài)及降解規(guī)律研究［J］.中國農(nóng)學通報，2014，30（9）：317-320.

［15］Godard T，F(xiàn)essard V，Huet S，et al.Comparative in vitro and in vivo assessment of genotoxic effects of etoposide and chlorothalonil by the comet assay［J］.Mutat Res/Genet Toxicol Environ Mutag，1999，444

（1）：103-116.

［16］Meena V D，Dotaniya M L，Coumar V，et al.A Case for silicon fertilization to improve crop yields in tropical soils［J］.Proceed Nation Acade Sci，India Section B：Biolog Sci，2014，84（3）：505-518.

［17］Blunt T D，Brunk G，Koski T， et al.Typhula blight development in Poa annua and Poa pratensis as infl uenced by persistence of the fungicides chlorothalonil and fludioxonil under snow cover［J］.Canad J Plant Pathol，2015，37（2）：165-178.

［18］高闖，張全，王繼鋒.萘降解菌的篩選及其對多環(huán)芳烴的降解［J］.化工環(huán)保，2015，35（1）：17-20.

［19］Tan Yongqiang，Huang Qinghua，Shi Taozhong，et al.Promoting photosensitized reductive dechlorination of chlorothalonil using epigallocatechin gallate in water［J］.J Agricul Food Chem，2014，62（50）：12090 -12095.

［20］ Porras J，F(xiàn)erná ndez J J，Torres-Palma R A，et al.Humic substances enhance chlorothalonil phototransformation via photoreduction and energy transfer［J］.Environ Sci Technol，2014，48（4）：2218-2225.

［21］李學德，花日茂，岳永德，等.百菌清（chlorothalonil）在水中的光化學降解［J］.應用生態(tài)學報，2006，17（6）：1091-1094.

［22］Tan Yongqiang，Xiong Haixia，Shi Taozhong，et al.Photosensitizing effects of nanometer TiO2on chlorothalonil photodegradation in aqueous solution and on the surface of pepper［J］.J Agricul Food Chem，2013，61（21）：5003-5008.

［23］周瑤，李陽，王玉軍，等.臭氧對土壤中百菌清降解的影響［J］.東北林業(yè)大學學報，2012，40（1）：62-65.

［24］Staley Z R，Rohr J R，Senkbeil J K，et al.Agrochemicals indirectly increase survival of E.coli O157：H7 and indicator bacteria by reducing ecosystem services［J］.Ecolog Appl，2014，24（8）：1945-1953.

［25］Wang Guangli，Li Rong，Li Shunpeng，et al.A novel hydrolytic dehalogenase for the chlorinated aromatic compound chlorothalonil［J］.J Bacteriol，2010，192（11）：2737-2745.

［26］曲迪.百菌清降解菌的降解特性及其對污染土壤的修復效果研究［D］.吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學，2012.

［27］梁斌.百菌清降解菌株分離鑒定、降解特性和降解基因克隆研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2010.

［28］史秀珍.百菌清降解菌的篩選及其降解特性研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2007.

［29］張博，張悅麗，李彥，等.百菌清在不同季節(jié)設施蔬菜上的殘留降解規(guī)律研究［J］.中國農(nóng)學通報，2014，30（16）：312-316.

［30］Shi Xiuzhen，Guo Rongjun，Miao Zuoqing，et al.Chlorothalonil degradation by Ochrobactrum lupini strain TP-D1 and identification of its metabolites［J］.World J Microbiol Biotechnol，2011，27（8）：1755-1764.

［31］Wang Guangli，Liang Bin，Li Feng，et al.Recent advances in the biodegradation of chlorothalonil［J］.Current Microbiol，2011，63（5）：450-457.

［32］Jin Xiangxiang，Cui Ning，Zhou Wei，et al.Soil genotoxicity induced by successive applications of chlorothalonil under greenhouse conditions［J］.Environ Toxicol Chem，2014，33（5）：1043-1047.

［33］Zhang Manyun，Teng Ying，Zhu Ye，et al.Isolation and characterization of chlorothalonil-degrading bacterial strain H4 and its potential for remediation of contaminated soil［J］.Pedosphere，2014，24（6）：799-807.

［34］Kwon J W，Armbrust K L.Degradation of chlorothalonil in irradiated water/sediment systems［J］.J Agricul Food Chem，2006，54（10）：3651-3657.

［35］Ríos-Montes K A，Pe?uela-Mesa G A.Chlorothalonil degradation by a microbial consortium isolated from constructed wetlands in laboratory trials［J］.Actualidades Biológicas，2015，37（102）：255-265.

［36］Van Scoy A R，Tjeerdema R S.Environmental fate and toxicology of chlorothalonil［M］.Heidelberg，F(xiàn)RG：Springer International，2014：89-105.

［37］Kim Y M，Park K，Joo G J，et al.Glutathione-dependent biotransformation of the fungicide chlorothalonil［J］.J Agricul Food Chem，2004，52（13）：4192-4196.

［38］Van Eeden M，Potgieter H C，Van der Walt A M.Microbial degradation of chlorothalonil in agricultural soil：A laboratory investigation［J］.Environ Toxicol，2000，15（5）：533-539.

［39］Van Pee K H，Unversucht S.Biological dehalogenation and halogenation reactions［J］.Chemosphere，2003，52（2）：299-312.

［40］Carlo-Rojas Z，Bello-Mendoza R，F(xiàn)igueroa M S，et al.Chlorothalonil degradation under anaerobic conditions in an agricultural tropical soil［J］.Water，Air，Soil Pollut，2004，151（1/2/3/4）：397-409.

［41］郎漫，李平，蔡祖聰.百菌清在土壤中的降解及其生態(tài)環(huán)境效應［J］.中國農(nóng)學通報，2012，28（15）：211-215.

［42］張曉菲.一株百菌清降解菌株的分離鑒定及其對土

壤中百菌清污染的修復研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2013.

［43］Motonaga K，Takagi K，Matumoto S.Suppression of chlorothalonil degradation in soil after repeated application［J］.Environ Toxicol Chem，1998，17（8）：1469-1472.

［44］Liang Bin，Li Rong，Jiang Dong，et al.Hydrolytic dechlorination of chlorothalonil by Ochrobactrum sp.CTN-11 isolated from a chlorothalonil-contaminated soil［J］.Curr Microbiol，2010，61（3）：226-233.

［45］Du J，Singh H，Ngo H T T，et al.Lysobacter tyrosinelyticus sp.nov.isolated from Gyeryongsan national park soil［J］.J Microbiol，2015，53（6）：365-370.

［46］Bending G D，Rodriguez-Cruz M S，Lincoln S D.Fungicide impacts on microbial communities in soils with contrasting management histories［J］.Chemosphere，2007，69（1）：82-88.

（編輯 祖國紅）

Research progresses in bioremediation of chlorothalonil contaminated soil

Tang Liwei1，Lu Diannan2，Liu Yongmin1
（ 1.College of Chemistry，Chemical Engineering and Environment Engineering，Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China； 2.Key Laboratory of Industrial Biocatalysis，Ministry of Education，Department of Chemical Engineering，Tsinghua University，Beijing 100084，China）

Aiming at the features and problems of chlorothalonil in soil，such as stable efficacy，difficult to be decomposed，long metabolic cycle，and serious soil pollution caused by long-term dosing，the toxicity mechanism of chlorothalonil is briefl y introduced.The principles as well as the advantages and disadvantages of physical，chemical and biological methods for chlorothalonil degradation in soil are summarized.The major degradation strains and their effects，the degradation pathways，the degradation products and the toxicity of the products in bioremediation of chlorothalonil contaminated soil are expounded.The factors affecting chlorothalonil degradation are analyzed，such as soil property，microbial species，temperature and soil moisture content.The focal points for further research are put forward，such as：the toxicity analysis of intermediate degradation products，the further degradation and conversion of the intermediate products and the development of complex bacteria preparations or multi-enzyme complex systems，by which chlorothalonil can be degraded completely and become harmless.

chlorothalonil；contaminated soil；bioremediation；degradation strain；degradation pathway；degradation product

X53

A

1006-1878（2016）02-0131-06

10.3969/j.issn.1006-1878.2016.02.003

2015-10-08；

2015-11-13。

唐麗偉（1990—），女，遼寧省沈陽市人，碩士生，電話 17888841929，電郵 623473061@qq.com。聯(lián)系人：劉永民，電話 13942331811，電郵 liu79ym@tom.com。

國家自然科學基金項目（21276139）。