番茄紅素在微乳液制備和貯藏過程中構(gòu)型轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定性研究

王曉文 ， 張華偉 ， 閆圣坤 ， 李 婧 ， 李 紅 ， 張連富 *，2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫21412）

番茄紅素是一種直鏈型碳氫化合物，分子中含有11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵，理論上存在2 048種立體異構(gòu)體，實際可能存在的異構(gòu)體種類也有72種[1]。人和動物自身不能合成番茄紅素，人體內(nèi)的番茄紅素來源于膳食，以番茄及番茄制品、西瓜、番石榴、木瓜為主[2]。近年來，一些實驗研究表明，番茄紅素比其它類胡蘿卜素有更強的淬滅單線態(tài)氧自由基的能力[3]，其能力是β-胡蘿卜素的2倍、α-生育酚的100倍[4]；番茄紅素可以降低某些癌癥（如乳腺癌、消化道癌、前列腺癌）的發(fā)病幾率，可以預防心血管疾病[5-6]。

番茄紅素作為一種功能性天然紅色素，被廣泛應用于保健食品、醫(yī)藥和化妝品中。番茄紅素高度不飽的結(jié)構(gòu)導致它的穩(wěn)定性很差，因此番茄紅素在加工的過程中容易發(fā)生氧化降解和順反異構(gòu)化反應，經(jīng)熱處理制備得到的番茄紅素制品中發(fā)現(xiàn)了順式異構(gòu)體[7-8]。尤其在高溫處理過程中番茄紅素異構(gòu)化非常明顯，番茄紅素的氧化降解和異構(gòu)化不僅影響含番茄紅素制品的色澤，進而影響番茄紅素制品的營養(yǎng)價值。一些研究表明，順式結(jié)構(gòu)的番茄紅素更容易被人體吸收，并且較全反式的番茄紅素具有更強的生理效能[9]，番茄紅素制品的生物效能不僅與番茄紅素的含量有關(guān)而且也與番茄紅素的異構(gòu)化有關(guān)。有關(guān)水溶性番茄紅素微乳液在加工過程中番茄紅素結(jié)構(gòu)變化、番茄紅素微乳液在不同貯藏條件下貯藏所引起的番茄紅素氧化和異構(gòu)化的的研究比較少，因此，研究番茄紅素微乳液在加工和貯藏過程中番茄紅素的氧化和異構(gòu)化，對于正確地選擇加工工藝和貯藏條件至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

番茄紅素（質(zhì)量分數(shù)為90%）：華北制藥股份有限公司產(chǎn)品；中鏈甘油三酸酯：食品級，浙江建德市千島精細化工有限公司產(chǎn)品；抗氧化劑：食品級，廣州泰邦食品添加劑有限公司產(chǎn)品；吐溫40：食品級，廣州市潤華食品添加劑有限公司產(chǎn)品；乙腈、四氫呋喃：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

DH-700型油浴鍋：常州普天儀器制造公司產(chǎn)品；HH4恒溫水浴鍋：江蘇金壇市榮華儀器有限公司產(chǎn)品；SD-250A型恒溫培養(yǎng)箱：南京實驗儀器廠產(chǎn)品；冰箱；KJ-300超聲波發(fā)生器：無錫浩潔超聲電子設備有限公司產(chǎn)品；UV-2012PCS紫外可見風光光度計：UNICO中國有限公司產(chǎn)品；Waters2695高效液相色譜儀：Waters公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄紅素微乳液的制備 稱取番茄紅素粉末（90%）加入中鏈甘油三酸酯中在一定的溫度下加熱溶解一段時間，接著加入吐溫和乙二醇乳化，乳化完成后加入蒸餾水，得到水溶性番茄紅素乳液。

1.2.2 番茄紅素微乳液中番茄紅素的提取 量取2 mL番茄紅素微乳液加入10 mL蒸餾水稀釋，加入乙酸乙酯進行3次萃取，萃取過程在80℃的水浴中進行，乙酸乙酯提取液用無水硫酸鈉進行脫水，過濾，得番茄紅素提取液，并用乙酸乙酯定容至100 mL。用微孔過濾膜（0.45 μm）進行過濾，所得濾液在4℃冰箱保藏備用。以上所有操作盡量避光。

1.2.3 番茄紅素微乳液在不同條件下的儲藏 取一定量的番茄紅素微乳液裝瓶并用錫箔紙包裝，充氮氣封口。然后分別置于入4、25、37℃的條件下進行貯藏，在貯藏過程中定期取樣檢測微乳液中番茄紅素的變化。

1.2.4 紫外-可見光譜鑒定微乳液中番茄紅素結(jié)構(gòu)的變化 用紫外可見分光光度計對番茄紅素微乳液中的番茄紅素乙酸乙酯提取液進行UV-Vis光譜掃描，并與全反式番茄紅素的乙酸乙酯溶液的UVVis光譜掃描光譜圖比較，通過觀察兩者之間的區(qū)別，確定番茄紅素微乳液中是否存在順式結(jié)構(gòu)的番茄紅素。

1.2.5 HPLC分離番茄紅素乳液中不同結(jié)構(gòu)的番茄紅素 色譜柱：COSMOSIL Cholester柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈與四氫呋喃的體積分數(shù)梯度洗脫，乙腈在60 min內(nèi)由體積分數(shù)100%減小到90%，60～80 min內(nèi)乙腈維持90%；流量為1 mL/min；檢測波長為472 nm；柱溫25℃；進樣量為10 μL；二極管陣列檢測器。

1.2.6 番茄紅素各HPLC圖譜峰的鑒定 用高效液相色譜對不同結(jié)構(gòu)的番茄紅素異構(gòu)體進行分離并用二極管陣列檢測器對每一個圖譜峰進行紫外-可見光譜掃描，通過各色譜峰的全波長掃描圖、主要吸收峰的波長和Q值 （Q值即為在362 nm處的吸收強度與最大吸收峰吸收強度的比值）來鑒定番茄紅素屬于那種構(gòu)型。

1.2.7 番茄紅素標準曲線的繪制 準確稱取質(zhì)量分數(shù)為90%的番茄紅素粉末22.22 mg溶解于100 mL乙酸乙酯中，配制成20 mg/dL的番茄紅素乙酸乙酯溶液，再將此溶液分別配制成番茄紅素質(zhì)量濃度 分 別 為 2、4、6、8、10 mg/dL 系 列 標 準 溶 液 ， 用HPLC測定各溶液的峰面積。以標準溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，繪制番茄紅素標準曲線，得到線性方程為：Y=2 895 510x+414 430（R2=0.999 5）。

2 結(jié)果與討論

2.1 番茄紅素在微乳液制備過程中的氧化和異構(gòu)化

2.1.1 紫外-可見光譜鑒定番茄紅素順式異構(gòu)體對比全反式番茄紅素乙酸乙酯溶液全波長掃描圖（圖1）與番茄紅素微乳液中番茄紅素乙酸乙酯提取液的全波長掃描圖（圖2）可知，兩個全波長掃描圖中番茄紅素分別在447、473、503 nm處有3個最大吸收波長；但是番茄紅素微乳液中的番茄紅素的特征吸收光譜發(fā)生變化，在近紫外區(qū)（361 nm）處出現(xiàn)了特征吸收峰，此波長的特征吸收是由于反式番茄紅素異構(gòu)化為順式異構(gòu)體而引起的，因此可以初步確定番茄紅素微乳液在加工過程中番茄紅素的結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化。

圖1 全反式番茄紅素紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-Visible spectrum of all-trans lycopene

圖2 番茄紅素微乳液中番茄紅素紫外-可見光譜圖Fig.2 UV-Visible spectrum of lycopene in lycopene microemulsion

2.1.2 HPLC分離并鑒定番茄紅素順式異構(gòu)體 從圖3中的HPLC圖譜峰中可以看到，全反式的番茄紅素經(jīng)HPLC分離出現(xiàn)了一個單一的色譜峰，且其在此液相條件下的保留時間（Rt）為57.13 min，從此色譜峰的UV-Vis光譜可知全反式番茄紅素3個最大吸收峰分別為447、473、505 nm。由于全反式番茄紅素不穩(wěn)定，因此在加工的過程中容易發(fā)生了氧化降解和異構(gòu)化；從圖4中可以看到，經(jīng)加過處理所得番茄紅素微乳液中的番茄紅素經(jīng)液相色譜分離得到了7個色譜峰，由這7個色譜峰及每個色譜峰的UV-Vis光譜可知，保留時間（Rt）為56.55 min所對應的成分與圖3中全反式番茄紅素的保留時間基本一致（Rt=57.13 min），并且其UV-Vis光譜與圖3中全反式番茄紅素UV-Vis光譜完全一致 （最大吸收分別為447、473、505 nm），因此可以認定此成分為全反式番茄紅素。

圖4 番茄紅素乳液中不同結(jié)構(gòu)番茄紅素的HPLC色譜峰與依次相應的UV-Vis光譜圖Fig.4 HPLC chromatogram （a）and the UV-Vis spectrum （b～h）of different lycopene in lycopene microemulsion

其中，色譜峰上保留時間（Rt=48.8、Rt=51.15、Rt=53.78、Rt=61.07 min）對應的成分的UV-Vis光譜與全反式番茄紅素的UV-Vis光譜類似，但是它們都在361 nm處出現(xiàn)了一個較強的特征吸收峰，且主要吸收峰的峰高也略微降低，并向紫外區(qū)轉(zhuǎn)移4～12 nm。這些變化與番茄紅素順式異構(gòu)體的UVVis光譜一致，可以認定這4中成分為4種不同構(gòu)型的番茄紅素順式異構(gòu)體。

另外，保留時間（Rt=44.6 min，Rt=46.68 min）對應成分的UV-Vis光譜圖與全反式番茄紅素的UVVis光譜相比有明顯的變化，兩者都有5個最大特征吸收峰，且其最大吸收峰較全反式番茄紅素紫移30 nm左右 ，這些變化與番茄紅素氧化產(chǎn)物和裂解產(chǎn)物的UV-Vis光譜相似，F(xiàn)erreira[10]的研究中番茄紅素氧化產(chǎn)物的UV-Vis光譜中特征吸收峰出現(xiàn)在400、420、450 nm，因此可以初步推斷兩者為番茄紅素氧化產(chǎn)物或裂解產(chǎn)物，其具體結(jié)構(gòu)的鑒定尚待進一步的研究。

表1 番茄紅素乳液中不同構(gòu)型番茄紅素HPLC色譜峰的鑒定Table 1 Identification of HPLC chromatogram of different lycopene in lycopene microemulsion

通過表1中的實驗數(shù)據(jù)和文獻報道數(shù)據(jù)的對比，可以確定番茄紅素微乳液中幾種不同構(gòu)型番茄紅素異構(gòu)體：R=53.78 min為 9-cis，R=56.55 min為all-trans，R=61.07 min 為 13-cis；另外，R=48.80 min為X1-cis，R=51.15 min為X2-cis。其中一些實驗數(shù)據(jù)和文獻報道數(shù)據(jù)略有差異，分析其主要原因是不同的文獻中采用不同的流動相和色譜條件所致。

2.1.3 番茄紅素乳液中各種不同構(gòu)型番茄紅素異構(gòu)體的質(zhì)量分數(shù) 由于分子中含有13個雙鍵，全反式番茄紅素在熱處理過程中非常不穩(wěn)定。在番茄紅素微乳液在制備過程中，全反式番茄紅素經(jīng)油中的高溫溶解、高溫乳化后發(fā)生了明顯的異構(gòu)化，從表2的數(shù)據(jù)可知，與處理前的番茄紅素粉（只含全反式番茄紅素）相比番茄紅素微乳液中全反式番茄紅素所占比例明顯減少，占總番茄紅素的43.99%。其中，順式番茄紅素中9-cis的含量最多，占番茄紅素總量的17.96%，13-cis的含量略少于9-cis，占總量的15.65%，另外兩種順式番茄紅素占比都少于10%；另外，在加工過程中產(chǎn)生的番茄紅素氧化產(chǎn)物或裂解產(chǎn)物占總番茄紅素的4.91%。

表2 番茄紅素微乳液中不同構(gòu)型番茄紅素的質(zhì)量分數(shù)Table 2 Ratio of different lycopene in lycopene microemulsion

2.2 番茄紅素微乳液在不同條件下貯藏過程中番茄紅素穩(wěn)定性

2.2.1 番茄紅素微乳液在4℃貯藏過程中番茄紅素的穩(wěn)定性 從圖5可以看出，順式番茄紅素的總量隨時間的延長逐漸減少，在前10 d貯藏過程中總順式番茄紅素下降較快，但貯藏10 d其保留率下降緩慢，貯藏40 d后，其保留率約為80%。反式番茄紅素在前15 d貯藏過程中呈緩慢的下降趨勢，貯藏15 d時保留率約為92.5%，貯藏15 d后其保留率呈緩慢的上升趨勢，28 d時保留率最大達到93.8%，這可能是由于番茄紅素微乳液中一部分順式異構(gòu)體異構(gòu)化為反式番茄紅素的原因，Lovric等人[14]也認為番茄紅素在貯藏過程中會發(fā)生順-反互變現(xiàn)象。在此條件下貯藏番茄紅素總量保留率逐漸緩慢下降，40天后其保留率約為86%。

圖5 在4℃貯藏過程中番茄紅素總量、反式番茄紅素和順式番茄紅素總量的變化Fig.5 Change of total amount of lycopene，trans lycopene and total amount of cis-lycopene during the storage at 4℃

圖6 在4℃貯藏過程中各順式番茄紅素的變化Fig.6 Change of all cis-lycopene during the storage at 4℃

從圖6可以看出，各順式番茄紅素的保留率在貯藏過程中都呈現(xiàn)下降趨勢，但是不同順式異構(gòu)體保留率隨貯藏時間的延長其變化存在顯著的差異，其中13-順式番茄紅素的穩(wěn)定性最差，貯藏40 d后其保留率約為63%。9-順式番茄紅素和X1-順式番茄紅素在此條件下貯藏穩(wěn)定性相當，貯藏40 d后兩者的保留率約為80%。另外，X2-順式番茄紅素的穩(wěn)定性最好，在4℃下貯藏40 d后損失率僅為5%。

2.2.2 番茄紅素微乳液在25℃貯藏過程中番茄紅素的穩(wěn)定性 從圖7可以看出，在25℃下貯藏時，番茄紅素總量和總順式番茄紅素的變化情況與4℃下貯藏相似，但是在此條件下貯藏兩者的保留率要比4℃下低，貯藏40 d后它們的保留率分別為68.6%、47.9%，這一變化說明溫度升高能夠促進番茄紅素的降解，許時嬰等人[15]的研究中也報道溫度對番茄紅素粉中的番茄紅素降解有促進作用。反式番茄紅素在貯藏過程中的變化趨勢類似于4℃下貯藏，但是與4℃下貯藏相比反式番茄紅素在25℃下貯藏8 d后，由起初的緩慢下降趨勢變?yōu)榫徛纳仙厔荩以?5 d后保留率又開始緩慢下降。

圖7 在25℃貯藏過程中番茄紅素總量、反式番茄紅素和順式番茄紅素總量的變化Fig.7 Changeoftotalamountoflycopene，translycopeneand totalamountofcis-lycopeneduringthestorageat25℃

圖8 在25℃儲藏過程中各順式番茄紅素的變化Fig.8 Change of all cis-lycopene during the storage at 25℃

從圖8可知，各順式番茄紅素量在25℃下貯藏時都逐漸下降，但是由于溫度升高能加速番茄紅素的降解，因此它們在此條件下的氧化降解速率明顯大于4℃時的氧化速率，其中13-順式番茄紅素的變化最為明顯，貯藏40 d后保留率僅為12.8%，X2-順式番茄紅素保留率約為4℃貯藏的一半，9-順式番茄紅素保留率變化較小。

2.2.3 番茄紅素微乳液在37℃儲藏過程中番茄紅素的穩(wěn)定性 從圖9和圖10可以看出，番茄紅素微乳液在37℃下貯藏時，番茄紅素的變化趨勢與低溫貯藏的變化趨勢一致，但是反式番茄紅素的保留率的變化明顯小于順式番茄紅素保留率的變化，這就說明溫度對順式番茄紅素的影響大于反式番茄紅素。另外，溫度變化對不同結(jié)構(gòu)順式番茄紅素降解的影響不同，其中13-順式番茄紅素在37℃下貯藏起初階段降解非常明顯，10后其保留率小于10%，但是在接下來的貯藏過程中其降解速率非常緩慢，貯藏40 d后保留率仍約為4.5%。其余幾種順式番茄紅素都逐漸降解。

圖9 在37℃儲藏過程中番茄紅素總量、反式番茄紅素和順式番茄紅素總量的變化Fig.9 Change of total amount of lycopene，trans lycopene and total amount of cis-lycopene during the storage at 37℃

圖10 在37℃儲藏過程中各順式番茄紅素的變化Fig.10 Change of all cis-lycopene during the storage at 37℃

3 結(jié)語

1）在番茄紅素微乳液在制備過程中全反式的番茄紅素能異構(gòu)化為4種不同結(jié)構(gòu)的順式番茄紅素， 它們分別為：x1-cis、x2-cis、9-cis 和 13-cis，且在番茄紅素微乳液中的質(zhì)量分數(shù)分別為：7.85%、9.64%、17.96%和15.65%。

2）番茄紅素微乳液在4℃下貯藏時，總順式番茄紅素保留率隨貯藏時間的延長逐漸下降，貯藏40 d后其保留率約為80%。反式番茄紅素的保留率在前15 d貯藏過程中呈緩慢的下降趨勢，15 d之后其保留率呈緩慢的上升趨勢，28 d時保留率最大達到93.8%，這可能是由于一部分順式番茄紅素異構(gòu)化為反式番茄紅素，隨后其保留率緩慢下降，40 d后保留率為93%。隨著貯藏溫度的升高番茄紅素的穩(wěn)定性逐漸降低，在25℃下貯藏40 d后總順式番茄紅素和反式番茄紅素保留率分別為47.9%、88.1%，在37℃下貯藏40 d后總順式番茄紅素和反式番茄紅素保留率分別為21.2%、76.4%，這說明溫度能促進番茄紅素的降解。

3）番茄紅素微乳液的各種番茄紅素異構(gòu)體中反式番茄紅素最為穩(wěn)定，9-cis次之，13-cis非常不穩(wěn)定，在37℃下貯藏10 d其保留率小于10%。

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