化橘紅HPLC指紋圖譜的建立

肖維強(qiáng)，張超洪，黃炳雄，戴宏芬，謝路斯，王曉容,*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東 廣州 510640；2.茂名市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 茂名 525011)

化橘紅HPLC指紋圖譜的建立

肖維強(qiáng)1，張超洪2，黃炳雄1，戴宏芬1，謝路斯2，王曉容1,*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東 廣州 510640；2.茂名市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 茂名 525011)

為建立廣東化州市特有藥材化橘紅的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，采用色譜條件為：Nucleosil C18反相柱(150mm×4.6mm，3μm)，DAD檢測(cè)器，流動(dòng)相為水-體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液+體積分?jǐn)?shù)15%～50%乙腈溶液，三元梯度洗脫，流速為0.3～1mL/min，柱溫35℃，分離波長315nm。結(jié)果表明：11批次的化橘紅提取物色譜圖共有峰9個(gè)；經(jīng)“中藥指紋圖譜鑒別分析系統(tǒng)”統(tǒng)計(jì)分析，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%以下，相似度均在0.965以上。本法符合指紋圖譜的要求，可建立共有模式，作為科學(xué)評(píng)價(jià)化橘紅產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)方法。

HPLC；化橘紅；香豆素；指紋圖譜

產(chǎn)于廣東化州市的名貴藥材化橘紅(Exocarpium citri Grandis，ECG)[1]，又名化州橘紅，是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)植物化州柚(C. grandis var.tanentosa ahaort.)或柚(C. grandis Osbeck)的栽培變種。自古以來，人們將化州柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮或全果經(jīng)加工成中藥化橘紅?；偌t具有化痰、理氣、健胃消食作用，臨床用于治療風(fēng)寒咳嗽、喉癢痰多、食積酒傷、嘔惡痞悶等癥[2]，當(dāng)?shù)亓鱾饔小耙黄登Ы稹钡恼f法。據(jù)報(bào)道，化橘紅中的有效成分有黃酮類化合物、揮發(fā)油、香豆素類化合物和多糖[3]。在生產(chǎn)實(shí)際中，來源于化州柚的是廣東特有的地道中藥材，為毛橘紅，果實(shí)上覆蓋細(xì)白毛；來源于柚的為光橘紅，果實(shí)無毛，屬非地道藥材，其原種植物為種與變種的關(guān)系。由于光橘紅的價(jià)格低廉，二者主要成分的常規(guī)檢測(cè)又均以柚皮苷黃酮類物質(zhì)為主，化學(xué)成分相差甚微，二者相混淆，常見的化學(xué)方法不易鑒別[4]，因此急需一種有效的檢測(cè)方法，來鑒別這些已加工成成品化橘紅的真?zhèn)?。近年來“中藥指紋圖譜”技術(shù)的應(yīng)用，為中藥材的質(zhì)量控制提供了有效的檢測(cè)手段[5]，中藥指紋圖譜能基本反映中藥的全貌，可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和整體物質(zhì)的全面控制。在指紋圖譜的研究領(lǐng)域，高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，為國內(nèi)外廣泛接受[6]，用于草藥的質(zhì)量評(píng)估[7]、植物化學(xué)成分的鑒定[8]及水果行業(yè)加工品的

真假鑒別等[9]。

對(duì)產(chǎn)于化州市10個(gè)不同地點(diǎn)的化州柚果實(shí)中黃酮類及香豆素類物質(zhì)進(jìn)行分離研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，其中有10種已知的香豆素類成分，以香豆素和異歐前胡素為主，本研究應(yīng)用HPLC技術(shù)和“中藥指紋圖譜鑒別分析系統(tǒng)”統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)來自化州市的化州柚產(chǎn)地11個(gè)點(diǎn)取樣，以香豆素為分離目標(biāo)，擬建立化橘紅的HPLC指紋圖譜。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

對(duì)照品和試劑與文獻(xiàn)[11]相同。羥甲香豆素(批號(hào)：100241-200501)、歐前胡素(批號(hào)：110826-200511)、異歐前胡素(批號(hào)：110827-200407) 中國藥品生物制品檢定所；香豆素(批號(hào)：076K1312)、7-甲氧基香豆素(批號(hào)：220337)、6-甲基香豆素(批號(hào)：S43336-417)、5,7-二甲氧基香豆素(批號(hào)：116238)、香檸檬亭(批號(hào)：01338) 美國Sigma公司；佛手內(nèi)酯(批號(hào)：110826-200511) 上海友思生物技術(shù)有限公司；呋喃香豆素(批號(hào)：304762) 美國IL公司；甲醇和乙腈(色譜純) 德國Merck公司；雙蒸餾水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀(配Agilent化學(xué)工作站和DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國Agilent公司；分離柱(填料為Nucleosil C18反相柱，150mm×4.6mm，3μm，卡套柱) 德國Macherey-Nagel公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品分離條件

10種香豆素混合標(biāo)準(zhǔn)品的分離參照肖維強(qiáng)等的方法加以改進(jìn)[11]。羥甲香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、呋喃香豆素、6-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、佛手內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素和香檸檬亭質(zhì)量濃度分別為10.200、10.000、5.200、9.600、15.000、10.000、5.000、10.000、8.000、9.800μg/mL。流動(dòng)相A為水、B為甲醇、C為乙腈，流速0.3～1mL/min，檢測(cè)波長315nm，柱溫35℃。

1.3 樣品的采集和處理

按照中藥指紋圖譜的繪制方法，樣品的采集需要10個(gè)點(diǎn)以上的原則[5]，采集廣東化州市產(chǎn)的化州柚果實(shí)作為研究材料。樣品采集地點(diǎn)和編號(hào)如下：平定鎮(zhèn)龍眼根村(南部)(S1)、平定鎮(zhèn)龍眼根村(中部)(S2)、平定鎮(zhèn)龍眼根村(北部)(S3)、平定鎮(zhèn)腰鼓村(S4)、平定鎮(zhèn)豐樹坪村(S5)、平定鎮(zhèn)鎮(zhèn)區(qū)(S6)、平定鎮(zhèn)青草灘村(S7)、化州市河西區(qū)樟村(S8)、化州市下街垌(S9)、化州市河西區(qū)三里塘村(S10)、平定鎮(zhèn)青草灘村(S11)。樣品的處理按參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行：將化州柚整個(gè)切成薄片狀，用開水燙1min，在65℃條件下烘干打成粉，60%以上過60目篩，其余顆粒以直徑不大于1mm為宜，在65℃烘至質(zhì)量恒定。分別稱0.200g于25mL容量瓶中，加30%的乙醇10mL浸泡過夜，超聲波提取20min，停止10min，再超聲波提取20min后，甲醇定容，靜止后取上清液經(jīng)0.5μm的微孔膜過濾進(jìn)樣。

1.4 精密度、精確度及樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11]的結(jié)果。

1.5 特征指紋圖譜的分析

應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的操作規(guī)范》(版本2 0 0 4 A，簡稱《評(píng)價(jià)系統(tǒng)》)，分析和繪制化橘紅的HPLC指紋圖譜[5]。

2 結(jié)果與分析

2.110 種對(duì)照品分離條件

流動(dòng)相A為水、B為甲醇、C為乙腈，三元梯度洗脫，起始流速0.3mL/min，梯度洗脫順序程序是：(50% B＋15% C)保持15min(流速0.3mL/min)、(50% B＋20% C)保持2min(流速0.4mL/min)、(50% B＋30% C)保持0.5min(流速0.6mL/min)、(50% B＋30% C)保持4.5min(流速0.8mL/min)、(50% B＋45% C)保持2min(流速1mL/ min)、(50% B＋50% C)保持3min(流速1mL/min)、(50% B＋50% C)保持3min(流速0.8mL/min)、(50% B＋30% C)保持2min(流速0.6mL/min)、(50% B＋15% C)保持3min (流速0.3mL/min)。檢測(cè)波長315nm，柱溫35℃。進(jìn)樣量20μL。在所選定的色譜條件下，10種對(duì)照品分離圖見圖1。

圖1 10種香豆素混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograph of mixed standard containing 10 kinds of coumarin such as hydroxy coumarin, coumarin, 7-methoxycoumarin, furanocoumarins, 6-methylcoumarin, 5,7-dimethoxycoumarin, bergamot lactone, imperatorin, isoimperatorin and bergamottin

按所選定的色譜條件，混合對(duì)照品的分離結(jié)果如圖1所示，可知，10種標(biāo)準(zhǔn)品在所選定的色譜條件下，除呋喃香豆素和6-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素和佛

手內(nèi)酯出現(xiàn)兩個(gè)小剪刀峰外，其余對(duì)照品得到了完全的分離。

2.2 樣品分離結(jié)果

按1.3節(jié)和2.1節(jié)的樣品處理方法和分離條件，將每個(gè)取樣點(diǎn)的化州柚進(jìn)行HPLC分析，重復(fù)3次?；蓁址蛛x結(jié)果見圖2(S10)。

圖2 化州柚10號(hào)樣品的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograph of coumarins in No. 10 tomentose pummelo peel

如圖2所示，在所選定的色譜條件下，樣品能得到滿意的分離，有21個(gè)峰能被積分。與對(duì)照品圖譜相比，已知的成分有香豆素、呋喃香豆素、佛手內(nèi)酯和異歐前胡素，保留時(shí)間分別為8.767、10.808、14.360、22.686min，其中香豆素、呋喃香豆素和異歐前胡素含量較高，此結(jié)果與以往分離的相同[11]。

2.3 精密度及標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

據(jù)以往的研究結(jié)果[11]，10種混合對(duì)照品在48h內(nèi)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于1.212%，峰面積的不高于3.466%，說明儀器穩(wěn)定且精密度高；對(duì)照品回收率在97.42%～105.72%之間，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[11]在1.414%～4.247%之間。樣品的提取液中含有比例較高的有機(jī)溶劑，相對(duì)較穩(wěn)定，但也應(yīng)在3 d內(nèi)測(cè)定，不宜久放。

2.4 化橘紅的指紋圖譜

2.4.1 特征共有峰分析

另由圖2可知，應(yīng)用評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行峰匹配，11個(gè)點(diǎn)的樣品指紋圖譜共有9個(gè)為共有峰，保留時(shí)間分別為8.125、8.787、10.808、12.655、14.360、16.145、22.227、22.680、26.255min，其中相匹配的3個(gè)強(qiáng)峰，分別占樣品峰總面積的14%～56%不等，另外幾個(gè)次強(qiáng)峰，其中有的是已知的香豆素成分，分別占樣品總面積的2%以上。9個(gè)共有峰面積的總和占總峰面積的95%以上。保留時(shí)間8.125min和8.787min為一組剪刀峰，位于8.787min的是香豆素，前面的組分含量高而且穩(wěn)定，化學(xué)成分尚待確定；10.808～19.163min為一組獨(dú)立的多

個(gè)峰，均能到基線，包括含量較高的呋喃香豆素和佛手內(nèi)酯；21.073～21.685min為M型峰，可分出3個(gè)小峰；22.227～23.885min為一組獨(dú)立的多個(gè)峰，均能到基線，其中包括含量較高的異歐前胡素；25.638～27.772min由M型和獨(dú)立的峰組成，其中包括含量很少的香檸檬亭。對(duì)于上述峰面積太小的峰，未作為特征峰分析。樣品分離過程中考慮到雜質(zhì)和有些成分含量太高和分離柱的承載能力，取樣很少，所以許多成分顯得很少，峰型不太理想，但能說明化橘紅中含有多種物質(zhì)。

表1 11個(gè)點(diǎn)的化橘紅HPLC指紋圖譜9個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Table1 Relative retention time of 9 common peaks in HPLC fingerprint of tomentose pummelo peel samples from 11 areas

表2 11個(gè)點(diǎn)的化橘紅HPLC指紋圖譜9個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積Table2 Relative peak areas of 9 common peaks in HPLC fingerprint of tomentose pummelo peel samples from 11 areas

保留時(shí)間為8.787、10.808、14.360、22.686min的分別是香豆素、呋喃香豆素、佛手內(nèi)酯和異歐前胡素，這4種物質(zhì)在樣品中含量較高而且穩(wěn)定。由于佛手內(nèi)酯峰位于色譜圖的中間，因此選擇14.360min的佛手內(nèi)酯峰為參考峰，以佛手內(nèi)酯的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果列表1、2。

由表1可知，11個(gè)點(diǎn)化橘紅指紋圖譜的9個(gè)共有峰，相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%以下，說明分離條件可靠、儀器穩(wěn)定。

表2中9個(gè)共有峰1、2號(hào)和4號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，說明這幾種物質(zhì)在多個(gè)樣品中含量較高且穩(wěn)定，尤其是1號(hào)峰，多個(gè)樣品經(jīng)多次分離均為相同結(jié)果，2號(hào)峰為香豆素，說明香豆素在樣品中含量較高，其余的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差高，說明這些成分在各個(gè)樣品中含量不均勻，存在很大的差異。

2.4.2 相似度分析

根據(jù)評(píng)價(jià)系統(tǒng)分析出的結(jié)果，圖3為11個(gè)點(diǎn)化橘紅樣品的指紋圖譜，表3為各指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度。

圖3 11個(gè)點(diǎn)化橘紅樣品的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of tomentose pummelo peel samples from 11 areas

表3 11個(gè)點(diǎn)化橘紅HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜R的相似度Table3 Similarity of tomentose pummelo peel samples from 11 areas compared with standard fingerprints

表3是評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)樣品S1～S11的HPLC色譜圖與對(duì)照指紋圖譜R進(jìn)行相似度的分析結(jié)果，相似度均在0.965以上，大于0.900[5]，符合指紋圖譜的要求，可建立共有模式。

3 討論與結(jié)論

3.1 本研究采用HPLC技術(shù)，在所設(shè)定的分離條件下，能完全分離化州柚果實(shí)中20種以上的物質(zhì)，其中有10種為已知的香豆素類成分。應(yīng)用中藥指紋圖譜鑒別分析評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)11個(gè)不同地域的化州柚樣品的色譜圖進(jìn)行分析，除峰面積較小的未積分外，在所選定的范圍內(nèi)有9個(gè)共有峰；共有峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%以下；9個(gè)共有峰中，香豆素、呋喃香豆素、佛手內(nèi)酯和異歐前胡素的含量高且較穩(wěn)定。9個(gè)共有峰面積的總和占總峰面積的95%以上，11個(gè)點(diǎn)樣品的相似度均在0.965以上。以上結(jié)果說明，本研究所建立的化橘紅HPLC指紋圖譜符合中藥指紋圖共有模式的要求。

3.2 經(jīng)對(duì)多批次樣品的多次檢測(cè)，保留時(shí)間在8.125min和8.787min的兩個(gè)峰為一組剪刀峰，位于8.787min的是香豆素，位于8.125min的峰面積占50%左右，表現(xiàn)出含量高而且穩(wěn)定，據(jù)初步測(cè)定，可能是另一種香豆素類物質(zhì)，其確切的化學(xué)成分尚待確定。

3.3 本研究結(jié)果表明，化州柚和柚的香豆素類成分HPLC指紋圖譜有明顯差別，與陳志霞等[12]對(duì)化州柚和柚的黃酮類成分HPLC指紋圖譜有明顯差別的研究結(jié)果一致。另外研究發(fā)現(xiàn)化州柚發(fā)育過程中黃酮類成分不斷減少，不同采收期化州柚的黃酮類成分有較大變化，而香豆素類成分相對(duì)穩(wěn)定，因此在鑒別成品化橘紅的質(zhì)量、真假時(shí)采用不同的指紋圖譜可能更加科學(xué)。

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High Performance Liquid Chromatography Fingerprint of Tomentose Pummelo Peel

XIAO Wei-qiang1，ZHANG Chao-hong2，HUANG Bing-xiong1，DAI Hong-fen1，XIE Lu-si2，WANG Xiao-rong1,*
(1. Institute of Pomology, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China；2. Maoming Supervision Testing Institute of Quality and Metrology, Maoming 525011, China)

In order to establish the fingerprint of HPLC analysis for tomentose pummelo (Exocarpium citri Grandis) peel, reversed-phase HPLC using Nucleosil C18column (150 mm × 4.6 mm, 3μm) as the stationary phase, H2O-CH3OH-CH3CN as the mobile phase, triple gradient elution at the flow rate of 0.3－1 mL/min, DAD as the detector, column temperature at 35℃ and detection wavelength at 315 nm was used to determine the extract from tomentose pummelo peal. Results showed that 9 common peaks in HPLC chromatogram were observed in 11 samples. Through calculating by fingerprint analysis system of Chinese medicine, relative standard deviations (RSD) for relative retention time of common peaks were less than 0.3% and their similarity was more than 0.965. Therefore, a chromatographic fingerprint was established to provide scientific quality evaluation for tomentose pummelo peel.

HPLC；tomentose pummelo peel；coumarin；fingerprint

TS207.3

A

1002-6630(2010)22-0318-04

2009-11-18

廣東省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2006B20201045)

肖維強(qiáng)(1968—)，男，高級(jí)農(nóng)藝師，碩士，研究方向?yàn)楣芳庸ぜ八斜＝〕煞值姆治觥-mail：xwq6817@126.com

*通信作者：王曉容(1954—)，女，研究員，研究方向?yàn)閮x器分析。E-mail：wang999983@126.com