幽門螺桿菌細胞毒素相關基因致病島及Ⅳ型分泌系統(tǒng)的研究進展

廖順花，吳燕燕，王易

上海中醫(yī)藥大學免疫學與病原生物學教研室，上海 201203

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是定植于人胃黏膜的螺旋狀微需氧革蘭陰性菌，其感染與人類慢性胃炎、消化性潰瘍、胃腺癌和胃淋巴瘤的發(fā)病相關。幽門螺桿菌致病物質包括尿素酶、鞭毛、菌毛以及2種外毒素——空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)、細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin-associated protein A，CagA)，其中細胞毒素相關基因(cytotoxin-associated gene,cag)致病島及其編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system，T4SS)更引人關注。

1 幽門螺桿菌cag致病島

1.1 致病島

致病島是細菌染色體上具有典型結構特征的基因簇，主要編碼與細菌毒力相關的結構蛋白及代謝產物。其基本特征：20～100 kb的染色體基因簇；基因簇兩側一般具有重復序列和插入元件；基因簇通常位于細菌染色體的tRNA基因位點近側，或與噬菌體整合有關的位點；基因簇DNA G+C mol%、密碼使用與細菌染色體其他部分差異明顯；基因簇編碼產物多為分泌性蛋白及細胞表面蛋白，也可編碼細菌的分泌系統(tǒng)、信息轉導系統(tǒng)和調節(jié)系統(tǒng)。

根據G+C mol%的差異，致病島分成高G+C致病島和低G+C致病島。幽門螺桿菌致病島屬低G+C類型[1]。根據致病島DNA片段G+C mol%的明顯差異及兩側具有的插入元件，推測幽門螺桿菌致病島可能來自噬菌體或質粒，是基因轉移的產物。

1.2 cag致病島的結構特點

Censini等[2]在比較Ⅰ型(Vac陽性、CagA陽性)和Ⅱ型(Vac陰性、CagA陰性)幽門螺桿菌的遺傳學差異時發(fā)現，Ⅰ型菌株含有一個大約40 kb的特殊DNA片段，具有致病島的典型特征，定名為cag致病島。其編碼蛋白與已發(fā)現的其他細菌如根瘤農桿菌、百日咳桿菌、布魯桿菌、空腸彎曲菌、嗜肺軍團菌編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白高度同源，系毒素與毒素轉運相關蛋白共同組成的分泌系統(tǒng)，故cag致病島被認為是幽門螺桿菌重要的致病原。

cag致病島含有30多個基因，序列非常保守，認為是通過水平轉移方式來源于質粒或噬菌體。研究表明，只有具備完整cag致病島的幽門螺桿菌菌株才有致病性，且被認為是幽門螺桿菌毒力增強的可靠標志。核酸序列分析顯示，插入的序列IS605將cag致病島分割為cagⅠ區(qū)和cagⅡ區(qū)，完整的cag致病島結構應包含這2個區(qū)域。

以幽門螺桿菌26695菌株為例(已完成測序的標準菌株)，位于3′端cagW(5′-3′)之后，cagⅠ區(qū)共有16個基因，自3′端至5′端依次為cagA(5′-3′)、cagB(3′-5′)、cagC(3′-5′)、cagD(3′-5′)、cagE(3′-5′)、cagF(3′-5′)、cagG(3′-5′)、cagH(3′-5′)、cagI(3′-5′)、cagL(3′-5′)、cagN(5′-3′)、cagM(5′-3′)、cagO(3′-5′)、cagP(3′-5′)、cagQ(3′-5′)、cagR(5′-3′)。cagⅡ區(qū)共有14個基因，3′端為cagS(3′-5′)，其后依次為cagT/cag19(5′-3′)、cag18(5′-3′)、cag17(3′-5′)、cag16(3′-5′)、cag15(3′-5′)、cag14/13(3′-5′)、cag12(3′-5′)、cag11(3′-5′)、cag10(3′-5′)、cag9(5′-3′)、cag8(5′-3′)、cag7(5′-3′)、cag6(5′-3′)。其中cagⅠ區(qū)的cagF、cagE基因及cagⅡ區(qū)的cagT/cag19、cag15、cag12、cag11、cagS基因參與幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的編碼。未參與幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)編碼的基因產物，大多屬于功能未知蛋白。

1.3 cag致病島的病理學意義

研究發(fā)現，cag致病島中多數基因產物無直接致病作用，其間接致病作用與幽門螺桿菌的另一個重要毒力因子——VacA的產生、毒性作用形成及宿主細胞的炎癥因子系統(tǒng)激活有關。

VacA是幽門螺桿菌的另一個重要毒力因子，由vacA基因編碼，是一種分泌型蛋白毒素。VacA能改變細胞膜，形成跨膜離子通道，導致酸性水解酶釋放，引起細胞腫脹，伴隨包膜融合，最終使靶細胞發(fā)生空泡樣變性。該毒素與感染者胃腸上皮細胞損傷和潰瘍形成密切相關。流行病學研究顯示，cag致病島與VacA毒素的產生有關。有學者認為，cag致病島的獲得可促使vacA基因進化，其在幽門螺桿菌基因組中的整合是VacA活化的一個啟動因素，因為vacA基因雖然存在于Ⅰ型和Ⅱ型菌株，但在Ⅱ型菌株中不表達或僅表達具有免疫反應性而無毒性的分子。Pahl等[3]提出這樣一種假說，vac基因以一個前體分子存在，cag致病島的遺傳變化使其形成功能性基因，從而使感染的低毒菌株獲得更多毒力因子。Atherton等[4]研究發(fā)現，CagA的表達與VacA的基因型存在一定聯(lián)系，提示cag致病島與vacA存在某種功能上的聯(lián)系。cag致病島編碼的一種或幾種蛋白質是否促進VacA的運輸還有待進一步研究證實。但有文獻顯示，cag11編碼產物的同源物在嗜水氣單胞菌中作為Ⅱ型分泌系統(tǒng)的組成成分存在[5]。新近研究[6]發(fā)現，在作用機制上，CagA蛋白與VacA也存在相關性。CagA蛋白通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入胃上皮細胞，與胃上皮緊密連接的支架蛋白(scaffold protein)ZO-1及跨膜蛋白結合分子形成復合物，在細菌附著處形成緊密連接元件的異位接合，并導致頂端接合的絡合物組成和功能異常，使上皮細胞間的緊密連接打開，有利于VacA穿越上皮細胞屏障，進入胃黏膜下層，影響宿主免疫系統(tǒng)。

在幽門螺桿菌感染的炎癥反應中，除CagA誘導的炎癥因子表達外，cag致病島編碼的外膜蛋白大部分可激活核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)，以促進白細胞介素8(interleukin 8，IL-8)的表達。有研究發(fā)現，cag致病島中的cagE、cagG、cagH、cagI、cagL、cagM為誘導IL-8在胃上皮細胞合成所必需，cagE產物在體內胃黏膜炎癥反應中起重要作用。也有研究認為，cagE與cagA有協(xié)同作用，誘導胃黏膜上皮細胞產生IL-8的cagA陽性菌株其cagE也呈陽性。因此，有學者認為，作為cag致病島存在的標志，cagE可能優(yōu)于cagA。另有報道，幽門螺桿菌相關性胃炎患者IL-12水平明顯增高，而腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)、IL-1β、IL-6等與炎癥程度相關的細胞因子并沒有明顯變化。而IL-17 mRNA的翻譯和蛋白表達水平在幽門螺桿菌感染者中較非感染者明顯增高(IL-8在很大程度上受IL-17調節(jié))[7]。

2 cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)

2.1 細菌分泌系統(tǒng)

細菌分泌系統(tǒng)是由多種效應蛋白組成的并連接革蘭陰性細菌細胞內、外膜的一種跨膜轉運裝置，目前至少發(fā)現了5種類型(Ⅰ～Ⅴ型)。其中經周漿間隙分步轉運的類型屬兩步分泌途徑，有Ⅱ型和Ⅴ型分泌系統(tǒng)。而不經周漿間隙轉運的類型為一步分泌途徑，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型分泌系統(tǒng)。兩步分泌途徑的組成需要Sec蛋白家族參與，又稱Sec依賴型分泌系統(tǒng)。一步分泌途徑鮮見Sec蛋白家族參與，稱Sec非依賴型分泌系統(tǒng)；而cag致病島編碼的分泌系統(tǒng)則為Sec依賴型的Ⅳ型分泌系統(tǒng)。

2.2 幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的結構組成

Tanaka等[8]在電子顯微鏡下觀察到，cag致病島陽性的幽門螺桿菌菌株有一細絲呈折疊狀結構從細胞表面向外突出，而cag致病島陰性菌株無此結構，提示幽門螺桿菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)由cag致病島編碼。

根瘤菌vib系統(tǒng)是公認的Ⅳ型分泌系統(tǒng)的研究原型。vib系統(tǒng)由3部分組成，即由具有ATP酶活性的VirB4、VirB11和VirD4組成的內膜結構，由VirB6、VirB7、VirB8、VirB9、VirB10或VirB3組成的連接內、外膜核心的跨膜通道結構和由VirB2和VirB5組成的菌毛樣外膜結構[9]。

cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)至少由16種蛋白組成，系連接細菌內、外膜的菌毛樣大分子結構。與根瘤菌vib系統(tǒng)相似，也由3部分組成。 CagE、Cag6及Cag11(分別為VirB4、VirB11和VirD4的同源物)組成內膜結構；CagE具有ATPase活性并為轉運底物提供能量；Cag11作為一種銜接蛋白起耦聯(lián)作用，并為CagA轉運所必需；CagW、Cag8、Cag7、 CagT(分別是VirB6、VirB8、VirB10、VirB11的同源物)及CagM、CagI、CagG、CagF 8種成分組成核心跨膜通道，其中CagT-CagX由CagM介導，于外膜形成CagX-CagM-CagT復合物[10]。CagT作為N端Sec信號序列，是細菌脂蛋白的典型信號序列，具有穩(wěn)定自身和其他蛋白的作用。Tanaka等用免疫金電子顯微鏡檢測發(fā)現，細菌表面的絲狀結構與Ⅳ型分泌系統(tǒng)的主要成分cagT和cagX相關[8]。有研究者用激光共聚焦掃描電子顯微鏡和免疫場致發(fā)射掃描電子顯微鏡技術發(fā)現，幽門螺桿菌的cagT定位于細菌外膜上，分布在細菌表面纖毛樣結構的基底部，推測其可能是分泌素或是與分泌素相關的脂蛋白，允許Cag14/13和針樣纖毛結構通過，并起穩(wěn)固其他蛋白的作用[8]。Cag7是Ⅳ型分泌系統(tǒng)表面絲狀結構的主要成分，保護Ⅳ型分泌系統(tǒng)免遭胃黏膜中的胃酸侵襲。在慢性感染中，誘導抗原變異而使CagA逃避抗原抗體反應，誘導IL-8 產生而穩(wěn)定裝置表面其他成分。也有研究認為，Cag7可能是作為一種連接內、外膜的信號轉導蛋白。CagF在CagA轉運過程早期起類似分子伴侶樣的作用，是CagA轉運所必需的重要蛋白[11]。幽門螺桿菌的菌毛樣外膜結構尚不清楚，未鑒定出與根瘤菌VirB2和VirB5具有同源性的蛋白。但有研究表明，CagT、CagX、CagY與幽門螺桿菌胞外菌毛樣結構相關，這3種成分是根瘤菌核心裝置成分的同源物。也有研究發(fā)現，CagC與根瘤菌菌毛結構中的重要成分VirB2在序列及結構上有一定的相似，其突變株可引起IL-8減少，同時也喪失轉運CagA的功能[12]，但幽門螺桿菌的胞外結構也有可能與根瘤菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的菌毛結構完全不同。

此外，CagM、CagI、CagG、CagF對幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)也具有重要作用，尤其是對CagA的轉運，但都與經典的vib系統(tǒng)無同源性，也許可將它們視為Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌裝置的新成員[13]。

2.3 幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的作用機制

幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)對真核細胞信號的干擾作用主要是通過cag致病島編碼的疏水性毒素蛋白CagA來實現的。CagA相對分子質量為(120～145)×103，N端相對保守，C端變異較大。體外實驗研究顯示，CagA具有類似真核細胞信號轉導通路中接頭蛋白(adaptor protein)的作用，產生與真核細胞Gab家族接頭蛋白類似的生物學作用(與Gab無同源性)。雖然CagA是目前唯一確定的由幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉運至宿主細胞的毒素蛋白。但Franke等研究發(fā)現，除CagA外，Ⅳ型分泌系統(tǒng)可能還轉運其他蛋白，促使宿主細胞內C-Met磷酸化，繼而激活基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)和MMP-9信號轉導通路而促進細胞增殖[14]。

CagA由Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入真核細胞后，直接進入宿主細胞的信號轉導通路，經Src激酶酪氨酸磷酸化作用，易位的CagA與含SH2的蛋白質酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing phosphotyrosine phosphatase 2，SHP-2)形成絡合物，活化下游信號轉導分子，導致細胞骨架重排，使細胞形態(tài)呈蜂鳥樣改變[15]；同時促進細胞增殖，表現出生長因子樣效應[16]。CagA也可與Grb2結合，經Ras/MEK/ERK MAPK途徑，使細胞蜂鳥樣改變，并促進細胞增殖[17]。近期研究表明，雖然CagA陽性幽門螺桿菌誘導IL-8表達的能力遠遠大于CagA陰性菌株，但是剔除CagA并不影響NF-κB、MAPK的激活和IL-8的生成，提示CagA陽性幽門螺桿菌引發(fā)的IL-8生成尚有其他調控因素。但Selbach等研究[18]發(fā)現，所有接觸依賴Ⅳ型運載體復合物的virB樣基因敲除株及缺失整個cag致病島的突變株不能分泌IL-8，認為細菌刺激IL-8分泌的能力很大程度上與其易位CagA的能力有關。插入及缺失突變研究顯示，cag致病島及其所編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)通過介導CagA與真核細胞的連接可激活核轉錄因子如NF-κB表達，致細胞表面形狀改變及基墊結構形成，并激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)等轉錄因子，經ERK/MAPK級聯(lián)反應引起c-fos、c-jun原癌基因活化[19,20]。

3 結語

決定幽門螺桿菌致病性的cag致病島及其所編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)將成為一個重要的藥物靶標，如果Ⅳ型分泌系統(tǒng)能被封閉或表達受到抑制，就可使致病的幽門螺桿菌回歸為正常的消化道菌群，以收“改邪歸正”之功效。

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