發(fā)現(xiàn)新病原、建立新病原學(xué)的技術(shù)與理論體系

徐建國

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206

當(dāng)不明原因性傳染病突發(fā)疫情在某個國家或地區(qū)出現(xiàn)時，如能在第1時間發(fā)現(xiàn)和明確病原體，就可為控制疫情贏得時間。對新病原體的檢測、分離、鑒定，是一個國家傳染病應(yīng)急防控能力和水平的標(biāo)志性體現(xiàn)[1]。

我國對不明原因性傳染病突發(fā)疫情的應(yīng)急處理，主要由各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)(過去稱防疫站)承擔(dān)。 這些機(jī)構(gòu)曾經(jīng)出色完成了對霍亂、蘇皖大腸埃希菌O157∶H7、四川人感染豬鏈球菌暴發(fā)等多起突發(fā)重大疫情的處理，積累了應(yīng)對不明原因性傳染病突發(fā)疫情的經(jīng)驗，造就了一批有實際經(jīng)驗的人才，為經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會穩(wěn)定作出了貢獻(xiàn)[2,3]。但是，仍有一些規(guī)模小的不明原因性傳染病突發(fā)疫情未獲得病原學(xué)證據(jù)[4]。

近年來，不明原因性傳染病突發(fā)疫情在我國不斷出現(xiàn)，現(xiàn)實生活中也有生物襲擊或威脅的發(fā)生(如2009年新疆針扎事件)。為應(yīng)對不明原因性傳染病突發(fā)疫情，迫切需要建立發(fā)現(xiàn)新病原的技術(shù)體系及有關(guān)新病原學(xué)的理論，以指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)新病原的工作。最近幾年，國內(nèi)、外已發(fā)表了不少探討和發(fā)現(xiàn)新病原的論文，國外有的大學(xué)成立了發(fā)現(xiàn)新病原的實驗室，我國國家疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所于2009年也成立了新病原室，應(yīng)對這一挑戰(zhàn)。

如何定義新病原體是一個值得商榷的問題。從應(yīng)對不明原因性傳染病突發(fā)疫情和公共衛(wèi)生的角度來看，新病原體應(yīng)包括3類：①在某個國家或地區(qū)第1次出現(xiàn)的病原體；②已發(fā)生變異、毒力增強(qiáng)、引起疾病流行和患者死亡、使用現(xiàn)有技術(shù)和方法無法給予準(zhǔn)確診斷或鑒定的病原體；③在世界范圍內(nèi)第1次出現(xiàn)的病原體。近年來，大多數(shù)不明原因性傳染病疫情基本上都是由上述3類病原體引起的。

為及時、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)和鑒定這些新的病原體，應(yīng)從以下幾方面著手。

1 建立病原體檢測技術(shù)儲備，應(yīng)對我國第1次出現(xiàn)的病原體

美國等一些發(fā)達(dá)國家對病原體的研究范圍幾乎覆蓋了所有的病原體。即使目前在這些國家沒有病例報告的病原體，他們也投入大量資金，開展研究工作，包括致病機(jī)制、檢測、診斷、疫苗、藥物等。正是由于擁有這種雄厚的知識和技術(shù)儲備，他們才能夠在新發(fā)傳染病發(fā)生時，迅速明確診斷，及時采取措施，控制疫情發(fā)展。嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)就是一個典型的例子[5,6]。

相比之下，我國研究病原體的種類及范圍均很小。即使是對一些我國法定傳染病的病原體，目前也尚無穩(wěn)定的研究隊伍；對許多在世界學(xué)術(shù)界已引起非常關(guān)注的病原體，尚未開展研究工作；對一些曾在我國引起重大疫情、目前病例不多的病原體，研究隊伍正在縮小或消失[7]。

針對可能在我國第1次出現(xiàn)的病原體，最好的策略就是建立病原體檢測和診斷技術(shù)儲備。1999年我國處理蘇皖大腸埃希菌O157∶H7暴發(fā)的經(jīng)驗顯示，建立技術(shù)儲備是應(yīng)對在一個國家或地區(qū)第1次出現(xiàn)的病原體的有效手段[3]。如果沒有技術(shù)儲備，一旦發(fā)生疫情，要在很短時間內(nèi)對一個過去并不熟悉的病原體準(zhǔn)確作出相關(guān)病原學(xué)診斷，對病原學(xué)專家來說是一項非常嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[8]。

1999年4～8月，我國江蘇省和安徽省突然有194例患者從腹瀉等先驅(qū)癥狀發(fā)展為少尿、無尿而入院，其中174例因突發(fā)腎臟和(或)其他臟器衰竭而死亡。當(dāng)時曾一度懷疑由出血熱、鉤端螺旋體病、假藥中毒等引起。由于病因不明，疫情控制沒有方向，政府難以決策，謠言四起，以致當(dāng)?shù)厝罕姷纳踩蜕鐣€(wěn)定受到嚴(yán)重威脅。我們受衛(wèi)生部派遣，和地方疾病預(yù)防控制中心一起處理疫情。 由于本實驗室從1986年就開始研究大腸埃希菌O157∶H7，建立了針對溶血素和志賀毒素基因的DNA診斷探針、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、針對溶血素和O157脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的轉(zhuǎn)膜雜交等方法。我們使用這些已建立的技術(shù)和方法，與當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心的同仁一起，迅速從臨床標(biāo)本分離到病原體，在患者血清中檢測到特異性抗體，從患者家庭飼養(yǎng)的豬、牛、羊、雞等動物分離到病原菌，提出將疫情確定為大腸埃希菌O157∶H7感染的建議。衛(wèi)生部接受了這一診斷建議，迅速采取措施，有效控制了迄今為止世界范圍內(nèi)流行規(guī)模最大、死亡人數(shù)最多、持續(xù)時間最長、發(fā)病情況最復(fù)雜的一起大腸埃希菌O157∶H7暴發(fā)[3,9]。

從2004年開始，我國對傳染病的預(yù)防、控制工作有了穩(wěn)定的資金投入。我們根據(jù)國內(nèi)、外研究結(jié)果的流行病學(xué)資料，廣泛征集專家意見和建議，擴(kuò)大傳染病病原體的研究范圍，慎重布局，逐步實施；每年組織科研力量，對十余種新的、罕見的、我國尚未開展研究工作的病原菌進(jìn)行研究，著重提高檢測、鑒定、分析和診斷的能力；基本上建立了能對80種新病原性細(xì)菌作出診斷的技術(shù)陣列。這些預(yù)警的技術(shù)儲備，在隨后應(yīng)對豬鏈球菌、無形體等疫情的病原學(xué)診斷發(fā)揮了作用。如本研究所自2004年已啟動豬鏈球菌研究工作，當(dāng)2005年四川省發(fā)生世界上最大的人感染豬鏈球菌疫情并引起國內(nèi)、外廣泛關(guān)注時，由于本實驗室已建立了PCR等檢測方法，引進(jìn)了參考菌株和診斷血清，在接到尸體解剖標(biāo)本數(shù)小時后，就用PCR方法檢測到病原菌存在，3 d后獲得病原菌并完成鑒定。從理論上說，這是從臨床標(biāo)本培養(yǎng)、分離、純化、鑒定一個病原菌所需的最短時間。我們及時向衛(wèi)生部遞交了實驗室診斷報告。衛(wèi)生部很快公布了疫情診斷結(jié)果，指導(dǎo)了疫情的控制工作[10,11]。

我國發(fā)現(xiàn)人粒細(xì)胞無形體病(human granulocytic anaplasmosis，HGA)也證明了建立技術(shù)體系儲備的價值。 2006年11月，安徽省某醫(yī)院一疑似出血熱的患者死亡數(shù)天后，5名陪護(hù)親屬和4名參與搶救的醫(yī)護(hù)人員均被傳染。在排除出血熱病毒等30余種病原體后，安徽省疾病預(yù)防控制中心提出可能是埃立克體的建議，向我們提出技術(shù)支持的請求。由于我們在2006年初就開始建立埃立克體、無形體診斷技術(shù)的儲備，已經(jīng)合成了引物，引進(jìn)了血清學(xué)診斷試劑，所以很快完成了檢測工作。根據(jù)血清學(xué)和病原體基因分析數(shù)據(jù)，提出HGA的診斷意見。HGA的病原體是嗜吞噬細(xì)胞無形體，主要通過蜱傳播，此前沒有人-人傳播的報道。通過對病原學(xué)和血清學(xué)結(jié)果的雙盲驗證，以及對與首發(fā)患者接觸時間、接觸方式和接觸時間(以分鐘為單位)的調(diào)查、對比和分析，提出了安徽省HGA人-人傳播的結(jié)論，得到國內(nèi)、外同行認(rèn)可。論文在美國醫(yī)學(xué)會雜志(JAMA)上發(fā)表，耶魯大學(xué)Krause教授等應(yīng)邀撰寫的評論認(rèn)為，此研究的重要意義是 “在世界上第1次發(fā)現(xiàn)嗜吞噬細(xì)胞無形體可以人-人傳播，在中國第1次發(fā)現(xiàn)HGA病例”。由于該發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)生部頒布了《人粒細(xì)胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南》，要求HGA高發(fā)地區(qū)的醫(yī)務(wù)人員要強(qiáng)化護(hù)理和搶救過程中的保護(hù)措施，減少發(fā)病和死亡[12]。

2 建立中國病原菌分子分型網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)發(fā)生變異的病原體

在細(xì)菌的進(jìn)化過程中，點突變、基因重組、基因水平轉(zhuǎn)移和丟失等是主要的推動因素。過去認(rèn)為，點突變是病原性細(xì)菌發(fā)生的主要因素，因而新的病原性細(xì)菌的產(chǎn)生和進(jìn)化過程比較緩慢。通過研究細(xì)菌“獲取”與“缺失”基因的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，大片段基因的獲得和缺失可使細(xì)菌基因在短期內(nèi)發(fā)生量的飛躍。也就是說，可以在短時期內(nèi)產(chǎn)生許多新的突變株，包括新的病原性細(xì)菌。噬菌體、質(zhì)粒為細(xì)菌的可移動遺傳元件，它們的參與加速了細(xì)菌的進(jìn)化過程。如細(xì)菌可通過DNA轉(zhuǎn)換、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)、質(zhì)粒介導(dǎo)的結(jié)合作用等水平轉(zhuǎn)移方式，獲得外源基因成分，從而具有一些新的特征，如對抗生素的耐藥性、產(chǎn)生毒素的能力等。細(xì)菌還可通過缺失一部分基因，使自己能更適應(yīng)環(huán)境的變化。上述多種構(gòu)成細(xì)菌變異的機(jī)制，可使細(xì)菌的致病性增強(qiáng)，引起疾病流行[13]。

因此，我們建立了中國病原菌分子分型網(wǎng)絡(luò)(PulseNet China)，有助于發(fā)現(xiàn)發(fā)生變異的病原體[14]。PulseNet是由美國疾病預(yù)防控制中心建立的食源性細(xì)菌傳染病實驗室監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，1998年5月由當(dāng)時美國副總統(tǒng)戈爾在白宮宣布成立。該網(wǎng)絡(luò)利用標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌實驗室分子分型技術(shù)，通過分布于各地的網(wǎng)絡(luò)實驗室實際檢測和監(jiān)測，建立網(wǎng)絡(luò)平臺，及時交流和比對數(shù)據(jù)，從而可識別食源性傳染病發(fā)生的關(guān)聯(lián)，調(diào)查暴發(fā)流行，快速鑒定暴發(fā)的來源[15,16]。

PulseNet的精髓是數(shù)據(jù)的可比性和共享性。所有參與的實驗室都使用相同的實驗程序，保證獲得的結(jié)果可相互比較。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)美國乃至全球范圍的信息共享。這一網(wǎng)絡(luò)平臺能發(fā)現(xiàn)看似無關(guān)的傳染病事件之間的內(nèi)在聯(lián)系，早期發(fā)現(xiàn)暴發(fā)或暴發(fā)趨勢，有助于控制疫情[15,16]。

我們借助PulseNet的理念，把覆蓋范圍擴(kuò)大到所有病原性細(xì)菌，把分型技術(shù)從脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)擴(kuò)展到多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple-locus variable-number tandem repeat analysis， MLVA)、多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)等，期望能夠發(fā)展細(xì)菌基因組水平的分型技術(shù)。PulseNet China 是我國細(xì)菌性傳染病實驗室監(jiān)測的未來。我們希望在PulseNet China的平臺組建所有從事細(xì)菌實驗室監(jiān)測的同盟，使全國范圍內(nèi)的科技工作者，可用此平臺判斷不同分離株之間的關(guān)系。因為當(dāng)某個菌株引起疾病暴發(fā)，自暴發(fā)中分離的不同菌株應(yīng)該是相同或幾乎相同的(因可能存在偶然的變異)。對不同分離菌株的分子分型，在識別暴發(fā)，確定傳染來源、流行范圍、傳播鏈，發(fā)現(xiàn)特殊菌株等流行病學(xué)調(diào)查方面具有重要作用。通過分子生物學(xué)技術(shù)對病原體進(jìn)行分子分型，是調(diào)查暴發(fā)、流行的有效分析手段。使用PulseNet China 技術(shù)，我們曾發(fā)現(xiàn)了幾個發(fā)生變異并在我國引起重大疫情的病原菌。

2.1 腦膜炎奈瑟菌ST-4821complex(序列群)的發(fā)現(xiàn)和命名

在我國，流行性腦膜炎幾十年來一直以A群為優(yōu)勢血清群。2003～2005年，安徽省突然發(fā)生C群流行性腦膜炎暴發(fā)，并迅速傳到其他省份，一度疫苗告急。我們迅速組織起一支以研究生為主的隊伍投入工作。使用PulseNet China 建立的PFGE和MLST技術(shù)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢病原體發(fā)生了變異，并在進(jìn)化樹上形成一個新的亞群，將其命名為ST-4821序列群。該發(fā)現(xiàn)使我國預(yù)防和控制流行性腦膜炎的策略發(fā)生了重大改變，特別是對預(yù)防用抗生素的調(diào)整。研究結(jié)果于2006年在Lancet上發(fā)表[17]。

2.2 福氏志賀菌一個新血清型Fxv的發(fā)現(xiàn)

我國的細(xì)菌性痢疾主要由福氏志賀菌引起。幾十年來一直認(rèn)為，福氏志賀菌的15個血清型中，福氏2a志賀菌(Shigellaflexneri2a, F2a)的分離率最高，占80%左右，因此發(fā)展疫苗首先應(yīng)考慮福氏2a。2001年在河南省發(fā)現(xiàn)一種新的血清型，分離率超過F2a，連續(xù)5年成為第一優(yōu)勢血清型。使用單價診斷血清鑒定，結(jié)果為F4c。基因組分析發(fā)現(xiàn)，其沒有編碼F4的型抗原基因gtrIV，故不能鑒定為F4；但具有編碼Fx變種的抗原基因gtrX，將其命名為Fxv。使用MLST擴(kuò)展分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，我國95%左右的福氏志賀菌分離株，包括Fxv、F2a等優(yōu)勢血清型，屬于一個新的序列型，該序列型被命名為ST91。研究結(jié)果表明，在我國存在一個福氏志賀菌優(yōu)勢克隆群ST91，包括十余個血清型的菌株。福氏志賀菌ST91可通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式不斷變換血清型，規(guī)避人群建立的型特異性免疫保護(hù)。因此，志賀菌疫苗的發(fā)展策略必須重新設(shè)計。志賀菌痢疾是我國的常見病、多發(fā)病，在志賀菌的46 個血清型中，只有這個血清型是由我國科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)和命名的[18]。

2.3 豬鏈球菌序列7型的發(fā)現(xiàn)及在我國的流行

2005年四川省發(fā)生人感染豬鏈球菌的疫情，有 61例表現(xiàn)出不尋常的鏈球菌中毒性休克樣癥狀，38例死亡，呈現(xiàn)發(fā)病急、死亡快的現(xiàn)象。血清學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，病原體是血清2型豬鏈球菌。但由于許多血清2型豬鏈球菌的分離株是不致病的，因此使用MLST技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)病原體是序列7型豬鏈球菌，由序列1型變異而來，且毒力增強(qiáng)。迄今為止，序列7型豬鏈球菌只在我國發(fā)現(xiàn)，而致病性比較低的血清2型豬鏈球菌則屬于ST25型[11]。 據(jù)此，我們根據(jù)臨床表現(xiàn)、動物實驗、基因組分析等數(shù)據(jù)，將豬鏈球菌分為中等致病群、高致病群和流行群。中等致病群豬鏈球菌以ST25型等為主，雖能引起豬感染，但少有引起人感染的報道，沒有引起人感染死亡的報道，主要分布于北美；高致病群豬鏈球菌包括ST1型，主要分布于歐洲和亞洲，能引起豬感染，雖然有大量引起人感染和死亡的報道，但沒有引起大規(guī)模的人感染暴發(fā)，引起休克較少；流行群豬鏈球菌有ST7 型，能在人間引起暴發(fā)和在動物中流行，引起休克和死亡。我們繼而提出豬鏈球菌的“兩階段致病”理論：第1階段發(fā)生在高致病群或流行群豬鏈球菌進(jìn)入血液的數(shù)小時內(nèi)，主要特點是病原體刺激機(jī)體產(chǎn)生超量細(xì)胞因子, 如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)等，可導(dǎo)致宿主約在24 h發(fā)生休克和死亡；第2階段的主要特點是病原菌依靠毒力因子，通過血-腦屏障，引起腦膜炎?！皟呻A段致病”理論不僅對決定患者的預(yù)后發(fā)揮關(guān)鍵作用，還提示豬鏈球菌感染患者早期治療的重點是預(yù)防休克發(fā)生和抗休克治療，從而降低病死率[10]。

3 致力于發(fā)現(xiàn)世界范圍內(nèi)第1次出現(xiàn)的病原體

在世界范圍發(fā)現(xiàn)第1次出現(xiàn)的病原體是一種挑戰(zhàn)。測序技術(shù)的飛躍發(fā)展，給發(fā)現(xiàn)新的病原體提供了新的手段和思路。所有的細(xì)菌都有16S rRNA，根據(jù)16S rRNA的差異，可將細(xì)菌鑒定為科、屬、種。16S rRNA 序列分析比較是鑒定細(xì)菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但該技術(shù)有一定的限制，對數(shù)據(jù)的質(zhì)量要求很高，PCR合成過程可能會產(chǎn)生一些差異。但是，從臨床標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)可疑的病原菌，沒有其他方法能超越16S rRNA 序列分析的優(yōu)點。每種細(xì)菌都有16S rRNA，可通過PCR擴(kuò)增、克隆、測序的技術(shù)，獲得新的病原體信息。對那些正常情況下無菌的部位或體液標(biāo)本，優(yōu)勢更明顯[19]。對懷疑細(xì)菌感染的患者，如能從血液或腦脊液標(biāo)本中應(yīng)用16S rRNA技術(shù)檢測到細(xì)菌，則提示非常有可能是病原菌。但理論與實際還會有一定的差距。當(dāng)從認(rèn)為是無菌的血液標(biāo)本中檢測到醫(yī)院內(nèi)感染細(xì)菌，具體情況應(yīng)具體分析。16S rRNA 序列分析的功能是發(fā)現(xiàn)線索，但不能輕易下結(jié)論。對消化道、呼吸道等標(biāo)本來說，問題更復(fù)雜。因為這些部位有正常菌群，使用16S rRNA技術(shù)能檢測到多種細(xì)菌，要確定哪一種細(xì)菌是病原菌，需做更多的工作[20,21]。發(fā)現(xiàn)新的病毒，需要的技術(shù)更復(fù)雜。病毒的基因組序列差異很大，不能像細(xì)菌那樣使用共有的序列。

如果懷疑病原體是新的病毒或細(xì)菌，可使用宏基因組測序法，即對標(biāo)本包含的所有DNA或RNA序列無選擇地進(jìn)行分析；然后建立數(shù)據(jù)庫，刪除背景序列，查找與某種病原體有同源性的序列[22-24]；最后，根據(jù)結(jié)果設(shè)計序列、檢測標(biāo)本，繼而分離、培養(yǎng)、確定病原體。從理論上講，這個策略是可行的，也有成功的例子，但實際情況要復(fù)雜得多。需建立系統(tǒng)的技術(shù)和方法，需要微生物學(xué)、生物信息學(xué)、流行病學(xué)研究者和臨床醫(yī)師的共同努力。

4 我國傳染病預(yù)防控制實踐呼喚新病原學(xué)科的發(fā)展

目前我國疾病預(yù)防和控制系統(tǒng)除已開始啟動的網(wǎng)絡(luò)實驗室外，應(yīng)對新病原的挑戰(zhàn)基本上是扮演救火隊的角色，即 “被動滅火”的工作模式。在許多情況下，火被撲滅了，但對傳染源和傳染鏈的認(rèn)識不夠清晰，總結(jié)和推廣經(jīng)驗的機(jī)制不夠有力。撲滅疫情主要靠體制力量、群眾運動和有力的行政領(lǐng)導(dǎo)與支持，科技含量還有待凝練與提高。因此，在應(yīng)對突發(fā)傳染病或突發(fā)事件實際問題的同時，建議設(shè)置新病原學(xué)，開展對國內(nèi)、外新發(fā)現(xiàn)病原微生物的基礎(chǔ)理論研究，在更廣泛的領(lǐng)域內(nèi)加強(qiáng)新病原學(xué)的理論教學(xué)，提倡理論指導(dǎo)實踐以及學(xué)科間的交叉。通過醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、生物信息學(xué)、生態(tài)學(xué)、流行病學(xué)等學(xué)科的交融，重點完成發(fā)現(xiàn)新病原、判斷新病原與疾病流行的關(guān)聯(lián)度以及危害預(yù)警等核心任務(wù)[25]。

新病原學(xué)的主要內(nèi)容是發(fā)現(xiàn)新病原的策略、技術(shù)和手段，包括應(yīng)用大通量核酸、蛋白檢測和篩選技術(shù)，及時、準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)新病原體的線索。通過建立新病原學(xué)學(xué)科，進(jìn)一步彌合傳染病預(yù)防控制、臨床救治、基礎(chǔ)研究三大系統(tǒng)間的“縫隙”，形成新的工作思路和模式，以提高發(fā)現(xiàn)新病原、研究新病原、預(yù)防和控制新病原的能力[26-28]。

[1] 徐建國.新發(fā)傳染病的現(xiàn)狀與對策.中華流行病學(xué)雜志，2003,24(5): 340-341.

[2] Ye C, Bai X, Zhang J, Jing H, Zheng H, Du H, Cui Z, Zhang S, Jin D, Xu Y, Xiong Y, Zhao A, Luo X, Sun Q, Gottschalk M, Xu J. Spread of Streptococcus suis sequence type 7, China [J]. Emerg Infect Dis, 2008, 14(5): 787-791.

[3] Xu J, Cheng B, Feng L, Jing H, Yang J, Zhao G, Wang H, Li H. Serological investigations on patients with hemolytic uremic syndromes due to enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection [J]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 2002, 23(2): 114-118.

[4] Enserink M. Infectious diseases. Massive outbreak draws fresh attention to little-known virus [J]. Science, 2006, 311(5764): 1085.

[5] Enserink M. SARS in China. China’s missed chance [J]. Science, 2003, 301(5631): 294-296.

[6] Bloom BR. Lessons from SARS [J]. Science, 2003, 300(5620): 701.

[7] Holden MT, Hauser H, Sanders M, Ngo TH, Cherevach I, Cronin A, Goodhead I, Mungall K, Quail MA, Price C, Rabbinowitsch E, Sharp S, Croucher NJ, Chieu TB, Mai NT, Diep TS, Chinh NT, Kehoe M, Leigh JA, Ward PN, Dowson CG, Whatmore AM, Chanter N, Iversen P, Gottschalk M, Slater JD, Smith HE, Spratt BG, Xu J, Ye C, Bentley S, Barrell BG, Schultsz C, Maskell DJ, Parkhill J. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis [J]. PLoS One, 2009, 4(7): e6072.

[8] King DA, Peckham C, Waage JK, Brownlie J, Woolhouse ME. Epidemiology. Infectious diseases: preparing for the future [J]. Science, 2006, 313(5792): 1392-1393.

[9] Pang B, Jing H, Zheng H, Sun H, Zhao A, Xu J. Molecular typing of Shiga-toxin producing Escherichia coli O157:H7 isolated in China with pulsed field gel electrophresis [J]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 2002, 23(2): 123-126.

[10] Ye C, Zheng H, Zhang J, Jing H, Wang L, Xiong Y, Wang W, Zhou Z, Sun Q, Luo X, Du H, Gottschalk M, Xu J. Clinical, experimental, and genomic differences between intermediately pathogenic, highly pathogenic, and epidemic Streptococcus suis [J]. J Infect Dis, 2009, 199(1): 97-107.

[11] Ye C, Zhu X, Jing H, Du H, Segura M, Zheng H, Kan B, Wang L, Bai X, Zhou Y, Cui Z, Zhang S, Jin D, Sun N, Luo X, Zhang J, Gong Z, Wang X, Wang L, Sun H, Li Z, Sun Q, Liu H, Dong B, Ke C, Yuan H, Wang H, Tian K, Wang Y, Gottschalk M, Xu J. Streptococcus suis sequence type 7 outbreak, Sichuan, China [J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12(8): 1203-1208.

[12] Zhang L, Liu Y, Ni D, Li Q, Yu Y, Yu XJ, Wan K, Li D, Liang G, Jiang X, Jing H, Run J, Luan M, Fu X, Zhang J, Yang W, Wang Y, Dumler JS, Feng Z, Ren J, Xu J. Nosocomial transmission of human granulocytic anaplasmosis in China [J]. JAMA, 2008, 300(19):2263-2270.

[13] Xu JG, Cheng B, Wen X, Cui S, Ye C. High-pathogenicity island of Yersinia spp. in Escherichia coli strains isolated from diarrhea patients in China [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(12):4672-4675.

[14] 闞飆，徐建國.傳染病監(jiān)測的實驗室網(wǎng)絡(luò)化.疾病監(jiān)測，2005,20(1)： 1-2.

[15] Swaminathan B, Barrett TJ, Hunter SB, Tauxe RV; CDC PulseNet Task Force. PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance, United States [J]. Emerg Infect Dis, 2001, 7(3):382-389.

[16] Swaminathan B, Gerner-Smidt P, Ng LK, Lukinmaa S, Kam KM, Rolando S, Gutiérrez EP, Binsztein N. Building PulseNet International: an interconnected system of laboratory networks to facilitate timely public health recognition and response to foodborne disease outbreaks and emerging foodborne diseases [J]. Foodborne Pathog Dis, 2006, 3(1): 36-50.

[17] Shao Z, Li W, Ren J, Liang X, Xu L, Diao B, Li M, Lu M, Ren H, Cui Z, Zhu B, Dai Z, Zhang L, Chen X, Kan B, Xu J. Identification of a new Neisseria meningitidis serogroup C clone from Anhui province, China [J]. Lancet, 2006, 367(9508): 419-423.

[18] Ye C, Lan R, Xia S, Zhang J, Sun Q, Zhang S, Jing H, Wang L, Li Z, Zhou Z, Zhao A, Cui Z, Cao J, Jin D, Huang L, Wang Y, Luo X, Bai X, Wang Y, Wang P, Xu Q, Xu J. Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigella flexneri [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(2): 419-426.

[19] Xu J, Stanley T, Millar BC, McClurg RB, Shaw A, Crothers L, Goldsmith CE, Rooney RJ, Loughrey A, Murphy RG, Dooley JS, Moore JE. Difficult-to-identify bacteria: how use of 16S rDNA PCR and gene sequencing can help [J]. Br J Biomed Sci, 2008, 65(1): 33-36.

[20] Xu J, Millar BC, Moore JE, Murphy K, Webb H, Fox AJ, Cafferkey M, Crowe MJ. Employment of broad-range 16S rRNA PCR to detect aetiological agents of infection from clinical specimens in patients with acute meningitis—rapid separation of 16S rRNA PCR amplicons without the need for cloning [J]. J Appl Microbiol, 2003, 94(2):197-206.

[21] Xu J, Yang H, Wu J, Lai X, Liu B. A Carnobacterium-like organism isolated from a patient with multiple bacterial synergistic gangrene [J]. Wei Sheng Wu Xue Bao, 2000, 40(1): 21-25.

[22] Greub G, Kebbi-Beghdadi C, Bertelli C, Collyn F, Riederer BM, Yersin C, Croxatto A, Raoult D. High throughput sequencing and proteomics to identify immunogenic proteins of a new pathogen: the dirty genome approach [J]. PLoS One, 2009, 4(12): e8423.

[23] Sintchenko V, Anthony S, Phan XH, Lin F, Coiera EW. A PubMed-wide associational study of infectious diseases [J]. PLoS One, 2010, 5(3): e9535.

[24] Yongfeng H, Fan Y, Jie D, Jian Y, Ting Z, Lilian S, Jin Q. Direct pathogen detection from swab samples using a new high-throughput sequencing technology [J]. Clin Microbiol Infect, 2010. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2010.03246.x.

[25] Xu JG. Science-based management of infectious disease crisis [J]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 2006, 27(12): 1013-1016.

[26] Tang P, Chiu C. Metagenomics for the discovery of novel human viruses [J]. Future Microbiol, 2010, 5(2): 177-189.

[27] Wang D, Urisman A, Liu YT, Springer M, Ksiazek TG, Erdman DD, Mardis ER, Hickenbotham M, Magrini V, Eldred J, Latreille JP, Wilson RK, Ganem D, DeRisi JL. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays [J]. PLoS Biol, 2003, 1(2): e2.

[28] Xu Y, Stange-Thomann N, Weber G, Bo R, Dodge S, David RG, Foley K, Beheshti J, Harris NL, Birren B, Lander ES, Meyerson M. Pathogen discovery from human tissue by sequence-based computational subtraction [J]. Genomics, 2003, 81(3): 329-335.