產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌菌毛的研究進(jìn)展

張培晏，劉 峻(.四川省廣元市昭化區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川廣元6S0；.四川省廣元市昭化區(qū)青牛鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，四川廣元6S069）

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌菌毛的研究進(jìn)展

張培晏1，劉 峻2
(1.四川省廣元市昭化區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川廣元62S021；2.四川省廣元市昭化區(qū)青牛鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，四川廣元62S069）

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）常引起仔豬腹瀉，在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ETEC的致病作用與其具有粘附性菌毛和腸毒素密切相關(guān)，ETEC菌株的菌毛可與宿主黏膜上皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，并在局部組織定居、繁殖和產(chǎn)生毒素，損傷小腸黏膜，使小腸吸收分泌功能失常而致腹瀉。本文針對(duì)ETEC菌毛的生物學(xué)特性、表達(dá)條件、免疫原性等方面作一概述。

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌；菌毛；生物學(xué)特性；免疫原性

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是豬的一種重要腸道病原菌，它能夠引起仔豬黃痢、白痢和豬的水腫病。1967年，Koher、Smith等[1-2]指出，引起幼齡家畜腹瀉的大腸桿菌主要是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC），其發(fā)病率可達(dá)90%以上，病死率很高，有的可達(dá)100%。隨著研究的不斷深入，本病的發(fā)病機(jī)理、診斷和防治都有了很大的進(jìn)展，但仍然是影響?zhàn)B豬生產(chǎn)發(fā)展的一大難題。本文就ETEC菌毛的生物學(xué)特性、表達(dá)條件、免疫原性等方面進(jìn)行綜述。

1 菌毛的生物學(xué)特性

大腸桿菌的菌毛對(duì)一定種類紅細(xì)胞和相應(yīng)宿主的腸細(xì)胞具有粘附作用。當(dāng)其粘附于紅細(xì)胞時(shí)能使紅細(xì)胞發(fā)生凝集，且不被D-甘露糖抑制，這是一種甘露糖抵抗血凝反應(yīng)（MRHA）。除9S7P無血凝性外，其余的均具有各自凝集一定種類紅細(xì)胞的反應(yīng)譜，即血凝譜，可借此來初步鑒別所分離的大腸桿菌的菌毛種類。菌毛的MRHA可被相應(yīng)的抗體抑制，故又可用甘露糖抵抗血凝抑制反應(yīng)（MRHI）來對(duì)其作出確診。各種菌毛對(duì)腸上皮的粘附作用具有宿主特異性，并只能粘附于具有相應(yīng)受體的特定動(dòng)物的腸細(xì)胞上。如KSS只能粘附于仔豬的十二指腸段，K99和F41可粘附于初生豬、牛、羊的空腸，而9S7P只能粘附于仔豬回腸。通常一個(gè)動(dòng)物的ETEC菌株只表達(dá)一種菌毛，但已發(fā)現(xiàn)有些菌株可同時(shí)表達(dá)兩種或更多種菌毛，而且又發(fā)現(xiàn)了新的菌毛。

2 不同培養(yǎng)條件下的菌毛的表達(dá)

2.1 培養(yǎng)傳代和培養(yǎng)溫度對(duì)菌毛形成的影響 菌毛的體外表達(dá)受諸多因素的影響，其中培養(yǎng)傳代和培養(yǎng)溫度是一個(gè)重要的影響因素。在連續(xù)傳代3次后，菌毛表達(dá)最好，而隨著傳代次數(shù)的延長(zhǎng)，菌毛表達(dá)量有所降低。這可能是因?yàn)檫B續(xù)傳代導(dǎo)致相應(yīng)質(zhì)粒丟失，進(jìn)而導(dǎo)致菌毛表達(dá)的減少或消失。由于KSS、K99、9S7P的遺傳決定子位于質(zhì)粒上，在多次傳代過程中一些質(zhì)粒喪失，因而有可能不產(chǎn)生粘附因子。粘附因子F41的遺傳決定子位于染色體上，但也受其基因表達(dá)程度的影響。Briton等[3]認(rèn)為菌毛的表達(dá)具有相變性，這種相變是自發(fā)產(chǎn)生的，與培養(yǎng)條件密切相關(guān)。因而在培養(yǎng)溫度的選擇上，37℃是菌毛形成的最適溫度，低于1S℃則不能形成菌毛，2S℃以下能形成少量菌毛。

2.2 培養(yǎng)基對(duì)菌毛形成的影響 用常用的營(yíng)養(yǎng)肉湯、Minca培養(yǎng)液、EME培養(yǎng)液和LB培養(yǎng)液在37℃培養(yǎng)大腸桿菌，均可看到菌毛，但菌毛出現(xiàn)的時(shí)間各不相同。Minca培養(yǎng)液培養(yǎng)的大腸桿菌在24h后即可形成菌毛，培養(yǎng)72h后可形成致密菌毛；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)則需36h后才可看到菌毛，72 h后可形成大量致密的菌毛。另外，培養(yǎng)基中的某些成分也可抑制菌毛的表達(dá)，0.5%葡萄糖可抑制KSS菌毛的表達(dá)，丙氨酸能顯著抑制9S7P的形成。

3 菌毛的提取及純化

3.1 菌毛提取 目前常采用的提取大腸桿菌菌毛的方法[4]有：4℃萬能混合器混合法；60～65℃水浴振蕩法；4℃組織搗碎法；冰浴勻漿法；4℃高速攪拌法。賈靜等[5]發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌懸液加熱至60℃時(shí)，可使菌毛和菌體分離，有效地保證了所提取菌毛的數(shù)量和純度，而且相對(duì)于操作繁瑣的混合法、搗碎法以及冰浴勻漿法等，加熱法更為簡(jiǎn)便、易于操作。

3.2 菌毛純化 收獲菌體的主要目的是要得到較純的菌毛蛋白，可以通過高速離心分離菌體和發(fā)酵液，然后將離心所得菌體熱激攪拌，使菌毛從菌體上脫落下來。在得到純菌毛蛋白的過程中，需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鹽析和透析。用紫外吸收法在2S0nm處測(cè)定菌毛蛋白OD值，將粗提出來的菌毛蛋白鹽析，鹽析后作透析處理。菌毛蛋白的純度可用SDS-PAGE檢測(cè)。

4 菌毛的抗免疫原性機(jī)理及作用

菌毛抗原是一種蛋白質(zhì)，具有良好的抗原性，給機(jī)體免疫后能產(chǎn)生相應(yīng)的菌毛抗體，對(duì)菌毛粘附型致病性大腸桿菌具有免疫作用。用菌毛抗原免疫懷孕母豬，抗體可通過母豬初乳和常乳中的菌毛抗體阻止菌毛粘附腸黏膜，從而使仔豬獲得對(duì)大腸桿菌的被動(dòng)免疫。也可以直接用菌毛抗體給幼畜口服，在腸道內(nèi)中和菌毛抗原，使其失去粘附能力。菌毛的循環(huán)抗體在防止下痢上效果不大，只有經(jīng)口免疫才能建立對(duì)下痢的有效局部保護(hù)。作用機(jī)理：菌毛抗原進(jìn)入腸道后，先由淋巴上皮細(xì)胞（M細(xì)胞）捕獲，再把抗原信息傳遞給下層的巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞、T細(xì)胞，活化后的B細(xì)胞和T細(xì)胞循環(huán)全身，一部分回到腸黏膜表面定居，成為分泌型IgA的漿細(xì)胞和致敏淋巴細(xì)胞，建立起“黏膜局部免疫系統(tǒng)”，從而有效地對(duì)抗菌毛抗原在腸黏膜上皮細(xì)胞的粘附，阻止病原性大腸桿菌的異常繁殖。

最早被證明具有免疫作用的大腸桿菌菌毛是豬ETEC KSS抗原[6]，隨后的研究者相繼又證明了K99、9S7P、F41等動(dòng)物源[7-S]和CFA-I、CFA-II等人源宿主特異性大腸桿菌菌毛疫苗對(duì)一些大腸桿菌病具有良好的免疫保護(hù)作用[9]。許崇波等[10]對(duì)動(dòng)物初乳中的菌毛抗體進(jìn)行分析，結(jié)果表明IgM的調(diào)理素活性最高，而起抗粘附作用的主要是IgG。

5 菌毛抗體疫苗的臨床應(yīng)用

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就卵黃抗體的研究和開發(fā)做了很多工作，認(rèn)為雞卵黃抗體是一種大量、豐富、方便的特異性抗體的來源。卵黃抗體亦稱卵黃免疫球蛋白，是一種高效防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的生物制劑，利用蛋雞生產(chǎn)特異性卵黃抗體具有可規(guī)?；a(chǎn)、成本低、特異性抗體含量高及安全性好等優(yōu)點(diǎn)。Marquardt等[12]先后報(bào)道了菌毛卵黃抗體對(duì)初生和斷奶仔豬腹瀉的防治效果。Jin等[11]的體外試驗(yàn)表明，經(jīng)噴霧干燥的含抗KSS菌毛抗體的雞卵黃粉能阻礙ETEC KSS與豬小腸黏膜的粘附。肖馳等[13]還比較了菌毛蛋白疫苗卵黃抗體和細(xì)菌疫苗卵黃抗體對(duì)仔豬大腸桿菌性腹瀉的預(yù)防效果，結(jié)果表明兩種卵黃抗體都有效，但菌毛疫苗抗體的效果更好；試驗(yàn)還顯示卵黃抗體對(duì)仔豬黃痢的治愈率高于慶大霉素、土霉素和痢特靈。卵黃抗體經(jīng)仔豬口服后有抗ETEC感染的作用，它能與特異性粘附素抗原結(jié)合，減少或阻斷粘附素粘附到仔豬腸道乳膜上皮細(xì)胞的表面，使ETEC不能在小腸定居繁殖，阻礙腸毒素分泌，從而防止腹瀉[14]。用特異性卵黃抗體防治仔豬大腸桿菌性腹瀉，不會(huì)影響腸道正常菌群的生長(zhǎng)繁殖，不存在抗藥性和藥物殘留問題，同時(shí)避免了懷孕母豬因注射疫苗引起的應(yīng)激反應(yīng)或仔豬母源抗體水平不足而導(dǎo)致的免疫喪失等問題，是一種安全高效的生物防制劑。

6 小結(jié)和展望

關(guān)于ETEC菌毛蛋白的研究方法較多，且都有各自的優(yōu)勢(shì)，但也存在著一些不足。菌毛作為疫苗研制的理想候選蛋白質(zhì)，用來制成疫苗免疫母豬，可使所產(chǎn)仔豬獲得被動(dòng)免疫，不受大腸桿菌的侵襲。現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展為研制安全有效的ETEC多價(jià)疫苗提供了先進(jìn)的理論和技術(shù)支持，加速了現(xiàn)存ETEC疫苗的完善和新興ETEC載體、DNA、植物疫苗的發(fā)展。如新CFAs的發(fā)現(xiàn)提供了更多的抗原種類；ETEC基因組、蛋白質(zhì)組的深入研究則提供了更多的減毒基因和抗原表位的選擇；黏膜免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的揭秘也定能為ETEC疫苗的發(fā)展開辟新的道路。

[1] Koher E M.Studies on Escheriehia Co1i in Gnotobiotic Pigs [J].American Journa1 of Veterinary Research，19S0，41（5）：796-797.

[2] Smith H W.Studies in Escheriehia Co1i Enterotoxin[J].Patha1 Bacteria1，19S0，41（5）：796-797.

[3] Briton C C.The structure，fiction，synthesis and genetic contro1 of bacteria1 pi1i are a mo1e cu1ar mode1 for DNA and RNA transport in garm negative bacteria1 [J].Trans N Y A Cade Sci，1965，27：1003-1054.

[4]崔玉東.大腸桿菌和菌毛抗原的不同緩沖液熱處理提取方法比較的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，199S，20（5）：2S1-2S3.

[5]諸長(zhǎng)貴，方定一，董國(guó)雄，等.用兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)篩選和鑒定產(chǎn)生熱敏腸毒素的大腸菌株[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，19S1，2（3）：1-3.

[6]范朽才，郭景煜.大腸桿菌KSS抗原的提純及部分特性鑒定[J].中國(guó)畜禽傳染病，19S7（4）：53-56.

[7]樊英遠(yuǎn)，余鳴，肖俊發(fā)，等.母豬口服大腸桿菌自家菌苗的免疫效果試驗(yàn)[J].家畜傳染病，19S0（4）：1-7.

[S]張景六，蔡瑞珠，洪孟民.帶有KSS與K99兩種傘毛抗原基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建[J].生物工程學(xué)報(bào)，19S5 （2）：34-40.

[9]李豐生，陳添彌，黃翠芬.用遺傳工程技術(shù)構(gòu)建含E.coli KSSac和LT（A～-B～+）兩種抗原基因的菌株[J].生物工程學(xué)報(bào)，19S7，3（2）：102-107.

[10]許崇波，衛(wèi)廣森.表達(dá)大腸桿菌KSSac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的構(gòu)建[J].生物工程學(xué)報(bào)，2002，1S（2）：217-220.

[11] Jing L Z，Baidoo S K，Marquardt R R，et a1.Vitro in hibition of adhesion of enterotoxigenic escherichia co1i KSS to pig1et intestina1 mucus by egg-yo1k antibodies[J].FEMS Immuno1ogy and Medica1 Microbio1ogy，199S，21（4）：313-321.

[12] Marquardr R R，Jin L Z，et a1.Passive protective effect of egg-yo1k antibodies against enterotoxigenic eseheriehia co1i KSS infection in neonata1 and ear1yweaned pig1et [J].FEMS Immuno1ogy and Medica1 Microbio1ogy，1999，23（4）：S3-SS.

[13]肖馳，周淑蘭，涂志，等.雞抗豬大腸埃希氏菌卵黃抗體的研制與應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，199S，2S（4）：21.

[14]唱韶紅，汪建華，熊凌霜.MM3工程菌KSS抗原的純化[J].生物技術(shù)通訊，2000（1）：32-33.

Research Progress of Enterotoxigenic Escherichia Coli

ZHANG Peiyan1，LIU jun2
（1.Anima1 Disease Contro1 Center of Guangyuan Zhaohua District，Sichuan Guangyuan 62S021；2.Anima1 Husbandry and Veterinary Station of Qingniu Town in Guangyuan Zhaohua District，Sichuan Guangyuan 62S069，China）

Enterotoxigenic E.coli（ETEC）is a common factor that causing pig1ets diarrhea，ETEC strains sett1e in 1oca1 tissue，mu1tip1y and produce toxins by combining with corresponding receptors on epithe1ia1 ce11 surface，then causeng intestina1 mucosa damaging，the function of absorption and secretion unnorma1，and 1eads to diarrhea.This paper summarized the bio1ogica1 characteristics，expressing condition and immunogenicity of ETEC＇s pi1i.

Enterotoxigenic E.Coli；Pi1i；Bio1ogica1 characteristics；Immunogenicity

SS52.612

A

1001-S964（2016）01-0032-03

2015-0S-2S

張培晏（19S5—），男，四川劍閣縣人，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)工作。