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    牛源肺炎克雷伯菌菌毛類型鑒定及fimA、mrkA基因序列分析

    2022-06-09 07:33:16聶青青單文杰
    現(xiàn)代畜牧獸醫(yī) 2022年4期
    關(guān)鍵詞:菌毛克雷伯變異

    聶青青,張 璇,黃 攀,單文杰

    (1.贛州職業(yè)技術(shù)學院,江西贛州 341000;2.墊江縣市政服務(wù)中心,重慶 408300;3.巴南區(qū)人民政府蓮花街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,重慶 401321;4.共青城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村水利局,江西九江 332020)

    肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)屬腸桿菌科(Enterobaeteriaceae)、克雷伯菌屬(Klebsiella),為革蘭氏陰性短桿菌,是1種人畜共患病病原,也是引起多種動物患病的條件性致病菌,可引起肺炎、敗血癥、化膿性感染、支氣管炎、尿路感染及腦膜炎等[1-3]?,F(xiàn)有研究表明,菌毛是肺炎克雷伯菌的1種主要的毒力因子[4-5]。在感染過程中,細菌通過菌毛接近宿主黏膜表面或者吸附于宿主細胞,進而使機體致病[6]。肺炎克雷伯菌的菌毛可分為Ⅰ型和Ⅲ型菌毛[7]。Ⅰ型菌毛屬于甘露糖敏感性(mannose-sensitive hemagglutination,MSHA)菌毛,即甘露糖存在時會阻斷菌毛與紅細胞的凝集現(xiàn)象,主要附著于尿道上皮細胞;Ⅲ型菌毛具有甘露糖抵抗血凝特性(mannose-resistant hemagglutination,MRHA),又稱為甘露糖抵抗血凝特性菌毛,主要附著于呼吸道上皮細胞[8]。上述兩種菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位基因為fimA和mrkA[9]。Ⅰ型菌毛由一組fim(B、E、A、I、C、D、F、G、H)基因群所表達,fimA是負責表達Ⅰ型菌毛柄的結(jié)構(gòu)基因;Ⅲ型菌毛由一組mrk(E、A、B、C、D、F)基因群所表達,mrkA是負責表達Ⅲ型菌毛柄的結(jié)構(gòu)基因。

    本研究對近年在重慶、四川部分肉牛場分離到的20株肺炎克雷伯菌進行了MSHA/MRHA試驗,鑒定其菌毛類型,并對20株菌的fimA基因和mrkA基因進行了測序及氨基酸序列分析。研究旨在揭示川渝地區(qū)克雷伯菌菌毛類型與fimA基因和mrkA基因的變異特點,為深入研究其致病機制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    通過棉拭子的方法采集重慶、四川部分肉牛場的牛上呼吸道黏液,分離細菌;通過生化試驗、16S rRNA鑒定出20株肺炎克雷伯菌,分別編號為K.pn1~K.pn20,其中K.pn4、K.pn11、K.pn20分離自四川,其余分離自重慶。SPF豚鼠購自重慶市中藥研究院。

    1.2 試劑與培養(yǎng)基

    D-甘露糖(上海國藥集團化學試劑有限公司)、DNA回收試劑盒(廣州飛揚生化有限公司)、PCR試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司);小劑量DNA提取試劑盒、DL2000DNA Marker(生工生物工程(上海)有限公司);改良Minka液體培養(yǎng)基、2%豚鼠紅細胞懸液等。

    1.3 主要儀器

    AR1140/C電子分析天平(上海奧豪斯公司)、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械)、DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、S10000PCR儀(Thermal Cycler)、TGL-16高速冷凍離心機等。

    1.4 MSHA/MRHA試驗

    按照參考文獻[10]進行。將各菌株分別經(jīng)改良Minka液體培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)48 h,同樣培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代3次,即為菌毛化菌體。菌毛化菌體制成約50億CFU/mL細菌懸液,每株菌分為不加D-甘露糖和加D-甘露糖(終濃度為0.5%)的兩個樣本,加入等量2%豚鼠紅細胞懸液,設(shè)生理鹽水空白對照;振蕩后4℃保存2 h,觀察血球凝集反應(yīng)和D-甘露糖是否抑制凝集。將甘露糖抵抗血凝試驗陽性的菌株,4℃條件下完全凝集,37℃靜置30 min,檢查凝集現(xiàn)象是否被解脫。凝集解脫后,重新混勻4℃保存1.5 h,觀察是否再現(xiàn)凝集反應(yīng)。能夠凝集豚鼠紅細胞的菌株可判定MSHA反應(yīng)陽性;若37℃出現(xiàn)解脫,4℃又重現(xiàn)凝集反應(yīng),可判定為MRHA反應(yīng)陽性。

    1.5 fimA和mrkA基因的PCR擴增、測序

    20株菌毛化菌體經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)后,核酸提取試劑盒提取其DNA,PCR擴增fimA和mrkA基因序列,引物序列見表1。

    表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

    PCR反應(yīng)體系(25μL):上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、ddH2O 9.5μL、DNA模板2μL、2×mix DNA聚合酶預(yù)混液12.5μL。

    PCR反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃30 s,56.5℃30 s,72℃40 s,30個循環(huán);72℃10 min。

    Ⅰ型菌毛菌株的PCR反應(yīng)體系與Ⅲ型相同,但反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃35 s,30個PCR循環(huán);72℃10 min。

    反應(yīng)結(jié)束后取5.0μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結(jié)果。DNA回收試劑盒對目的片段進行回收與純化,由上海生物工程有限公司測序。

    1.6 序列分析

    測序結(jié)果利用MEGA軟件與GenBank中登錄的fimA和mrkA基因序列進行同源性比較,繪制系統(tǒng)進化樹。同時將基因翻譯成氨基酸序列,進行氨基酸序列分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1肺炎克雷伯菌MSHA/MRHA試驗結(jié)果(見圖1)

    由圖1可知,將20株菌毛化肺炎克雷伯菌進行MSHA/MRHA試驗后,結(jié)果顯示,有5株菌株不能抵抗D-甘露糖的抑制作用,其余均能夠抵抗D-甘露糖的抑制作用,且在37℃下均可被解脫,在4℃下重現(xiàn)完全凝集,符合MRHA陽性判定標準,陰性對照組無自凝現(xiàn)象。

    上述結(jié)果表明,該20株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)生Ⅰ型菌毛的有5株,為:K.pn16~K.pn20;產(chǎn)生Ⅲ型菌毛的有15株,為:K.pn1~K.pn15。

    2.2 肺炎克雷伯菌基因的PCR鑒定(見圖2、圖3)

    由圖2、圖3可知,20株供試菌株中,有5株菌針對Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位基因(fimA)序列的引物擴增出549 bp的目的片段;15株菌針對Ⅲ型菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位基因(mrkA)序列的引物擴增出609 bp的目的片段,與預(yù)期的大小相符,且PCR鑒定結(jié)果的肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株和Ⅲ型菌毛菌株與MSHA/MRHA試驗結(jié)果相符。

    2.3 序列同源性及系統(tǒng)進化樹分析(見圖4)

    研究中的5株fimA基因和15株mrkA基因與GenBank中登錄的fimA和mrkA基因序列進行同源性比較,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示,fimA基因核苷酸序列的同源性為82.6%~98.9%,推導氨基酸序列同源性為90.9%~97.7%,mrkA基因核苷酸序列的同源性為80.7%~99.7%,推導氨基酸序列同源性84.1%~100%。5個fimA基因與代表株NZ_CP009461.1的核苷酸序列同源性為83.1%~99.0%,推導氨基酸序列同源性為90.3%~97.7%;15個mrkA基因與代表株AOGO01000023.1的核苷酸序列同源性80.7%~99.7%,推導氨基酸序列同源性為84.1%~100.0%。

    由圖4可知,分離株菌毛類型有Ⅰ型和Ⅲ型,Ⅰ型菌毛共5株,Ⅲ型菌毛菌株居多(15株)。

    Ⅲ型菌毛菌株可分為4個分支,其中6個分離株(K.pn1~K.pn6)與AOGO01000023.1株同屬一個分支。

    2.4 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌氨基酸突變位點比對分析(見表2、表3)

    由表2可知,測序的5個fimA氨基酸序列(菌毛類型均為Ⅰ型)與代表株NZ_CP009461.1比較,可分為2個分支,K.pn20與K.pn19為同一支,均僅在95位氨基酸位點存在特異性變異。K.pn16、K.pn17和K.pn18存在12個氨基酸差異,K.pn16和K.pn17均在19、95、97、101、104、118、129、133、142、151、170位氨基酸位點存在特異性變異,K.pn18在19、74、95、97、118、129、151、170氨基酸位點存在特異性差異,并在74位出現(xiàn)特有的變異。

    表2 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌fimA氨基酸突變位點比對分析Tab.2 Comparative analysis of fimA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

    由表3可知,測序的15個mrkA氨基酸序列(菌毛類型均為Ⅲ型)與代表株AOGO01000023.1比較,存在多個位點存在差異,分離株兩分支間有32個氨基酸存在差異。其中K.pn3分離株在20位出現(xiàn)特有變異,K.pn12分離株在17位出現(xiàn)特有變異,K.pn10分離株在70、187位出現(xiàn)特有變異,K.pn11分離株在132、181、185位出現(xiàn)特有變異,K.pn15分離株在115、119、144、146、175位出現(xiàn)特有變異。

    表3 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突變位點比對分析Tab.3 Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

    續(xù)表3 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突變位點比對分析Tab.3(continue)Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

    3 討論

    本研究通過MSHA/MRHA試驗和PCR方法,鑒定出近年重慶、四川部分肉牛場的20株肺炎克雷伯菌的菌毛類型。其中有5株為Ⅰ型菌毛,占25%;15株為Ⅲ型菌毛,占75%。來自四川的3株菌株中的1株是Ⅰ型菌毛,2株是Ⅲ型菌毛。分離自重慶的17株,其中4株是Ⅰ型菌毛,占23.5%;13株屬于Ⅲ型菌毛,占76.5%。本研究結(jié)果表明,重慶、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)Ⅲ型菌毛,進行肺炎克雷伯菌感染的防控應(yīng)該更重視Ⅲ型菌毛。

    MSHA/MRHA試驗法確定菌毛類型較煩瑣、耗時。何禮洋等[11]、劉選梅等[12]報道,采用PCR方法可快速區(qū)分鑒別Ⅰ型、Ⅲ型菌毛肺炎克雷伯菌,與MSHA/MRHA試驗相比更加敏感、快速、方便。本研究結(jié)果表明,運用PCR對菌毛進行分型,試驗結(jié)果與MSHA/MRHA試驗一致:MSHA/MRHA試驗法鑒定出Ⅰ型菌毛的5株菌株均擴增出了約549 bp大小的特異片段,而MSHA/MRHA試驗法鑒定出Ⅲ型菌毛的15株菌株均擴增出了約609 bp大小的特異片段。PCR法鑒定菌株菌毛類型可避免MSHA/MRHA試驗的局限性,且更加快速、準確、方便。

    進化樹是描述生物體形成或進化順序的拓撲樹結(jié)構(gòu),一般由一系列節(jié)點和分支組成,節(jié)點間的連線代表物種之間的親緣關(guān)系[13]。為闡明fimA基因在各Ⅰ型菌毛菌株間及mrkA基因在各Ⅲ型菌毛菌株的進化關(guān)系,采用鄰接法作進化樹構(gòu)建。本試驗結(jié)果顯示,15株Ⅲ型菌毛的菌株可以分成4個分支,說明各區(qū)縣間的肺炎克雷伯菌菌毛類型進化關(guān)系存在差異。

    根據(jù)fimA和mrkA氨基酸序列比對結(jié)果顯示,本研究菌株的fimA和mrkA氨基酸序列存在多處變異;與參考菌株比較,fimA中12處位點存在變異,marA中32處氨基酸位點存在變異。四川株的fimA氨基酸序列相對于重慶株變異較少,如菌株K.pn20僅在95位氨基酸位點存在變異;重慶株除K.pn19與K.pn20相同,僅在95位氨基酸位點存在變異,其余分離株存在8~11個氨基酸存在差異。mrkA氨基酸序列的分離株有32個氨基酸存在差異,K.pn1~K.pn9氨基酸變異少,發(fā)生氨基酸變異位點0~3之間,其余6株菌氨基酸變異8~18個。

    氨基酸的變異不僅表示基因的多態(tài)性,還可能表示蛋白質(zhì)的功能、菌株的致病性等特征發(fā)生變化。肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95發(fā)生了氨基酸替代并由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?,K.pn16和K.pn17在aa19、aa118和aa142位點均由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?,K.pn18在aa19和aa118由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?。Ⅰ型菌毛黏附作用的關(guān)鍵在于疏水能力的大小[14],排斥水分子的能力增加時細菌菌毛的黏附能力更強,宿主機體更易致病。Ⅲ型菌毛的表達與細菌表面疏水性、致病性相關(guān)[15],當菌毛主要亞單位組成的疏水性氨基酸的比例增高時,Ⅲ型菌毛可提高肺炎克雷伯菌表面疏水性。

    本研究中Ⅲ型菌毛菌株K.pn11~K.pn15中aa86、aa167、aa182均發(fā)生了氨基酸替代,mrkA氨基酸187個位點中28.13%的氨基酸由親水性變?yōu)槭杷裕灰虼?,預(yù)測相應(yīng)菌株的黏附能力可能增強,毒力更強。

    4 結(jié)論

    MSHA/MRHA試驗法對本研究的20株肺炎克雷伯菌敏感性不高。通過PCR方法,鑒定出20株肺炎克雷伯菌中有5株為Ⅰ型菌毛,15株為Ⅲ型菌毛,重慶、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)Ⅲ型菌毛,且各區(qū)縣之間的肺炎克雷伯菌菌毛類型進化關(guān)系存在差異;分析fimA和mrkA氨基酸序列后發(fā)現(xiàn),fimA中12處位點存在變異,mrkA中32處氨基酸位點存在變異,肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95發(fā)生了氨基酸替代并由親水性氨基酸變?yōu)榱耸杷园被幔笮途闗.pn7、K.pn8和K.pn9在164位氨基酸上均發(fā)生了S164A。因此,預(yù)測相應(yīng)菌株的黏附能力可能增強,毒力更強。

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