腸炎沙門氏菌SEF14菌毛研究進(jìn)展

厚華艷，朱春紅，孟 霞，朱國(guó)強(qiáng)*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125）

腸炎沙門氏菌SEF14菌毛研究進(jìn)展

厚華艷1，朱春紅2，孟 霞1，朱國(guó)強(qiáng)1*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125）

1 SEF14菌毛的發(fā)現(xiàn)

Feutrier等1986年首次在臨床分離的一株人源腸炎沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)一種菌毛(后來被稱為SEF14菌毛），具有甘露糖敏感血凝反應(yīng)(MSHA），形態(tài)上與腸桿菌科細(xì)菌的Ⅰ型菌毛難以分辨，蛋白質(zhì)亞單位為14.4 kD，比傷寒沙門氏菌Ⅰ型菌毛亞單位(22.1 kD）小，N-末端18個(gè)氨基酸殘基與大腸桿菌和傷寒沙門氏菌Ⅰ型菌毛同源[1]。Müller等在同一株人源腸炎沙門氏菌分離株上鑒定了甘露糖敏感且形態(tài)和生化特性上不同于之前報(bào)道的SEF14的典型Ⅰ型菌毛[2]。1990年Tahorns等通過單克隆抗體(MAb）介導(dǎo)方法在腸炎沙門氏菌表面鑒定出這一菌毛樣結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)亞單位為14.3 kD，直徑小于5 nm，沒有凝集紅細(xì)胞能力[3]。目前已有的研究表明：SEF14蛋白亞基基因sefA主要分布于D血清型沙門氏菌中，但SEF14抗原只表達(dá)于都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、莫斯科沙門氏菌和布利丹沙門氏菌菌體表面[4-5]。根據(jù)其凝集紅細(xì)胞能力和形態(tài)大小的差異，而且與已經(jīng)鑒定的其他菌毛蛋白沒有同源性，所以不能夠歸于現(xiàn)有的沙門氏菌菌毛中任何一類[6]。

2 SEF14菌毛的分子生物學(xué)

sef基因操縱子位于一個(gè)小致病毒力島，主要由sefA、sefB、sefC、sefD4個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白完成SEF14菌毛的合成和組裝(圖1），sefA編碼主要蛋白亞基，sefB和sefC分別編碼伴侶蛋白和推進(jìn)蛋白，sefD編碼菌毛的頂端粘附素，位于SEF14菌毛結(jié)構(gòu)頂端[7-8]。sefB編碼菌毛周質(zhì)伴侶蛋白，與大腸桿菌菌毛周質(zhì)伴侶蛋白同源，在周間隙中與菌毛蛋白亞基SEFA結(jié)合，避免其前體非活性聚集；SefC蛋白與大腸桿菌菌毛外膜蛋白同源，促使伴侶蛋白SefB與菌毛蛋白亞基或菌毛蛋白前體解離；sefR是緊連sefD的一個(gè)反向調(diào)節(jié)基因[9-11]。Clouthier和Edwards等認(rèn)為sefABCD操縱子基因作為一個(gè)整體同時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯，在sefA上游有兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，sefBC的轉(zhuǎn)錄也要從sefA的啟動(dòng)子區(qū)起始，在sefA極性(polar）突變株中sefB、sefC和sefD均不能轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7-9]。如圖2所示，在SEF14菌毛亞單位突變株△sefA中，亞單位SEFD能夠以菌毛類似物表達(dá)于菌體表面(圖2B），但在突變株△sefD中，亞單位SEFA則不能表達(dá)展呈于菌體表面(圖2D），依此推測(cè)次要亞單位SEFD是通過主要亞單位SEFA結(jié)合伴侶蛋白和推進(jìn)蛋白并成功通過細(xì)胞周間隙，表達(dá)于菌體表面，和亞單位SEFA組裝成成熟SEF14菌毛。但sefA基因的極性突變株無任何亞單位表達(dá)于菌體表面(圖2C）。SEF14菌毛是一個(gè)典型的經(jīng)伴侶蛋白－推進(jìn)蛋白途徑分泌的蛋白。通常情況下，伴侶蛋白、推進(jìn)蛋白兩個(gè)輔助蛋白參與其中作用，菌毛蛋白結(jié)構(gòu)亞單位在細(xì)胞周質(zhì)中與伴侶蛋白結(jié)合以避免非活性形式的聚集或者被相關(guān)蛋白酶降解；然后在推進(jìn)蛋白的作用下穿過外膜蛋白，表達(dá)于細(xì)菌表面并完成組裝[12]。

朱春紅等利用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)了18株雞白痢沙門氏菌、11株腸炎沙門氏菌以及1株都柏林沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株中sefA、sefD和sefR基因序列，結(jié)果表明以11株腸炎沙門氏菌及1株都柏林沙門氏菌染色體DNA為模板能夠擴(kuò)增sefA、sefD以及sefR基因，以18株雞白痢沙門氏菌染色體DNA為模板能夠擴(kuò)增sefA基因，但只有分離于1980年之前的7株分離菌能夠成功擴(kuò)增sefD和sefR基因，而另11株1980年后分離菌PCR擴(kuò)增sefD和sefR基因均為陰性。據(jù)此認(rèn)為SEF14菌毛操縱子亞單位基因sefA、sefD以及調(diào)節(jié)基因sefR在不同沙門氏菌中的變異情況可能是SEF14菌毛局限性表達(dá)的原因之一[13]。

圖1 腸炎沙門氏菌sef14基因結(jié)構(gòu)圖(Edwards，2000）Fig.1 Thesef14gene cluster ofS.enteritidis

圖2 腸炎沙門氏菌SEF14菌毛可能的分泌表達(dá)機(jī)制(Edwards,2000）Fig.2 Predicted export of SEF14 fimbriae subunits from periplasm in different mutants

3 SEF14菌毛的表達(dá)

sef基因操縱子的表達(dá)受細(xì)菌生長(zhǎng)周期、環(huán)境因素、調(diào)控因子等多方面因素的調(diào)控。Walker等利用特異性檢測(cè)SEF14菌毛的ELISA試驗(yàn)，研究4株不同的腸炎沙門氏菌在肉湯培養(yǎng)和平板培養(yǎng)條件下，SEF14菌毛表達(dá)的合適溫度和pH條件，至少3個(gè)環(huán)境因素影響SEF14菌毛表達(dá)：溫度、pH、細(xì)菌之間的關(guān)聯(lián)性，在pH呈酸性，溫度為37℃時(shí)，更利于SEF14菌毛表達(dá)[14]。sef基因操縱子表達(dá)還受調(diào)控因子RpoS的調(diào)控，但RpoS對(duì)sef操縱子的調(diào)控是直接的還是間接的目前還不確定[6]。本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336 SEF14菌毛表達(dá)最佳條件為：接種標(biāo)準(zhǔn)株50336單菌落于TSB培養(yǎng)基中，25℃搖床培養(yǎng)24 h，次日按1∶100轉(zhuǎn)接到新的TSB培養(yǎng)基中，20℃搖床培養(yǎng) 24 h，第 3 d按 1∶50轉(zhuǎn)接到 CFA(pH6.0）培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)50 h～60 h。此外還發(fā)現(xiàn)經(jīng)萘啶酮酸誘導(dǎo)的缺失株△sefA與野生株相比，在20℃時(shí)生長(zhǎng)極緩慢(未發(fā)表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)）。

4 SEF14菌毛致病性

菌毛在細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間相互作用中發(fā)揮重要毒力作用[15]。特定菌毛在腸道細(xì)菌中的分布可能與其致病性有密切關(guān)系，如廣泛分布于革蘭氏陰性菌中的Ⅰ型菌毛，介導(dǎo)病原菌與宿主如咽喉部，腸道上皮或者膀胱上皮組織之間的黏附；但細(xì)菌中同時(shí)也存在著這樣一類菌毛結(jié)構(gòu)，他們限制性分布于某些特定的細(xì)菌，比如只在沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒編碼的菌毛結(jié)構(gòu)(PEF），則介導(dǎo)沙門氏菌特異性黏附于宿主腸道的M細(xì)胞。SEF14菌毛有限分布于腸炎沙門氏菌和相近的D群沙門氏菌中[7]。

Edward等通過構(gòu)建sefA和sefD突變株研究SEF14菌毛功能，sef操縱子極性突變株對(duì)小鼠毒力下降為1∶1 000倍，而sefA非極性突變株的毒力無明顯變化，但sefD突變株毒力顯著降低。表明SEF14菌毛次要亞單位黏附素sefD對(duì)于SEF14菌毛的毒力是必要的[7]。最新研究顯示，野生株中sefD基因在42℃時(shí)轉(zhuǎn)錄被抑制，而缺失sefD基因的回補(bǔ)株中sefD基因的轉(zhuǎn)錄量為野生株的103倍，但回補(bǔ)株的生長(zhǎng)卻受到了抑制，野生株和缺失株感染雞的血鈣和產(chǎn)蛋量下降，但感染回補(bǔ)株的雞這種現(xiàn)象。表明sefD基因突變株或者在雞的高體溫下抑制sefD基因表達(dá)的野生株均通過產(chǎn)生不同代謝物來促進(jìn)腸炎沙門氏菌的毒力[16]。

Thorns等曾報(bào)道SEF14菌毛突變株與相應(yīng)野生株相比更快被人中性粒細(xì)胞吞噬[17]。Edward等的研究顯示，sefD突變株與野生株相比在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的存活率下降，他認(rèn)為SEF14菌毛能夠使腸炎沙門氏菌在巨噬細(xì)胞中有效存活[7]。本實(shí)驗(yàn)室利用Red同源重組構(gòu)建了SEF14菌毛突變株，并用野生株、突變株對(duì)腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2和人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2進(jìn)行了粘附實(shí)驗(yàn)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用和野生株以及相應(yīng)突變株在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活作用。初步結(jié)果表明野生株及相應(yīng)突變株對(duì)上皮細(xì)胞及腸道細(xì)胞的粘附數(shù)量差異不顯著，SEF14菌毛并不特異性介導(dǎo)腸炎沙門氏菌與腸上皮細(xì)胞的粘附作用，或者不是粘附的主要作用因子，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)和存活試驗(yàn)結(jié)果表明：活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)突變株吞噬作用增強(qiáng)，借助SEF14菌毛的作用，腸炎沙門氏菌能更好的作用于巨噬細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞中存活，利于其隱性感染和長(zhǎng)期排毒(數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

關(guān)于其在易感動(dòng)物體內(nèi)的致病力情況，Thorns報(bào)道SEF14菌毛突變株和野生株相比在腸道的定殖、對(duì)一日齡雛雞、產(chǎn)蛋雞及BALb/c小鼠的侵襲和系統(tǒng)性的傳播差異不顯著[17]。Rajasekara等證明，與野生株相比，SEF14菌毛突變株在其感染雞的肝、脾中幾乎分離不到感染菌[18]。Dibb-Fuller、Thorns和Ogunniyi等認(rèn)為SEF14菌毛對(duì)侵襲作用沒有影響[19-20]。有趣的是，Thiagarajan發(fā)現(xiàn)SEF14菌毛在雞中與經(jīng)卵巢傳播有關(guān)[21]。也有人認(rèn)為SEF14菌毛單個(gè)毒力因子在腸炎沙門氏菌致病性中并未發(fā)揮主要毒力作用，可能與其他毒力因子協(xié)同發(fā)揮作用，或者是感染的宿主不同，發(fā)揮作用也不同[16]。目前為止，關(guān)于SEF14菌毛的功能存在很大爭(zhēng)議。

5 SEF14菌毛的潛在應(yīng)用前景

研究表明腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白、孔蛋白、外膜蛋白、SEF14和SEF21菌毛蛋白均具有免疫原性，可以作為抗原免疫動(dòng)物并提供有效的免疫保護(hù)作用[22]。以SEF14和SEF21菌毛作為抗原，脂質(zhì)體為免疫佐劑，點(diǎn)眼法免疫家禽，能夠產(chǎn)生系統(tǒng)性和粘膜免疫反應(yīng)，在免疫家禽的腸道和血清中能夠檢測(cè)到抗體IgA和IgG，同時(shí)降低了腸炎沙門氏菌在腸道中的定殖和糞便中的排菌[23]。Lopes等重組表達(dá)腸炎沙門氏菌SEF14菌毛亞單位蛋白SEFA，并將其導(dǎo)入無致病性、無毒的大腸桿菌中，免疫1日齡雞，產(chǎn)生抗SEFA蛋白的特異性免疫反應(yīng)，可以在免疫家禽的腸道和膽汁中檢測(cè)到抗SEFA的抗體IgA[24]?？辜?xì)菌感染的免疫保護(hù)作用通常是由多種抗原協(xié)同參與完成，單一抗原或抗原亞單位不能對(duì)宿主提供足夠的保護(hù)。Aslanzadeh等的研究表明腸炎沙門氏菌SEF21、SEF17和SEF14菌毛的聯(lián)合免疫可產(chǎn)生更好的免疫效果[25]。

目前，由腸炎沙門氏菌引起的食物中毒事件繁多，特別是西方發(fā)達(dá)國(guó)家，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，大多是因?yàn)槭秤昧四c炎沙門氏菌污染的肉蛋產(chǎn)品，因此快速、準(zhǔn)確、特異性診斷腸炎沙門氏菌的方法尤為重要。鑒于SEF14菌毛免疫原性，將其制成顆?？乖?，用于檢測(cè)抗腸炎沙門氏菌SEF14菌毛特異性抗體，在第二次乳膠凝集試驗(yàn)中根據(jù)鞭毛抗原上的特異位點(diǎn)可以將其與都柏林沙門氏菌區(qū)別開來[5,26]。該方法比較理想，但價(jià)格昂貴。此外，SEF14菌毛主要亞單位基因sefA主要分布于D群沙門氏菌中，根據(jù)sefA基因設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)方法一定程度上可特異性檢測(cè)D群沙門氏菌的感染[27]。Thorns等建立了SEF14-DAS ELISA能夠?qū)⒛c炎沙門氏菌感染與其他沙門氏菌如雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等的感染區(qū)分開[28]。

本實(shí)驗(yàn)室利用SEF14菌毛的限制性表達(dá)特性建立了腸炎沙門氏菌的特異性診斷方法：朱春紅建立和優(yōu)化了重組亞單位蛋白rSEFA介導(dǎo)的間接ELISA方法特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌血清抗體。該間接ELISA具有較好的特異性，能特異性識(shí)別腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌感染血清，不能識(shí)別相近的雞白痢沙門氏菌感染血清[29]。段曉麗利用制備的抗SEF14菌毛MAb建立了雙抗體夾心間接ELISA方法。該方法以MAb作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，以抗SEF14菌毛的雞血清為檢測(cè)抗體，該雙抗體夾心間接ELISA方法特異性更強(qiáng)，靈敏性更高，對(duì)腸炎沙門氏菌特異性抗體檢測(cè)有潛在的應(yīng)用前景[30]。

6 展 望

鑒于腸炎沙門氏菌SEF14菌毛的免疫原性和亞單位蛋白基因sefA的特異性分布，在建立新型診斷技術(shù)方面和未來研制基因工程疫苗方面具有廣闊應(yīng)用前景。目前為止，關(guān)于SEF14菌毛的致病機(jī)理和免疫機(jī)理存在很大爭(zhēng)議，但隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，SEF14菌毛的結(jié)構(gòu)和功能研究也在不斷深入，相信在腸炎沙門氏菌感染特異性檢測(cè)與預(yù)防控制方面定會(huì)發(fā)揮重要作用。

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S852.61

B

1008-0589(2013）10-0855-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2013.10.20

*Correspondingauthor

2012-02-16

國(guó)家自然科學(xué)基金(31101833、31101826、31270171）；江蘇省自然科學(xué)基金(SBK201122944）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAK17B10）；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(IRT0978）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；揚(yáng)州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(YZ2011066）

厚華艷(1987-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要從事病原微生物致病機(jī)理及免疫機(jī)理研究.

*通信作者：E-mail：yzgqzhu@hotmail.com；yzgqzhu@yzu.edu.cn

(本文編輯：趙曉巖）