桃果肉總酚提取和測(cè)定方法的研究

嚴(yán) 娟， 蔡志翔， 張斌斌， 錢 巍， 俞明亮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇 南京 210014)

酚類化合物因具有強(qiáng)大的抗氧化活性和清除自由基的能力而備受矚目［1-4］。水果中富含多酚類物質(zhì)，已成為研究和開發(fā)功能性水果及飲品的焦點(diǎn)［5］。桃［Prunus persica(L.)Batsch］原產(chǎn)中國(guó)，世界廣泛分布和栽培，在國(guó)際國(guó)內(nèi)果品市場(chǎng)供應(yīng)和調(diào)節(jié)中占有重要地位。進(jìn)行功能性桃品種的開發(fā)和挖掘，可適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)對(duì)健康果品的需求，從而推動(dòng)桃產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

國(guó)內(nèi)外對(duì)桃酚類物質(zhì)的研究主要集中在對(duì)其抗氧化功能等方面［6-13］。隨著對(duì)紅肉桃資源研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其含有大量的多酚類物質(zhì)，抗氧化能力明顯高于白肉、黃肉桃品種［14-15］。因此，開展對(duì)酚類物質(zhì)的研究可成為開發(fā)功能性桃品種的一個(gè)切入點(diǎn)。

本試驗(yàn)對(duì)桃果肉總酚的超聲波輔助提取和福林-酚比色測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化，試圖建立簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的桃總酚提取和測(cè)定體系，為開發(fā)功能性桃品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用成熟桃果實(shí)均采摘于國(guó)家果樹種質(zhì)南京桃資源圃。每種桃均采10個(gè)果實(shí)，快速削皮分裝于保鮮袋中，液氮速凍后放置于－70℃保存?zhèn)溆茫?次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 桃果肉總酚含量的福林-酚比色測(cè)定方法的優(yōu)化

1.2.1.1 樣品制備及溶液配制 稱取北京一線紅(紅肉桃)、香金蟠(黃肉桃)和紅清水(白肉桃)3個(gè)桃品種果肉各勻漿2.50 g，加入60.00%的乙醇20.0 ml，40℃避光超聲波提取30 min，4℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液定容至25.0 ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。稱取0.11 g一水合沒(méi)食子酸，用蒸餾水溶解定容至 1 000.0 ml，得到濃度為 100 μg/ml的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.2 最佳測(cè)量波長(zhǎng)的選擇 準(zhǔn)確移取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和北京一線紅樣品各0.50 ml，香金蟠和紅清水樣品各1.00 ml，加5.00 ml蒸餾水，再加入0.50 ml 0.5 mol/L福林-酚，混勻靜置30 s后加入3.00 ml 0.5 mol/L Na2CO3，定容至 25.00 ml，室溫下避光反應(yīng)1 h，進(jìn)行500～900 nm波長(zhǎng)范圍的掃描［UV6300(PC)雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)］。

1.2.1.3 最佳比色體系試劑用量的確定 Na2CO3用量的確定:準(zhǔn)確移取7份0.50 ml沒(méi)食子酸，加5.00 ml蒸餾水，再加入0.50 ml的福林-酚，混勻靜置 30 s后分別加入 0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml、1.50 ml、2.00 ml、2.50 ml、3.00 ml的 0.5 mol/L Na2CO3，混勻后定容到25.00 ml，室溫下避光反應(yīng)1 h后，在方法1.2.1.2中確定的最佳波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，以確定最大吸光度所對(duì)應(yīng)的Na2CO3與福林-酚的體積比。3次重復(fù)。

福林-酚用量的確定:準(zhǔn)確移取6份0.50 ml沒(méi)食子酸，加5.00 ml蒸餾水，再分別加入0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml、1.50 ml、2.00 ml、2.50 ml福林-酚，混勻靜置 30 s，再依次加入 1.00 ml、2.00 ml、4.00 ml、6.00 ml、8.00 ml、10.00 ml的 0.5 mol/L Na2CO3，混勻后定容到25.00 ml，室溫下避光反應(yīng)1 h后，在方法1.2.1.2中確定的最佳波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，以確定最大吸光度所對(duì)應(yīng)的福林-酚與沒(méi)食子酸的體積比。3次重復(fù)。

1.2.1.4 測(cè)定溫度的確定 準(zhǔn)確移取5份0.50 ml沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加5.00 ml蒸餾水，再分別加入1.50 ml的福林-酚，混勻靜置30 s，再加入6.00 ml 0.5 mol/L Na2CO3，混勻定容到25.00 ml，分別在5℃、25℃、40℃、60℃、75℃下避光反應(yīng)1 h后，在方法1.2.1.2中確定的最佳波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，以確定適宜的反應(yīng)溫度。3次重復(fù)。

1.2.1.5 測(cè)定時(shí)間的確定 準(zhǔn)確移取8份0.50 ml沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加5.00 ml蒸餾水，再分別加入1.50 ml的福林-酚，混勻靜置30 s，再加入6.00 ml 0.5 mol/L Na2CO3，混勻定容到25.00 ml，在確定的適宜溫度下分別避光反應(yīng)10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min 后，在方法1.2.1.2中確定的最佳波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，以確定顯色完全的最佳時(shí)間。3次重復(fù)。

1.2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確移取0 ml、0.25 ml、0.50 ml、0.75 ml、1.00 ml、1.25 ml、1.50 ml的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25.00 ml試管中，沒(méi)食子酸濃度分別為 0 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ml、5 μg/ml、6 μg/ml，按上述確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，并測(cè)量吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(單位為μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.7 穩(wěn)定性和精密度的測(cè)定 準(zhǔn)確移取沒(méi)食子酸和北京一線紅果肉提取液0.50 ml，按最優(yōu)條件反應(yīng)，每隔10 min測(cè)量1次吸光度，計(jì)算穩(wěn)定性。準(zhǔn)確移取5份北京一線紅果肉提取液，按最優(yōu)條件反應(yīng)，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量，并計(jì)算精密度。3次重復(fù)。

1.2.1.8 加標(biāo)回收率的測(cè)定 準(zhǔn)確移取0.25 ml北京一線紅桃肉提取液6份，加5.00 ml蒸餾水，再分別加入 0 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.50 ml沒(méi)食子酸，按最優(yōu)條件反應(yīng)，測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚含量和加標(biāo)回收率。

1.2.2 桃果肉總酚的超聲波輔助提取方法的優(yōu)化

1.2.2.1 不同提取劑對(duì)桃總酚提取效果的檢測(cè)稱取2.00 g北京一線紅果肉 12份，分別加入20.00%、60.00%、100.00%濃度的乙醇、甲醇、乙酸乙酯和丙酮提取劑各20.00 ml，在40℃超聲［DS-5510DTH(頻率:40 KHZ;功率:300 W)］提取 30 min，10 000 r/min冷凍離心 10 min，上清液定容到25.00 ml，用優(yōu)化的福林-酚測(cè)定法測(cè)定吸光度。3次重復(fù)。

1.2.2.2 不同料液比對(duì)桃總酚提取效果的檢測(cè)稱取2.00 g北京一線紅果肉，加入由方法1.2.2.1中確定的提取劑，分別在料液比(樣品質(zhì)量/提取劑體積，g/ml)為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 和1∶12 條件下40℃超聲提取30 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，上清液定容到25.00 ml，用優(yōu)化的福林-酚測(cè)定法測(cè)定吸光度。3次重復(fù)。

1.2.2.3 提取溫度和時(shí)間的確定 在確定的提取劑和料液比的情況下，選擇超聲提取溫度分別為25℃、40℃、60℃，在各溫度條件下提取時(shí)間分別為10 min、30 min、60 min、90 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，上清液定容到25.00 ml，用優(yōu)化的福林-酚測(cè)定法測(cè)定吸光度。3次重復(fù)。

1.2.3 桃品種總酚的提取和測(cè)定 取不同果肉顏色桃品種果肉勻漿各2.00 g，按照上述優(yōu)化的提取和測(cè)定方法測(cè)定樣品總酚含量。

2 結(jié)果

2.1 桃果肉總酚含量的測(cè)定方法

2.1.1 最佳波長(zhǎng)的選擇 分別將3個(gè)桃樣品溶液和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在500 nm至900 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果(圖1)顯示，樣品最大吸收峰值均在765 nm處，可見(jiàn)765 nm為桃總酚含量測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)。

圖1 桃樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的掃描結(jié)果Fig.1 Obsorbance of peach samples and standard gallic acid solution

2.1.2 最佳比色體系試劑用量的配比 Na2CO3用量對(duì)多酚物質(zhì)的顯色效果(吸光度)見(jiàn)圖 2。Na2CO3用量不足會(huì)導(dǎo)致多酚物質(zhì)顯色不完全。吸光度值隨著Na2CO3與福林-酚用量比值增大而增大;當(dāng)比值大于4∶1時(shí)，吸光度值不再明顯增加。所以，0.5 mol/L Na2CO3與0.5 mol/L福林-酚的適宜用量配比為4∶1。

圖2 0.5 mol/L Na2CO3用量對(duì)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色的影響Fig.2 Effects of 0.5 mol/L Na2CO3on the reaction of standard gallic acid solution with Folin-Ciocalteu reagent

福林-酚用量對(duì)多酚物質(zhì)的顯色效果如圖3所示。當(dāng)0.5 mol/L福林-酚與0.50 ml沒(méi)食子酸用量比值在3∶1時(shí)，吸光度值最大，反應(yīng)最完全;0.5 mol/L福林酚與0.50 ml沒(méi)食子酸比值過(guò)高或者過(guò)低均可對(duì)顯色產(chǎn)生抑制作用。

圖3 0.5 mol/L福林-酚試劑用量對(duì)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色的影響Fig.3 Effects of 0.5 mol/L Folin-Ciocalteu reagent amount on the reaction of standard gallic acid solution with Folin-Ciocalteu reagent

2.1.3 反應(yīng)溫度的確定 從圖4可以看出，溫度的高低影響反應(yīng)效果。當(dāng)溫度在25℃時(shí)反應(yīng)最充分，吸光度值最大;當(dāng)溫度高于25℃時(shí)，吸光度值隨著溫度的增加而降低。

圖4 溫度對(duì)樣品顯色的影響Fig.4 Effects of temperature on the reaction of gallic acid with Folin-Ciocalteu reagent

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間的確定 由圖5可知，在最佳反應(yīng)溫度(25℃)下，多酚物質(zhì)在60 min后可充分顯色，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度值基本保持穩(wěn)定。

圖5 顯色時(shí)間對(duì)樣品顯色效果的影響Fig.5 Effects of time on the reaction of gallic acid with Folin-Ciocalteu reagent

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將平行測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性回歸，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖6。曲線的線性關(guān)系為 Y=0.119 4x+0.004 3，R2=0.999 4，線性良好。

圖6 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 Standard curve of gallic acid

2.1.6 穩(wěn)定性和精密度的檢測(cè) 沒(méi)食子酸和北京一線紅果肉提取液在最佳測(cè)定條件下反應(yīng)，每隔10 min測(cè)定1次吸光度，吸光度值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖7。60 min后吸光度變化趨于平緩;超過(guò)100 min，曲線均有略微下傾的趨勢(shì)，且北京一線紅樣品下降較明顯，說(shuō)明酚類化合物長(zhǎng)時(shí)間存在于溶液中穩(wěn)定性降低。

圖7 桃樣品的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of peach samples

通過(guò)以沒(méi)食子酸繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算總酚含量，并進(jìn)行精密度檢驗(yàn)。

式中:M為桃樣品的總酚含量(μg/g);m為桃樣品的質(zhì)量(g);V1、V2分別為樣品提取時(shí)定容的體積和測(cè)定時(shí)定容的體積(ml)，l為樣品取樣量(ml)。

5份北京一線紅果肉樣品中總酚含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%，說(shuō)明該方法具有較高的精密度。

2.1.7 加標(biāo)回收率的測(cè)定 在相同濃度北京一線紅樣品中分別添加不同濃度沒(méi)食子酸進(jìn)行回收率檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，加標(biāo)回收率都在90.00%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.84%，表明此分析方法準(zhǔn)確可靠，可用于桃總多酚含量的測(cè)定。

2.2 桃果肉總酚的超聲波輔助提取方法

2.2.1 不同提取劑對(duì)桃總酚的提取 用不同濃度提取劑提取桃果肉總酚，結(jié)果(圖8)顯示，總酚的提取量隨著4種溶劑不同濃度的變化而變化。其中乙酸乙酯對(duì)桃多酚物質(zhì)的提取效果最差;濃度為60.00%的乙醇、甲醇和丙酮的提取效果最優(yōu)，且三者間無(wú)顯著差異。但考慮到丙酮和甲醇的毒性和價(jià)格均較乙醇高，因此，選用60.00%乙醇做桃果肉總酚的提取劑。

圖8 不同濃度提取劑對(duì)桃總酚的提取效果Fig.8 Effects of different concentrations of extractant on the extraction of total phenol in peach mesocarp

2.2.2 不同料液比對(duì)桃總酚的提取效果 從圖9可以看出，料液比［桃果肉質(zhì)量(g)∶60.00%乙醇體積(ml)］越高，吸光度值越大，即總酚提取越完全。料液比1∶8處理下桃總酚提取量比料液比1∶4處理增加51.69%;當(dāng)料液比大于1∶8后，提取量增加不明顯，從1∶8到1∶10，料液比1∶10處理下桃總酚提取量比1∶8處理增加2.36%，1∶12處理下桃總酚提取量比1∶10處理增加僅0.28%。表明料液比1∶10可達(dá)較充分的提取效果。

圖9 不同料液比對(duì)桃果肉總酚提取效果的影響Fig.9 Effects of different ratios of material to solvent on the extraction of total phenol in peach mesocarp

2.2.3 提取溫度和時(shí)間 如圖10所示，提取溫度和時(shí)間影響桃總酚的提取量。在60℃下提取30 min的桃果肉中總酚提取量最低，在40℃下提取60 min的總酚提取量最高。

圖10 不同時(shí)間和溫度對(duì)桃果肉總酚提取效果的影響Fig.10 Effects of time and temperature on the extraction of total phenol in peach mesocarp

2.3 桃果肉總酚的提取和測(cè)定

根據(jù)優(yōu)化的方法，對(duì)14個(gè)桃品種果肉的總酚進(jìn)行了提取和測(cè)定。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算出其總酚含量，結(jié)果(圖11)顯示，不同桃品種的總酚含量差異顯著(P＜0.05)，分布區(qū)間為0.221 8 ～3.162 1 mg/g;紅肉桃品種的總酚含量明顯高于白肉桃和黃肉桃品種。

圖11 不同果肉顏色桃品種總酚含量Fig.11 Total phenolic contents in peaches with different flesh colors

3 討論

近年，從多酚類視角對(duì)功能性水果的開發(fā)與研究進(jìn)行得如火如荼。桃作為國(guó)際市場(chǎng)上的重要水果之一，開發(fā)功能性桃品種無(wú)論對(duì)于鮮食桃，還是加工用桃均意義重大?？傮w而言，關(guān)于桃多酚的研究均還處于起步階段，這些研究多集中在對(duì)部分桃品種總酚含量的描述［10，13］和抗氧化能力的初步測(cè)定［14-15］;另外，利用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)桃酚種類及其含量做了初步的探索［6-8，11］，確定的桃多酚物質(zhì)有兒茶素、表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、蘆丁以及部分糖苷類。從酚類視角開展功能性桃品種的選育也還剛剛開始［12］。

超聲波輔助提取方法［16-17］和福林-酚比色法［18-19］操作簡(jiǎn)單，結(jié)果精確穩(wěn)定，能很好地對(duì)水果總酚含量進(jìn)行定量研究，在水果總酚含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛。本試驗(yàn)利用上述方法對(duì)桃總酚提取和測(cè)定方法進(jìn)行了研究，獲得了桃總酚提取和測(cè)定的最佳方法:60.00%乙醇，料液比為1∶10，40℃超聲提取60 min;測(cè)定波長(zhǎng)為765 nm，0.5 mol/L福林-酚與沒(méi)食子酸的體積比為 3∶1，0.5 mol/L福林-酚與0.5 mol/L Na2CO3體積比為1∶4，反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。該方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性良好、精密度高。前人利用綠原酸作為標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定桃總酚均在725 nm 波長(zhǎng)處［8，14］，而本試驗(yàn)確定 765 nm 為桃總酚測(cè)定最佳波長(zhǎng)，并且采用在水果總酚測(cè)定中普遍利用的沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物，這便于進(jìn)行桃與其他水果酚含量和功能性潛力的比較，從而對(duì)功能性桃品種的選育提供借鑒。利用優(yōu)化的方法測(cè)定了14個(gè)不同果肉顏色的桃品種總酚含量，結(jié)果顯示紅肉桃品種總酚含量明顯高于黃肉桃和白肉桃品種，與前人研究結(jié)果一致［14-15］;這進(jìn)一步說(shuō)明紅肉桃品種作為當(dāng)前主要育種目標(biāo)之一的重要性，以及開發(fā)多類型功能性桃品種的可能性。

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