炎寧糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

周楠 武佳麗 曲范娜 張清波 孟云閣 孫小萌 筆雪艷

摘要：目的 ?提高炎寧糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制制劑質(zhì)量。方法 ?采用薄層色譜法對(duì)炎寧糖漿中白花蛇舌草、鹿茸草進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC測(cè)定去乙酰車葉草酸甲酯的含量，建立HPLC指紋圖譜分析方法。結(jié)果 ?薄層色譜鑒別分離度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好;含量測(cè)定指標(biāo)去乙酰車葉草酸甲酯在0.08～0.8 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=1.000），平均回收率為104.68%，精密度RSD=0.89%，重復(fù)性RSD=0.55%;經(jīng)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析，標(biāo)定了33個(gè)共有峰，確認(rèn)4個(gè)峰分別為原兒茶酸、去乙酰車葉草酸甲酯、香草酸、咖啡酸，對(duì)10批炎寧糖漿進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，其相似度均高于0.85。結(jié)論 ?本方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可為提高炎寧糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：炎寧糖漿;白花蛇舌草;鹿茸草;去乙酰車葉草酸甲酯;薄層色譜法;高效液相色譜法;指紋圖譜

中圖分類號(hào)：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）05-0083-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.018 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To improve the quality standard of Yanning Syrup and control the qulity of preparation. Methods The thin-layer chromatography method was used to conduct qualitative identification for Hedyotis diffiisa and Monochasma sheareri in Yanning Syrup. HPLC was used to measure the content of deacetyl asperulosidic acid methyl ester. The HPLC fingerprint analysis method was established. Results The method of the thin layer chromatographic condition was good enough. And the method was special and reproducible. The linear of deacetyl asperulosidic acid methyl ester was in the range of 0.08–0.8 μg （r=1.000）. The average recovery rate was 104.68%， RSD of precision was 0.89%， RSD of reproducibility was 0.55%. Besides， Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprints of TCM was used to analyze and compare the fingerprints. Totally 33 common peaks were determined and four were calibrated including protocatechuic acid， deacetyl asperulosidic acid methyl ester， vanillic acid and caffeic acid. The similarity were all over 0.85 for 10 batches of Yanning Syrup. Conclusion The method is simple， accurate and specific， which can provide a reasonable basis for the improvement of quality standard of Yanning Syrup.

Keywords： Yanning Syrup; Hedyotis diffiisa; Monochasma sheareri; deacetyl asperulosidic acid methyl ester; TLC; HPLC; fingerprints

炎寧糖漿由鹿茸草、白花蛇舌草、鴨跖草3味藥組成，具有清熱解毒、消炎止痢功效。鹿茸草為玄參科植物沙氏鹿茸草的干燥地上部分，收載于2008年版《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[1]，含有苯乙醇苷、黃酮、有機(jī)酸及多糖等成分[2]，具有清熱解毒、涼血止血、除濕止痛、抑菌抗炎、抗癲癇及保護(hù)心肌的功效[3-4]。白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草的干燥全草，收載于2012年版《黑龍江省中藥飲片炮制規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)》[5]，含有萜類、黃酮、多糖、生物堿及氨基酸等成分[6]，具有清熱解毒、散結(jié)消痛、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化的功效[7-8]。鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草的干燥地上部分，收載于2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）[9]，具有清熱消炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗高血糖及抑菌的功效[10-11]。炎寧糖漿現(xiàn)收載于2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部），鑒別項(xiàng)為化學(xué)反應(yīng)法和以熊果酸為對(duì)照的薄層鑒別法，含量測(cè)定為紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量[9]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)際薄層鑒別中熊果酸與齊墩果酸難以分離，含量測(cè)定采用紫外可見分光光度法測(cè)定總黃酮干擾項(xiàng)較多。為更有效控制制劑質(zhì)量，本試驗(yàn)修改白花蛇舌草的薄層色譜鑒別，并增加鹿茸草的薄層色譜鑒別，采用HPLC測(cè)定白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量，以咖啡酸為參照峰，建立HPLC指紋圖譜分析方法。

1 ?儀器與試藥

1260型HPLC儀，包括DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）;2695型HPLC儀，包括2998PDA檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）;XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;DXA252薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（杭州漢澤科技有限公司）;Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），Venusil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），Kiomosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）;TLC用硅膠G板（青島海洋化工廠）;聚酰胺薄膜（臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）。

炎寧糖漿，黑龍江康隆藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為1610001、1610002、1610003、1607001、1607002、1607003、1701003、1701004、1704001、1701001，依次編號(hào)為S1～S10;白花蛇舌草、鹿茸草、鴨跖草，黑龍江康隆藥業(yè)有限公司，批號(hào)160701，經(jīng)黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所筆雪艷鑒定為白花蛇舌草、鹿茸草、鴨跖草正品;白花蛇舌草對(duì)照藥材（批號(hào)121028- 200507）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110855- 201210）、原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)110809-200604）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201408）、去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)111786-201602），中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇為色譜純，美國(guó)Honeywell公司;乙醇、氯仿、冰醋酸為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水，自制。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?定性鑒別

2.1.1 ?白花蛇舌草

取炎寧糖漿10 mL，加硅藻土適量拌勻，干燥，加乙醇30 mL，靜置12 h，過濾，濾液濃縮至約2 mL，制成供試品溶液。取白花蛇舌草對(duì)照藥材1 g，加水30 mL，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液濃縮至約15 mL，加乙醇30 mL，靜置12 h，過濾，濾液濃縮至約2 mL，制成對(duì)照藥材溶液。按處方量折算制成缺白花蛇舌草的炎寧糖漿，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法[2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則0502]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10 μL、對(duì)照藥材溶液5 μL、陰性對(duì)照溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（5∶1.5∶0.1）的下層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.1.2 ?鹿茸草

取炎寧糖漿5 mL，加水20 mL稀釋，用乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方量折算制成缺鹿茸草的炎寧糖漿，同法制成陰性對(duì)照溶液。稱取咖啡酸對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mg/ mL的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則0502]試驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以36%乙酸為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈光下（365 nm）檢視。供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.2 ?含量測(cè)定

2.2.1 ?色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱溫：30 ℃;流動(dòng)相：乙腈-水（4∶96，V/V）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm;進(jìn)樣量：5 μL。在上述色譜條件下，以去乙酰車葉草酸甲酯峰計(jì)理論塔板數(shù)≥8000，分離度>1.5。色譜圖見圖1。

2.2.2 ?對(duì)照品溶液的制備

取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品適量，精密稱定，加4%乙腈制成含去乙酰車葉草酸甲40 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 ?供試品溶液的制備

取炎寧糖漿5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 ?陰性對(duì)照溶液的制備

按處方量并以相同制劑工藝制備缺白花蛇舌草的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 ?線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=7.237 5X-3.200 0（r=1.000），去乙酰車葉草酸甲酯在0.08～0.8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 ?重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)1607001），按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算含量，去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD=0.55%，表明本法重復(fù)性較好。

2.2.7 ?精密度試驗(yàn)

取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD=0.89%，表明本方法精密度良好。

2.2.8 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、16、24 h測(cè)定，去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD=1.34%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 ?加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的炎寧糖漿（批號(hào)1607001）供試品6份，每份2.5 mL（含去乙酰車葉草酸甲酯0.367 1 μg），精密加入去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.10 ?耐用性試驗(yàn)

考察不同品牌十八烷基鍵合硅膠色譜柱（Aglilent C18、Kiomosil C18、Venusil C18）、柱溫對(duì)色譜圖的影響。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果樣品色譜峰分離度、理論塔板數(shù)均能滿足要求，耐用性良好。

2.2.11 ?樣品含量測(cè)定

按上述方法制備供試品溶液，測(cè)定10批炎寧糖漿中去乙酰車葉草酸甲酯含量，每批平行測(cè)定2份，結(jié)果見表2。

2.3 ?指紋圖譜

2.3.1 ?色譜條件

色譜柱：Venusil C18（4.6 mm×100 mm，5 ?m）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，0%A;4～25 min，0～13%A;25～30 min，13%A;30～40 min，13%～17%A;40～62 min，17%～36%A;62～80 min，36%～57%A）;流速：0.9 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm（0～40 min），350 nm（40.1～60 min），250 nm（60.1～80 min）;進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 ?對(duì)照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸對(duì)照品適量，加甲醇配制成含咖啡酸0.2 mg/mL對(duì)照品溶液;精密稱取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品適量，加4%乙腈制成含去乙酰車葉草酸甲酯40 μg/mL對(duì)照品溶液;精密稱取原兒茶酸對(duì)照品適量，加70%甲醇配制成含原兒茶酸0.1 mg/mL對(duì)照品溶液;精密稱取香草酸對(duì)照品適量，加70%甲醇配制成含原兒茶酸0.2 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.3.3 ?供試品溶液的制備

精密量取本品5 mL，加水定容至50 mL容量瓶中，搖勻，0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 ?精密度試驗(yàn)

取同一批供試品溶液（批號(hào)167001），按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，記錄色譜圖，以咖啡酸色譜峰為參照峰，對(duì)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，并利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》計(jì)算相似度。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.30%，相對(duì)峰面積RSD為0.3%～2.56%，均小于3.0%，表明本方法精密度良好。

2.3.5 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液（批號(hào)167001），按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、18、24進(jìn)樣測(cè)定，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02～0.22%，相對(duì)峰面積RSD為0.49%～2.86%，均小于3.0%。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》計(jì)算相似度，結(jié)果穩(wěn)定性相似度均大于0.98，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 ?重復(fù)性試驗(yàn)

取平行制備的同一批號(hào)炎寧糖漿（167001）6份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.23%，均小于2.0%;相對(duì)峰面積RSD為0.53%～4.70%。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》計(jì)算相似度，結(jié)果重復(fù)性相似度均大于0.98，表明本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.7 ?共有峰及參照色譜峰的建立

取10批炎寧糖漿樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并取咖啡酸、去乙酰車葉草酸甲酯、原兒茶酸、香草酸對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，得到各樣品HPLC指紋圖譜，結(jié)果見圖2。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件確定了33個(gè)共有峰，并計(jì)算其相似度，結(jié)果見表3。利用對(duì)照品比對(duì)進(jìn)行共有峰指認(rèn)，通過對(duì)比保留時(shí)間和DAD光譜圖，確認(rèn)13號(hào)峰為原兒茶酸，14號(hào)峰為去乙酰車葉草酸甲酯，20號(hào)峰為香草酸，21號(hào)峰為咖啡酸，其中咖啡酸峰分離度好、響應(yīng)值適中、相對(duì)峰面積較大，故以咖啡酸作為參照色譜峰。

3 ?討論

本研究在炎寧糖漿原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，增加了白花蛇舌草和鹿茸草的專屬性鑒別，以及對(duì)白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量測(cè)定。去乙酰車葉草酸甲酯為白花蛇舌草主要的萜類成分之一，具有紫外吸收，易于檢測(cè)，且在常用中藥中均未發(fā)現(xiàn)，因此選去乙酰車葉草酸甲酯作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分有較好的專屬性[12]。

白花蛇舌草對(duì)照藥材的薄層色譜鑒別，分別考察了三氯甲烷-乙醚（5∶1）、三氯甲烷-甲醇-水（5∶1.5∶0.5）、三氯甲烷-乙醇-濃氨試液（7.5∶7.5∶0.1）等多個(gè)展開系統(tǒng)，最終確定了三氯甲烷-甲醇-水（5∶1.5∶0.5）為展開劑的薄層色譜條件。

鹿茸草含有大量咖啡酸，在鹿茸草的薄層色譜鑒別中，考察了乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）、36%乙酸展開系統(tǒng)，后者的展開效果明顯優(yōu)于前者。此外，將鹿茸草水煎液按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，供試品與鹿茸草在相應(yīng)位置上有多個(gè)相同顏色斑點(diǎn)，且無陰性干擾。但由于無市售的鹿茸草對(duì)照藥材，故仍將咖啡酸鑒別定為鹿茸草的鑒別方法。

去乙酰車葉草酸甲酯的含量測(cè)定試驗(yàn)中，經(jīng)DAD全波長(zhǎng)掃描，在237 nm具有最大吸收波長(zhǎng)，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm。根據(jù)去乙酰車葉草酸甲酯的理化性質(zhì)和色譜行為，考察了水溶解、水飽和正丁醇萃取、乙酸乙酯萃取、D101大孔樹脂洗脫制成供試品溶液，結(jié)果表明，水直接稀釋的供試品溶液保留時(shí)間適中、分離度好且峰面積較大，為保證樣品含量測(cè)定結(jié)果的真實(shí)有效性，最終選擇水溶解進(jìn)樣。

在炎寧糖漿指紋圖譜研究中，本研究對(duì)乙腈- 0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%乙酸水溶液、乙腈-0.5 %乙酸溶液作為流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，應(yīng)用乙腈-0.5%乙酸水溶液系統(tǒng)洗脫可使炎寧糖漿樣品得到較好的分離。分別于流速0.8、0.9、1.0 mL/min條件下對(duì)炎寧糖漿樣品的指紋圖譜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，流速為0.9 mL/min時(shí)，各成分分離效果較好，基線較平穩(wěn)，故選擇流速為0.9 mL/min。

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（收稿日期：2018-08-29）

（修回日期：2018-09-19;編輯：陳靜）