紫云英苷調(diào)節(jié)腸道菌群緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

中圖分類號(hào) R285.5；R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）14-1709-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.14.04

ABSTRACTOBJECTIVETo explore thepotential mechanisms of astragalin（AG）in allvatingulcerativecolitis（UC）in mice throughmodulationof the intestinalflora.METHODSMale C57BL/6 micewererandomly divided intonormal group（CON group），model group[dextran sodium sulfate（DSS）group]，5-aminosalicylic acid group（5-ASA group），AG low-dose groupand high-dosegroup（AGLandAGH groups），with8micein each group.Themice UCmodel was establishedby drinking 3% DSS solution continuously for 7 days in all groups except the CON group. After that， 3% DSS solution was replaced by water，and the mice of eachdrug group were gavaged with the corresponding drug solution. Micein the CONand DSS groups were gavaged with anequalvolumeofnormal saline，onceaday，for7days.Afer thelastgavage，thebodyweightchange index，diseaseactivity index（DAI） score，colon length and spleen index，and levels of inflammatory factors（tumor necrosis factor- ∝ ，interleukin- ?1β ， interleukin-6）werecomparedamongthemiceineachgroup；pathologicalchangesincolonictissesof themicewereobservedin eachgroup，andthepathologicalscoreandthepercentageofgobletcellswerecompared；mRNAexpresionsofbarier-related factors[occludinandZO-1]andinflammation-relatedfactors[silencingiformationregulatoryfactor1（SIRT1），c-JunN-terinal kinase（JNK）andp38 mitogen-activated protein kinase（p38MAPK）were detected ineach groupof mice；thechanges inthe intestinal flora of mice in each group were analyzed and the contentsof intestinal metabolitesshort-chainfattyacids （SCFAs）was determined. Using DSS and AG-treated fecal bacterial liquid as an intervention，the mechanism of anti-UC effect ofAG wasfurtherverified bya fecal microbiota transplantexperiment.RESULTSCompared with the CON group，the intestinal mucosal structureof mice in the DSSgroup was severelydamaged，withobviousinfitrationof inflammatorycellscolapsing thewall；theirbodyweightchangeindex，colon length，the percentageof gobletcells，mRNA expressonsofocludin，ZO-1and SIRT1，Chaoland Shannon indexes，and contents of acetic acid and butyric acid were significantly reduced，shortened or down-regulated （ （Plt;0.05 ）；however，DAI score， spleenidex，levelsof inflammatoryfactors，pathologicalscore，aswellasmRNAexpresionsofp38MAPKandJNK，wereall significantly increased or up-regulated （ Plt;0.05 ）.Compared with the DSS group，colon tissue lesions of AG mice in all dose groups showed diffrent degrees of improvement，and the above quantitative indexes were generally regressed （Plt;0.05 ），and the interventioneffectof AG-treatedfecal bacterialfluidwas basicallythesameasthatofAG.CONCLUsIONSAGcanimprove relevantsymptomsinUCmiceandreducetheir inflammatoryresponseandcolonichistopathologicalchanges.Theaboveeffects mayberelatedtoregulatingthediversityofintestinalflorainmice，increasingthecontentsofbutyricacidandpropionicacid，and promotingtherepairof thecolonic mucosalbarrer，thusregulating theexpresionsofgenesrelatedtothe SIRT/p38MAPK inflammatory pathway.

KEYWORDSastragalin；ulcerativecolitis；intestinal flora；inflammation；short-chain fatty acids

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis，UC）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及腸道屏障功能受損、黏膜持續(xù)性炎癥及腸道菌群紊亂等多種因素，其中腸道菌群紊亂已被證實(shí)是促進(jìn)UC進(jìn)展的關(guān)鍵因素。研究指出，致病菌分泌的腸毒素可增加腸道上皮細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致位于腸腔內(nèi)的細(xì)菌及其產(chǎn)物進(jìn)入腸道黏膜固有層，從而引發(fā)異常的炎癥反應(yīng)2；同時(shí)，在持續(xù)的炎癥環(huán)境下，腸道黏膜固有層不斷受到多種致病因子的侵襲，進(jìn)一步加速UC惡化。目前，UC臨床治療的常用藥物包括氨基水楊酸制劑、類皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，然而這些藥物存在副作用大、根治效果不佳等不足，加之患者長期用藥經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大，故開發(fā)安全有效的UC治療藥物具有重要意義。

紫云英苷（astragalin，AG）存在于黃芪、辣木葉、百蕊草等多種中草藥中，是一種生物活性廣泛的天然黃酮類成分，藥用價(jià)值高。近期研究表明，AG可通過減輕炎癥細(xì)胞浸潤和調(diào)節(jié)腸道菌群來緩解脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜屏障損傷4；另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AG可通過抑制核因子KB激活來減輕結(jié)腸炎癥狀；同時(shí)，這兩項(xiàng)研究均指出，AG可提高與短鏈脂肪酸（short-chainfattyacids，SCFAs）生成密切相關(guān)的腸道菌群的數(shù)量，但均未對(duì)AG干預(yù)SCFAs的效果進(jìn)行探索，亦未明確AG對(duì)腸道菌群的干預(yù)作用是否與小鼠UC癥狀的改善直接相關(guān)。近年來，糞便菌群移植（fecalmicrobiotatransplant，F(xiàn)MT）作為一種通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂、重塑腸道菌群結(jié)構(gòu)而影響生物轉(zhuǎn)運(yùn)通路或代謝過程的實(shí)驗(yàn)方法，被廣泛用于腸道疾病的相關(guān)研究中?；诖?，本研究擬利用葡聚糖硫酸鈉（dextransodiumsulfate，DSS）誘導(dǎo)構(gòu)建UC小鼠模型，驗(yàn)證AG對(duì)小鼠UC癥狀的改善作用，并探索該成分對(duì)腸道菌群及SCFAs的影響；同時(shí)，本研究擬結(jié)合FMT實(shí)驗(yàn)，探討AG的抗UC作用是否與該成分對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用直接相關(guān)，以期為AG改善UC作用機(jī)制的闡釋及其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用主要儀器包括ELX-808IU型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司）DMi8型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、ThermoTrace1300型氣相系統(tǒng)和ThermoISQ7000型質(zhì)譜儀（美國ThermoFisherScientific公司）、ViiA7型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

AG原料藥（純度 99.63% ，批號(hào)RP22052201）購自成都麥德生科技有限公司；5-氨基水楊酸（5-aminosalicylicacid，5-ASA）原料藥（陽性對(duì)照，純度 ?98% ，批號(hào)A823148）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；DSS（批號(hào)MB5535-1）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子 ∝ （tumornecrosis factor- α TNF-α 、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β試劑盒（批號(hào)分別為20231220、20231220、20231220）均購自上?？婆d商貿(mào)有限公司；TriQuick總RNA提取試劑 Green定量PCR混合物、一步cDNA合成試劑盒、阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫染色（Alcian blueand periodicacid-Schiff stai-ning，AB-PAS）試劑盒、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)分別為20231128、20231210、20231213、G1285、G1120）均購自北京索萊寶科技有限公司；閉合蛋白（occludin）、緊密連接蛋白ZO-1、c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）、p38絲裂原活化的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silencinginformationregulatoryfactor1，SIRT1） ，β. -肌動(dòng)蛋白（ -actin）實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司設(shè)計(jì)、合成。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠， 6～8 周齡，體重 20～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心[溫度 （25±2）^°C ，相對(duì)濕度55%～65% ，晝夜交替]，自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)方案已通過廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（編號(hào)202310012）。

2 方法

2.1AG對(duì)UC小鼠的改善作用評(píng)價(jià)

2.1.1 造模、分組與給藥

取小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（CON組）模型組（DSS組）陽性對(duì)照組（5-ASA組）、紫云英昔低劑量組（AGL組）和高劑量組（AGH組），每組8只。在實(shí)驗(yàn)的第 1～7 天，除CON組小鼠自由飲水外，其余各組小鼠均飲用 3%DSS 溶液（若出現(xiàn)活動(dòng)減少、立毛、體重下降、腹瀉和便血等癥狀，則認(rèn)為UC模型構(gòu)建成功）；在實(shí)驗(yàn)的第 8～14 天，將 3%DSS 溶液換為水，同時(shí)5-ASA組小鼠灌胃 100mg/kg 的5-ASA，AGL、AGH組小鼠分別灌胃 50，100mg/kg 的AG，灌胃體積均為 0.02mL/g ，每天1次（以生理鹽水為溶劑，藥物劑量均參考既往研究設(shè)置[5）；CON組、DSS組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次。

2.1.2小鼠體重變化指數(shù)、活動(dòng)性疾病指數(shù)、結(jié)腸長度、 脾臟指數(shù)檢測

實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組小鼠的體重變化情況，于末次給藥后計(jì)算其體重變化指數(shù)即末次給藥后（第14天）與飲用 3%DSS 溶液首日（第1天）的體重之比]，并進(jìn)行活動(dòng)性疾病指數(shù)（diseaseactivityindex，DAI）評(píng)價(jià)。DAI評(píng)分為體重變化、糞便稠度、糞便隱血度3項(xiàng)評(píng)分的平均值，具體標(biāo)準(zhǔn)為——（1）體重變化評(píng)分：體重減輕 lt;1% ，記0分；體重減輕 1%～lt;5% ，記1分；體重減輕 5%～lt;10% ，記2分；體重減輕 10%～lt;15% ，記3分；體重減輕 ?15% ，記4分。（2）糞便稠度評(píng)分：糞便正常，記0分；便稀，記2分；明顯腹瀉，記4分。（3）糞便隱血度評(píng)分：糞便無隱血，記0分；隱血陽性，記2分；明顯出血，記4分。末次給藥 2nΩ 后，各組小鼠以頸椎脫白法處死，分離其結(jié)腸并測量結(jié)腸長度，分離脾臟、稱重并計(jì)算脾臟指數(shù)（脾臟指數(shù) 脾重/體重 ×100% ）。

2.1.3小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子檢測

取各組小鼠結(jié)腸組織適量，加9倍量的磷酸鹽緩沖液（PBS），勻漿，離心 20min 后，收集上清液，參照相應(yīng)試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀檢測其中炎癥因子（TNF- σ?α∝ 、IL-1β、IL-6）水平。

2.1.4小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察和杯狀細(xì)胞占比檢測

取各組小鼠結(jié)腸組織適量（因經(jīng)費(fèi)原因，結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究僅從上述組別中隨機(jī)選擇3只小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行考察），以 4% 多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片；切片經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水后，進(jìn)行HE染色，使用顯微鏡觀察小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)形態(tài)并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。該評(píng)分為炎癥評(píng)分和組織損傷評(píng)分之和，具體標(biāo)準(zhǔn)為一—（1）炎癥評(píng)分：腸道黏膜固有層無炎癥細(xì)胞，記0分；腸道黏膜固有層炎癥細(xì)胞數(shù)量增加，記1分；炎癥細(xì)胞延伸至黏膜下層，記1.5分；炎癥細(xì)胞跨壁浸潤，記2分。（2）組織損傷評(píng)分：無黏膜損傷，記0分；可見離散性上皮損傷，記1分；可見表面黏膜糜爛，記1.5分；存在廣泛的黏膜損傷并延伸至腸壁深部結(jié)構(gòu)，記2分[。取各組小鼠結(jié)腸組織切片，同法處理后，進(jìn)行AB-PAS，使用顯微鏡觀察并采用ImageJ軟件評(píng)估各組小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞占比（杯狀細(xì)胞被染為藍(lán)色，以其染色面積在總面積中的百分占比表示）的變化情況。

2.1.5小鼠結(jié)腸組織中腸道屏障及炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)檢測

采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測。取CON組、DSS組、AGH組小鼠結(jié)腸組織適量（因經(jīng)費(fèi)原因，結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究僅從上述組別中隨機(jī)選擇3只小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行考察），嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法提取其總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。經(jīng)濃度、純度檢測后，以此cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共 10μL 包括cDNA模板 1μL，2× SYBRGreen定量PCR混合物5μL 、正向/反向引物（各引物系列及產(chǎn)物長度見表1）各0.2μL 無核酶水 3.6μL 。反應(yīng)條件為 94^°C 預(yù)變性30s;94^°C 變性 5s，60^°C 退火/延伸 30s ，共45個(gè)循環(huán)。以β -actin為內(nèi)參，采用 2^-ΔΔCt 法計(jì)算腸道屏障相關(guān)因子（oc-cludin ?ZO-1 ）和炎癥相關(guān)因子（p38MAPK、JNK、SIRT1）mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1PCR引物及產(chǎn)物長度

2.1.6小鼠腸道菌群檢測

取CON組、DSS組、AGH組小鼠的糞便樣品（考慮到小鼠個(gè)體間腸道菌群及其代謝物差異度比一般生化分子指標(biāo)明顯，且測序儀器精密度要求的樣品數(shù) ?5 ，因此本研究僅從上述組別中隨機(jī)選取5只小鼠的樣品進(jìn)行測定，“2.1.7”項(xiàng)同），按照DNA提取試劑盒說明提取總DNA，經(jīng)質(zhì)量檢測后，擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA的 V3+V4 可變區(qū)（引物 338F：5^′ -ACTCCTACGGGAGGCAGCA- ?3^′ ，806R： 5^′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT- .3^′ ）。取所得PCR產(chǎn)物，經(jīng)定量后構(gòu)建微生物多樣性測序文庫，采用IlluminaMiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，使用QIIME2軟件讀取測序結(jié)果，并根據(jù)操作分類單元聚類分析結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)（Chaol和Shannon指數(shù)）分析、群落聚類分析，并根據(jù)分類信息對(duì)各分類層次的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和線性判別分析（即LEfSe分析）。上述實(shí)驗(yàn)委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

2.1.7 小鼠糞便中SCFAs含量檢測

取CON組、DSS組、AGH組小鼠的糞便樣品適量，置于離心管中，加水適量，勻漿 1min ，于 4^°C 下離心10min ;取上清液，加 15% 磷酸溶液 +375μg/mL 的4-甲基戊酸溶液 + 乙醚混合溶液（體積比為5：1：14），勻漿1min，再于 4^°C 下離心 10min ；取上清液，即得供試品溶液。取上述各組供試品溶液，采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)以內(nèi)標(biāo)法檢測其中乙酸、丁酸、丙酸、戊酸的含量。GC-MS條件如下：色譜柱為AgilentHP-INNOWAX毛細(xì)管柱 30m×0.25mm，0.25μm） ；進(jìn)樣口溫度為 250^°C 載氣為氮?dú)?；流速?1.0mL/min ；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1μL ，分流比為10：1；程序升溫，起始溫度為 90^°C ，然后以10^oC/min 升溫至 120^°C ，再以 5°C/min 升溫至 150^°C 最后以 25°C/min 升溫至 250^°C 并維持 2min 。電離源為電子轟擊電離源;離子源溫度為 300^°C ，傳輸線溫度為250^°C ;以選擇離子監(jiān)測（selected ionmonitoring，SIM）模式進(jìn)行正離子掃描；電子能量為 70eV 。以待測成分與內(nèi)標(biāo)（4-甲基戊酸）的峰面積比值為縱坐標(biāo) （Y） 、待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X） ，得乙酸、丁酸、丙酸、戊酸的回歸方程分別為 Y=0.00604X+0.00248（r=0.9968 ）、Y=0.032 05X⁺0.000 58 _r=0.9979 ）、 Y=0.009 53X+ 0.00051（r=0.9981），Y=0.04210X+0.00078（r=0.9918） .其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍均為 0.02～500.00μg/mL 該法精密度、重復(fù)性等方法學(xué)考察均符合2020版《中國藥典》（四部）的相關(guān)規(guī)定。上述實(shí)驗(yàn)委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

2.2AG抗UC作用與其對(duì)腸道菌群影響的相關(guān)性驗(yàn)證

采用FMT實(shí)驗(yàn)考察AG抗UC作用是否與該成分對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用直接相關(guān)。

2.2.1 分組、造模與給藥

參照既往研究方案，取小鼠48只，分為受體小鼠（24只）和供體小鼠（24只）。取供體小鼠，隨機(jī)分為CON組、DSS組、AGH組，每組8只，按“2.1.1\"項(xiàng)下方法造模、干預(yù)。取受體小鼠，將其飲用水換為抗菌藥物混合物溶液（含萬古霉素 0.5g/L 、氨芐西林 1g/L 、甲硝唑1g/L 硫酸新霉素 1g/L ），持續(xù)飲用14d以消耗腸道菌群，然后再隨機(jī)分為FMT-CON組、FMT-DSS組、FMT-AGH組，每組8只。在隨后的第 1～7 天，除FMT-CON組小鼠自由飲水外，其余各組小鼠均飲用 3%DSS 溶液；從第8天起，將 3%DSS 溶液換為水，同時(shí)取供體小鼠糞便，加10倍量生理鹽水稀釋，渦旋混勻 5min ，取上清液，按每只 200μL 的體積灌胃至受體小鼠體內(nèi)（FMT-CON組、FMT-DSS組、FMT-AGH組分別對(duì)應(yīng)CON組、DSS組、AGH組），每天1次，持續(xù)灌胃7d。

2.2.2 小鼠相關(guān)指標(biāo)的檢測

末次灌胃后，按“2.1.2\"項(xiàng)下方法計(jì)算FMT-CON組、FMT-DSS組、FMT-AGH組小鼠的體重變化指數(shù)；同時(shí)，進(jìn)行DAI評(píng)分、結(jié)腸長度測量和脾臟指數(shù)計(jì)算；分別按^?2.1.3^′′～^…2.1.5^′′ 項(xiàng)下方法檢測或觀察上述3組小鼠結(jié)腸組織中的炎癥因子（TNF- σ?α∝ 、IL-1β、IL-6）水平，結(jié)腸組織病理形態(tài)、病理學(xué)評(píng)分和杯狀細(xì)胞占比，以及結(jié)腸組織中occludin、ZO-1、p38 MAPK、JNK、SIRT1 mRNA的表達(dá)情況（除染色觀察和mRNA檢測取每組3小鼠的組織樣本外，其余指標(biāo)均取每組8只小鼠檢測）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，GraphPadPrism8軟件繪制圖表。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05 。

3結(jié)果

3.1AG對(duì)UC小鼠改善作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1AG對(duì)UC小鼠體重變化指數(shù)、DAI評(píng)分、結(jié)腸長度和脾臟指數(shù)的影響

與CON組比較，DSS組小鼠體重變化指數(shù)和結(jié)腸長度均顯著降低或縮短，DAI評(píng)分、脾臟指數(shù)均顯著升高 ?lt;0.05 ）。與DSS組比較，各藥物組小鼠體重變化指數(shù)、結(jié)腸長度均顯著升高或延長，DAI評(píng)分（AGL組除外）脾臟指數(shù)均顯著降低（ （Plt;0.05 0。結(jié)果見表2。

表2各組小鼠體重變化指數(shù)、DAI評(píng)分、結(jié)腸長度和脾臟指數(shù)比較 0

a：與CON組比較， ?Plt;0.05 ;b：與DSS組比較， .Plt;0.05，

3.1.2AG對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平的影響

與CON組比較，DSS組小鼠結(jié)腸組織中TNF- σ?α?α?α?α IL-1β、IL-6水平均顯著升高 （Plt;0.05 ；與DSS組比較，各藥物組小鼠結(jié)腸組織中TNF- ∝ （AGL組除外）、IL-1β（AGL組除外）、IL-6（AGH組除外）水平均顯著降低1 ?lt;0.05 ）。結(jié)果見表3。

表3各組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平及病理學(xué)評(píng)分、杯狀細(xì)胞占比比較

a：與CON組比較， Plt;0.05：6 ：與DSS組比較， Plt;0.05，

3.1.3AG對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)和杯狀細(xì)胞占比的影響

與CON組比較，DSS組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，隱窩結(jié)構(gòu)不完整，局部有輕至重度壞死，大量炎癥細(xì)胞跨壁浸潤；其病理學(xué)評(píng)分顯著升高而杯狀細(xì)胞占比顯著減少 （Plt;0.05） 。與DSS組比較，各藥物組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)均有不同程度改善，隱窩破壞有所減少，上皮結(jié)構(gòu)逐漸完整，炎癥細(xì)胞浸潤有所減少；其病理學(xué)評(píng)分（AGL組除外）均顯著降低而杯狀細(xì)胞占比（AGL組除外）均顯著增多（ Plt;0.05 ）。結(jié)果圖1、圖2、表3。

3.1.4AG對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織中腸道屏障及炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

與CON組比較，DSS組小鼠結(jié)腸組織中occludin、ZO-1、SIRT1mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào)，p38MAPK、JNKmRNA的表達(dá)均顯著上調(diào) ?Plt;0.05 ）。與DSS組比較，AGH組小鼠結(jié)腸組織中occludin、ZO-1、SIRT1mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)，p38MAPKmRNA的表達(dá)顯著下調(diào) （Plt;0.05 。結(jié)果見表4。

3.1.5AG對(duì)UC小鼠腸道微生物群結(jié)構(gòu)及組成的影響

多樣性結(jié)果顯示，與CON組（Chao1指數(shù)： 1444.55± 636.26;Shannon指數(shù)： 7.33±0.51 比較，DSS組的Chaol指數(shù) （521.77±281.08） ）、Shannon指數(shù) （5.21±0.48） 均顯著降低 Plt;0.05 ）；與DSS組比較，AGH組小鼠Chao1指數(shù) （1071.43±148.20） 、Shannon指數(shù) （6.22±0.23） 均顯著升高（ （Plt;0.05 。微生物群落聚類分析結(jié)果（圖3A）顯示，DSS組小鼠的群落聚類區(qū)域明顯偏離CON組，而AGH組的群落聚類區(qū)域則接近于CON組。微生物組成分析結(jié)果（圖3B）顯示，在門水平上，DSS組小鼠腸道菌群中的厚壁菌門與擬桿菌門的相對(duì)豐度比值（Firmicutes/Bacteroidetes）、變形菌門Proteobacteria的相對(duì)豐度均較CON組顯著升高 （Plt;0.05） ；而AGH可顯著扭轉(zhuǎn)這一趨勢 （Plt;0.05） 。LEfSe分析結(jié)果（圖3C）顯示，CON組的代表性物種有9個(gè)，包括擬桿菌門Bacte-roidetes、普氏菌屬Prevotella等；DSS組為16個(gè)，包括大腸埃希菌-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella、腸球菌屬Enterococcus等;AGH組為8個(gè)，如乳桿菌科Lactobacilla-ceae和雙歧桿菌屬Bifidobacterium等。

表4各組小鼠結(jié)腸組織中腸道屏障及炎癥相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

a：與CON組比較， Plt;0.05 ;b：與DSS組比較， Plt;0.05 0

3.1.6AG對(duì)UC小鼠腸道代謝物SCFAs含量的影響

與CON組比較，DSS組小鼠糞便樣品中乙酸、丁酸含量均顯著降低 （Plt;0.05 ）;與DSS組比較，AGH組小鼠糞便樣品中丁酸、丙酸含量均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見表5。

3.2AG抗UC作用與其對(duì)腸道菌群影響的相關(guān)性驗(yàn)證結(jié)果

3.2.1FMT下AG對(duì)UC小鼠體重變化指數(shù)、DAI評(píng)分、結(jié)腸長度、脾臟指數(shù)的影響

與FMT-CON組比較，F(xiàn)MT-DSS組小鼠體重變化指數(shù)、結(jié)腸長度均顯著降低或縮短，DAI評(píng)分和脾臟指數(shù)均顯著升高 （Plt;0.05） ）;與FMT-DSS組比較，F(xiàn)MT-AGH組小鼠的結(jié)腸長度顯著延長，DAI評(píng)分顯著降低（ Plt; 0.05）。結(jié)果見表6。

圖1各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的顯微觀察圖（HE染色）

藍(lán)色箭頭：組織結(jié)構(gòu)損傷；紅色箭頭：炎癥細(xì)胞浸潤。

圖2各組小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞的顯微觀察圖（AB-PAS）

圖3AG對(duì)UC小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的影響

表5各組小鼠腸道代謝物SCFAs含量比較 5，μg/g） （204號(hào)

a：與CON組比較， Plt;0.05：6 ：與DSS組比較， Plt;0.05_lt;

表6FMT下各組小鼠體重變化指數(shù)、DAI評(píng)分、結(jié)腸長度、脾臟指數(shù)比較 ）

a：與FMT-CON組比較， Plt;0.05：0 ：與FMT-DSS組比較， Plt;0.05 。

3.2.2FMT下AG對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平的影響

與FMT-CON組比較，F(xiàn)MT-DSS組小鼠結(jié)腸組織中TNF- ∝ 、IL-1β、IL-6水平均顯著升高 ?Plt;0.05 ）；與FMT-DSS組比較，F(xiàn)MT-AGH組小鼠結(jié)腸組織中TNF- ∝ IL-1β水平均顯著降低 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見表7。

3.2.3FMT下AG對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)和杯狀細(xì)胞占比的影響

與FMT-CON組比較，F(xiàn)MT-DSS組小鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，局部有輕至重度壞死，炎癥細(xì)胞跨壁浸潤嚴(yán)重；其病理學(xué)評(píng)分顯著升高而杯狀細(xì)胞占比顯著減少

表7FMT下各組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平及病理學(xué)評(píng)分、杯狀細(xì)胞占比比較

a：與FMT-CON組比較， Plt;0.05 ;b：與FMT-DSS組比較 ?Plt;0.05 □（Plt;0.05） ）。與FMT-DSS組比較，F(xiàn)MT-AGH組小鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)明顯改善，上皮結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，炎癥細(xì)胞浸潤減少；其病理評(píng)分顯著降低而杯狀細(xì)胞占比顯著增多 ?Plt;0.05 ）。結(jié)果見表7、圖4、圖5。

圖4FMT下各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的顯微觀察圖（HE染色）

藍(lán)色箭頭：組織結(jié)構(gòu)損傷；紅色箭頭：炎癥細(xì)胞浸潤。

圖5FMT下各組小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞的顯微觀察圖（AB-PAS）

3.2.4FMT下AG對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織中腸道屏障及炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

與FMT-CON組比較，F(xiàn)MT-DSS組小鼠結(jié)腸組織中occludin、ZO-1mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào)，p38MAPK、JNKmRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)（ （Plt;0.05） ）；與FMT-DSS組比較，F(xiàn)MT-AGH組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、SIRT1mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)，p38MAPKmRNA的表達(dá)顯著下調(diào) （Plt;0.05 。結(jié)果見表8。

表8FMT下各組小鼠結(jié)腸組織中腸道屏障及炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)比較 ）

a：與FMT-CON組比較 .Plt;0.05：6 與FMT-DSS組比較 ，Plt;0.05 。

4討論

UC是一種以結(jié)腸持續(xù)性彌散性炎癥為主要特征的疾病，其臨床表現(xiàn)包括便血、腹瀉、結(jié)腸縮短及體重減輕等癥狀[；此外，基于DSS致UC小鼠模型的研究結(jié)果顯示，當(dāng)機(jī)體處于炎癥表達(dá)亢進(jìn)狀態(tài)時(shí)，脾臟細(xì)胞可明顯增殖，表現(xiàn)為小鼠脾指數(shù)顯著升高[]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DSS誘導(dǎo)后，小鼠DAI評(píng)分和脾臟指數(shù)均顯著升高，結(jié)腸長度和體重變化指數(shù)均顯著縮短或降低，提示UC模型復(fù)制成功；經(jīng)不同劑量的AG干預(yù)后，UC小鼠的DAI評(píng)分和脾臟指數(shù)均有不同程度降低，結(jié)腸長度和體重變化指數(shù)均顯著延長或升高，提示AG能夠有效緩解UC小鼠的相關(guān)癥狀。

結(jié)腸內(nèi)異?？哼M(jìn)的炎癥反應(yīng)是UC的典型病理特征。作為UC的關(guān)鍵促炎介質(zhì)，TNF- σ?α∝ IL-6、IL-1β水平的異常升高會(huì)干擾腸道分泌功能，破壞腸道緊密連接結(jié)構(gòu)，促使上皮通透性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致UC發(fā)生或惡化[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與CON組比較，UC小鼠結(jié)腸組織內(nèi)可見大量的炎癥細(xì)胞跨壁浸潤，且TNF- σ?α∝ 、IL-6、IL-1β水平均顯著升高；經(jīng)不同劑量AG干預(yù)后，UC小鼠結(jié)腸組織中的炎癥細(xì)胞浸潤有所減少，TNF- α_?∝ （AGL組除外）、IL-1β（AGL組除外）、IL-6（AGH組除外）水平均顯著降低，提示AG對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC炎癥反應(yīng)具有緩解作用。

腸上皮屏障功能障礙與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中由occludin和ZO-1等蛋白組成的緊密連接是腸道上皮屏障的重要組成部分，可防止致病性抗原進(jìn)人腸腔而引起異常炎癥反應(yīng)，對(duì)維持黏膜內(nèi)微環(huán)境平衡具有重要作用[4]。研究指出，當(dāng)腸上皮屏障功能受損后，腸道防御能力將急速下降，從而導(dǎo)致黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，隱窩結(jié)構(gòu)不完整且呈局部輕至重度壞死，杯狀細(xì)胞大幅減少[5]。本研究結(jié)果顯示，與CON組比較，UC小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，隱窩結(jié)構(gòu)不完整，其病理學(xué)評(píng)分顯著升高，杯狀細(xì)胞占比和occludin、ZO-1mRNA的表達(dá)均顯著降低或下調(diào)；經(jīng)不同劑量的AG干預(yù)后，UC小鼠結(jié)腸組織病理損傷均有不同程度改善，AGH組小鼠的病理學(xué)評(píng)分顯著降低，杯狀細(xì)胞占比和occludin、ZO-1mRNA的表達(dá)均顯著升高或上調(diào)，提示AG可修復(fù)UC小鼠受損的腸上皮屏障。

SIRT1/JNK/p38MAPK信號(hào)通路與炎癥性腸道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，SIRT1可通過維持細(xì)胞連接相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制抗原呈遞及促炎趨化因子活化，從而在維持腸上皮屏障完整性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[；作為SIRT1下游關(guān)鍵蛋白，p38MAPK可通過磷酸化激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)IL-1β、TNF- ∝ 等炎癥因子的分泌，下調(diào)occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)，破壞腸道的緊密連接結(jié)構(gòu)，最終誘發(fā)黏膜屏障相關(guān)炎癥反應(yīng)[];JNK是SIRT1、p38MAPK的調(diào)控蛋白，若抑制其表達(dá)可顯著延緩結(jié)腸炎的進(jìn)展[I8]。本研究結(jié)果顯示，與CON組比較，UC小鼠結(jié)腸組織中SIRT1mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，JNK、p38MAPKmRNA的表達(dá)均顯著上調(diào);經(jīng)高劑量AG處理后，UC小鼠結(jié)腸組織中SIRT1mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，p38MAPKmRNA的激活受到明顯抑制，表明AG能調(diào)節(jié)UC相關(guān)炎癥通路的異常表達(dá)，進(jìn)而阻斷結(jié)腸炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，但AG對(duì)JNK蛋白表達(dá)的影響還有待進(jìn)一步探索。

腸道菌群失衡與腸道炎癥反應(yīng)亢進(jìn)及腸上皮屏障功能受損密切相關(guān)。研究表明，變形菌門菌株會(huì)加速腸道炎癥病變，是結(jié)腸炎小鼠腸道菌群失調(diào)的重要標(biāo)志[19];大腸埃希菌-志賀氏菌屬和腸球菌屬菌株作為多種腸道疾病的致病菌，可加劇腸道疾病的進(jìn)展2；而乳桿菌科和雙歧桿菌屬菌株不僅可幫助宿主腸道降解植物纖維以產(chǎn)生有助于腸道健康的SCFAs，而且可調(diào)節(jié)腸上皮功能、促進(jìn)緊密連接的形成2]。SCFAs是對(duì)抗腸道炎癥的重要醫(yī)療補(bǔ)充劑，其中丁酸是腸上皮細(xì)胞的重要能量來源，可通過激活SIRT1的表達(dá)和下調(diào)TNF- ?α，IL-1β 、p38MAPK的表達(dá)，提高結(jié)腸組織中ZO-1、occludin蛋白的表達(dá)水平來減輕腸道炎癥，從而保護(hù)腸內(nèi)基質(zhì)22]。本研究結(jié)果顯示，與CON組比較，UC小鼠的Chao1、Shan-non指數(shù)均顯著降低，其群落聚類區(qū)域明顯偏離，F(xiàn)irmicutes/Bacteroidetes和變形菌門的相對(duì)豐度均顯著升高，糞便樣品中乙酸、丁酸的含量均顯著降低；經(jīng)AG干預(yù)后，UC小鼠的Chao1、Shannon指數(shù)均顯著升高，腸道菌群的改變得以扭轉(zhuǎn)，糞便樣品中丁酸、丙酸的含量均顯著升高。由此可見，AG可能通過改善腸道菌群失衡、調(diào)節(jié)SCFAs含量、抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)程、修復(fù)腸道屏障功能等途徑來發(fā)揮抗UC作用。

由上述結(jié)果可知，AG對(duì)腸道菌群及其代謝物的干預(yù)效果是明顯的，然而這種調(diào)節(jié)作用是否為該成分改善UC小鼠相關(guān)癥狀的直接原因之一尚未可知。為此，本課題組利用FMT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。FMT是一種通過將健康個(gè)體的糞便移植至微生物失衡的個(gè)體中，以協(xié)助后者重建微生物平衡的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛用于炎癥性腸病等與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)疾病的研究領(lǐng)域。FMT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)DSS處理的糞菌液未能減輕偽無菌UC小鼠的疾病癥狀，而經(jīng)AG處理的糞菌液則可減輕偽無菌UC小鼠的相關(guān)癥狀，提示AG對(duì)腸道菌群及代謝物的調(diào)節(jié)作用可能是改善UC小鼠相關(guān)癥狀的原因之一。本課題組通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在AG改善作用實(shí)驗(yàn)和FMT實(shí)驗(yàn)中，AG及其處理的糞菌液均能改善小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸長度、炎癥因子（TNF- ∝ 和IL-1β）水平、炎癥相關(guān)因子（p38MAPK和SIRT1）mRNA和腸道屏障相關(guān)因子（ZO-1）mRNA的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與AG重塑腸道菌群后，部分致病菌代謝物及內(nèi)毒素對(duì)腸道屏障的侵襲破壞環(huán)節(jié)受阻有關(guān)2；此外，AG及其處理的糞菌液均可顯著影響SIRT1、p38MAPKmRNA的表達(dá)，其作用機(jī)制也可能與AG通過調(diào)節(jié)SCFAs含量來發(fā)揮對(duì)炎癥性腸病小鼠炎癥通路的干預(yù)作用有關(guān)[24-25]。

綜上所述，AG可改善UC小鼠的相關(guān)癥狀，減輕其炎癥反應(yīng)和結(jié)腸組織病理改變；上述作用可能與調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群多樣性，增加丁酸、丙酸含量，促進(jìn)結(jié)腸黏膜屏障的修復(fù)，進(jìn)而調(diào)控SIRT1/p38MAPK炎癥通路相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[ 1」UNGARO K，MEHANDRU S，ALLEN P B，et aI. UIcerative colitis[J].Lancet，2017，389（10080）： 1756-1770.

[2]PARADA VENEGAS D，DE LA FUENTE M K， LANDSKRON G，et al. Short chain fatty acids（SCFAs） - mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases[J].Front Immunol，2019，10：277.

[3]馬祥雪，溫永天，尹曉嵐，等.從“脾為之衛(wèi)”理論探討腸 道黏膜免疫與潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)機(jī)制[J].世界科學(xué)技 術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2024，26（3）：640-645.

[4]TANG E H，LIN H， YANG Y H，et al. Dietary astragalin confers protection against lipopolysaccharide-induced intestinal mucosal barrier damage through mitigating inflammation and modulating intestinal microbiota[J]. Front Nutr，2024，11：1481203.

[5]PENG L，GAO X Y，NIE L，et al. Astragalin attenuates dextran sulfate sodium（DSS）-induced acute experimental colitis by alleviating gut microbiota dysbiosis and inhibiting NF- κB activation in mice[J]. Front Immunol，2020， 11：2058.

[6］宋揚(yáng)，溫樹波.幼齡犢牛腸道菌群定植及糞菌移植技術(shù) 的應(yīng)用[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2025，37（2）：723-734.

[7］葛俊李，李芳，王春霞，等.潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的研 究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2022，40（11）：165-170， 10040.

[8]GUO J Y，MA B C， WANG Z X，et al. Royal jelly protected against dextran-sulfate-sodium-induced colitis by improving the colonic mucosal barrier and gut microbiota [J].Nutrients，2022，14（10）：2069.

[9]LIUCS，HUYX，LUO ZY，et al. Xianglian pill modulates gut microbial production of succinate and induces regulatory Tcells to alleviate ulcerative colitis in rats[J]. J Ethnopharmacol，2023，303：116007.

[10]楊陽，周協(xié)琛，李濤，等.急性潰瘍性結(jié)腸炎昆明小鼠模 型的制備與評(píng)價(jià)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2023，44（2）：72-77.

[11]DONG S J， ZHU M，WANG K，et al. Dihydromyricetin improves DSS-induced colitis in mice via modulation of fecal-bacteria-related bile acid metabolism[J].Pharmacol Res，2021，171：105767.

[12] KAMINSKY LW，AL-SADI R，MA TY. IL- ?1β and the intestinal epithelial tight junction barrier[J]. Front Immunol，2021，12：767456.

[13]AL-SADI R，GUO S H，YED M，et al. TNF- α modulation of intestinal tight junction permeability is mediated by NIK/IKK- α axis activation of the canonical NF- κB 10c（r）1

[14]KUO W T，ODENWALD MA，TURNER JR，et al. Tight junction proteins occludin and ZO-1 as regulators of epithelial proliferation and survival[J]. Ann N Y Acad Sci， 2022，1514（1）：21-33.

[15]LIAO WZ，WUHF，PANGL C，et al. Hylocereus undatus flower suppresses DSS-induced colitis in mice by reducing intestinal inflammation，repairing the intestinal physical barrier，and modulating gut and lung microbiota [J].JFunct Foods，2023，110：105820.

[16]WANG L，LI J S，JIANG M S，et al. SIRT1 stabilizes β -TrCP1 to inhibit Snaill expression in maintaining intestinal epithelial integrity to alleviate colitis[J]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol，2024，18（2）：101354.

[17]FENG Y J，LI Y Y. The role of p38 mitogen-activated proteinkinase in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J].JDig Dis，2011，12（5）：327-332.

[18]KERSTING S，BEHRENDT V， KERSTING J，et al. The impact of JNK inhibitor D-JNKI-1 in a murine model of chronic colitis induced by dextran sulfate sodium[J]. J Inflamm Res，2013，6：71-81.

[19]MUKHOPADHYA I，HANSEN R，EL-OMAR EM，et al. IBD：what role do proteobacteria play？[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2012，9（4） ：219-230.

[20]GOGOKHIA L， BUHRKE K，BELL R，et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis[J].Cell Host Microbe，2019，25（2）： 285-299.e8.

[21]BERGER K，BURLEIGH S，LINDAHL M，et al. Xylooligosaccharides increase Bifidobacteria and Lachnospiraceae in mice on a high-fat diet，with a concomitant increase in short-chain fatty acids，especially butyric acid[J]. JAgric Food Chem，2021，69（12）：3617-3625.

[22]LIU H，WANG J，HE T，et al. Butyrate：a double-edged sword for health？[J].Adv Nutr，2018，9（1）：21-29.

[23]DI VINCENZO F，DEL GAUDIO A，PETITO V，et al. Gut microbiota，intestinal permeability，and systemic inflammation：a narrative review[J]. Intern Emerg Med， 2024，19（2）：275-293.

[24]WANG S Q，DENG W L，LI F，et al. Treatment with butyrate alleviates dextran sulfate sodium and Clostridium difficile-induced colitis by preventing activity of Th17 cells via regulation of SIRTl/mTOR in mice[J]. J Nutr Biochem，2023，111：109155.

[25]向小琴.短鏈脂肪酸對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性呼吸窘迫 綜合征的影響及作用機(jī)制[D].瀘州：西南醫(yī)科大學(xué)， 2022. （收稿日期：2025-01-07修回日期：2025-05-17）

（編輯：張?jiān)拢?/p>