海南本地抗病小米辣響應(yīng)象耳豆根結(jié)線蟲侵染的miRNA鑒定及其靶基因預(yù)測

摘" 要：象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）是一種對辣椒生產(chǎn)危害較大的病原物，使用抗病品種是防治該病害最為經(jīng)濟、環(huán)保的手段。深入理解根結(jié)線蟲抗性調(diào)控機理將有利于加速抗病育種進程。本課題組前期研究中對海南本地抗病小米辣種質(zhì)CF25進行了接種前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，挖掘了與根結(jié)線蟲抗性相關(guān)的代謝通路。為進一步探索抗性表達調(diào)控機理，本研究對CF25接種前后sRNA文庫進行了高通量測序，共檢測到133個差異表達miRNAs。以P≤0.05和|log₂（FC）|≥3為篩選標準，鑒定出33個顯著差異表達的miRNAs，其中包括19個已知miRNAs和14個新發(fā)現(xiàn)miRNAs。對33個顯著差異表達的miRNAs進行靶基因預(yù)測，共得到373個靶基因，其中miR5658-z預(yù)測靶基因數(shù)量最多。GO功能和KEGG代謝通路富集分析顯示靶基因主要富集于植物-病原菌互作、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路，推測miRNA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物防御反應(yīng)可能是CF25抗象耳豆根結(jié)線蟲的重要原因。為初步驗證差異表達miRNA和靶基因間的調(diào)控關(guān)系，選取6個差異表達miRNAs及其靶基因進行qRT-PCR表達驗證，得出miRNA與靶基因的表達差異趨勢與高通量測序結(jié)果一致，基本符合miRNA負向調(diào)控靶基因表達的規(guī)律。以上研究結(jié)果表明miRNA可能在辣椒對根結(jié)線蟲的防御反應(yīng)中起到了重要作用，為后續(xù)深入解析miRNA介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性機理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：灌木辣椒；抗象耳豆根結(jié)線蟲；sRNA測序；miRNA；靶基因

中圖分類號：S436.418 """""文獻標志碼：A

Identification and Target Gene Prediction of miRNA Responding to the Infection of Meloidogyne enterolobii in Local Resistant Xiaomila Pepper of Hainan， China

GAO Chang¹， ZHANG Zhiyuan²， LIU Ziji³， CHEN Meihong⁴， ZHU Jie^1*， CAO Zhenmu^3*

<！--[if ！supportLists]-->1. <！--[endif]-->School of Tropical Agriculture and Forestry （School of Agriculture and Rural Affairs / School of Rural Revitalization）， Hainan University / Hainan Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Crops， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Hainan Research Institute， Zhejiang University， Sanya， Hainan 572025， China; 3. Institute of Tropical Crops Genetic Resources， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 4. Hainan Binfen Horticulture Co.， Ltd.， Haikou， Hainan 571133， China

Abstract： Meloidogyne enterolobii is a pathogen causing significant damages to pepper production. Utilization of resistant cultivars is the most economical and environmentally friendly method to control this disease. A deeper understanding of the regulatory mechanisms of resistance to root-knot nematodes could facilitate the breeding process of disease-resistant cultivars. In previous studies， analysis of transcriptomic data of Hainan local M. enterolobii-resistant pepper germplasm CF25 before and after inoculation were carried out to explore metabolic pathways closely related to nematode resistance. In order to further explore the regulatory mechanisms of resistance， sRNA libraries of CF25 before and after inoculation with M. enterolobii were sequenced to identify a total of 133 differentially expressed miRNAs. Based on the criteria of P≤0.05 and |log₂（FC）|≥3， 33 significantly differentially expressed miRNAs were identified， including 19 known miRNAs and 14 newly discovered miRNAs. Target gene prediction for the 33 miRNAs yielded a total of 373 target genes， with miR5658-z having the highest number of predicted target genes. GO and KEGG analyses showed that the target genes were mainly enriched in pathways related to plant-pathogen interactions and signal transduction. It is speculated that miRNA-mediated signal transduction and plant defense responses might be important reasons for the resistance of CF25 to M. enterolobii. To preliminarily verify the regulatory relationships between differentially expressed miRNA and the target genes， six differentially expressed miRNA and the target genes were selected for qRT-PCR validation. The results showed that the differential expression trends of miRNA and target genes were consistent with the high-throughput sequencing results and generally conformed to the negative regulation pattern between miRNA and the target genes. The results of this study suggest that miRNA may play significant roles in the defense response to root-knot nematodes and lay the foundation for furtherly elucidating the mechanisms of miRNA-mediated nematode resistance in pepper.

Keywords： Capsicum frutescens; Meloidogyne enterolobii resistance; sRNA sequencing; miRNA; target gene

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.005

辣椒（Capsicum spp.）是茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum）一年生或多年生草本植物，距今已經(jīng)有6000多年的栽培歷史^[1]。辣椒種植方法簡單、產(chǎn)值高，果實富含辣椒素、類胡蘿卜素和類黃酮等營養(yǎng)成分，不僅能滿足人們對調(diào)味的需求，還在醫(yī)藥、軍事、農(nóng)業(yè)方面都有一定應(yīng)用價值^[2]。由于全球氣候改變和農(nóng)業(yè)文明現(xiàn)代化等多種因素的影響，辣椒面臨多種病蟲害的威脅。其中根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）被認為是一類重要的辣椒土傳病害，可導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降^[3]。

根結(jié)線蟲是一類透明無脊椎植物病原物，能侵染植物根部使其形成膨大根結(jié)，從而破壞根系對水分和養(yǎng)分的吸收，影響植物的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致植物提早死亡。根結(jié)線蟲種類繁多，其中象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，對辣椒的致病性和侵染能力較強，且已經(jīng)克服N、Me1、Me3/Me7等辣椒抗根結(jié)線蟲基因^[4-5]，在辣椒生產(chǎn)上造成的經(jīng)濟損失日益嚴重^[6]，因此需要深入研究辣椒抗病機理，發(fā)掘新的抗病基因，為抗病育種工作提供理論依據(jù)和基因資源。

microRNA（miRNA）是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其長度為21～24 nt。miRNA可以通過堿基互補配對識別相關(guān)靶基因mRNA，進而降解該mRNA或者抑制其翻譯，達到負調(diào)控基因表達的效果^[7]。miRNA廣泛參與各植物生物學過程，在防御應(yīng)答以及寄主-病原物互作中均起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯遭大麗輪枝菌（Verlicillium dahliae）侵染后，miR482下調(diào)表達，負向調(diào)控NBS-LRR基因上調(diào)表達，從而提高其抗病性^[8]。水稻感染稻瘟病菌（Magna-porthe oryzae）后，miR398b下調(diào)表達，從而調(diào)控超氧化物歧化酶基因上調(diào)表達，加強了對稻瘟病的抗性^[9]。由miR397靶向的漆酶基因CA07g11100在辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染的前期上調(diào)，而后轉(zhuǎn)為下調(diào)，推測該基因可能參與辣椒與疫霉菌的互作^[10]。由此可見，miRNA可以通過調(diào)節(jié)靶基因的表達來影響植物對病原物的抗性^[11]。然而，目前有關(guān)辣椒抗根結(jié)線蟲miRNA-靶基因的研究工作相對較少，從miRNA層面探究根結(jié)線蟲與辣椒互作的分子機制將加深人們對作物抗根結(jié)線蟲機理的認識，為后續(xù)抗病育種工作提供較為新穎的切入點。

小米辣原產(chǎn)于云南、海南等地區(qū)的野生、半野生灌木辣椒（Capsicum frutescens）。其植株粗大近似鋤柄，根系發(fā)達，結(jié)果期長，產(chǎn)量較高^[12]。在長期自然選擇的壓力下，小米辣逐步演化出了耐高溫潮濕、抗病、耐瘠薄和耐弱光的特性^[13]，對許多生物及非生物脅迫都具有良好的抗性，能生長在極其惡劣的環(huán)境條件下^[14-18]。為了改良我國現(xiàn)有辣椒栽培種，挖掘小米辣在抗病育種中的潛力，本課題組前期從21份海南本地小米辣資源中篩選出7份象耳豆根結(jié)線蟲高抗種質(zhì)。通過酸性品紅染色和石蠟切片等組織病理學方法，發(fā)現(xiàn)高抗種質(zhì)CF25對象耳豆根結(jié)線蟲的抗性主要體現(xiàn)在抗侵入和限制取食兩方面。通過對CF25和感病對照CF29進行接種前后的防御酶測定，得出CF25在接種后多數(shù)時間點的PAL和POD活性顯著高于感病對照，推測較高的PAL和POD活性可能導(dǎo)致包括木質(zhì)素在內(nèi)的更多苯丙烷類次生代謝產(chǎn)物的積累。本課題組前期發(fā)現(xiàn)接種第24小時，抗、感材料中線蟲數(shù)量分別為（0.67±0.94）條和（0.33±0.47）條，不存在顯著差異（P=0.68）。然而，當接種第4天時，CF25單株根系中僅發(fā)現(xiàn)（0.67±0.94）條線蟲，而感病對照CF29中約存在（11±3.27）條線蟲，數(shù)量差異達到了顯著水平（P=0.01）。不僅如此，通過觀察接種第1、2、3、4天的線蟲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)接種第4天線蟲略有加粗，推測已開始建立取食點。為兼顧對阻止侵入和抑制取食分子機理的研究，本課題組對高抗材料CF25和感病對照CF29進行接種前后（第0天，第4天）的轉(zhuǎn)錄組測序分析，得出抗、感材料接種前后差異基因主要富集于苯丙烷生物合成、植物-病原體互作等代謝通路^[19-20]。然而，如何從這些代謝通路中篩選出與抗性緊密關(guān)聯(lián)的基因是一個亟待解決的問題，且相關(guān)基因的表達調(diào)控機理尚未得到解析。為此，本研究以高抗象耳豆根結(jié)線蟲種質(zhì)CF25為研究對象，構(gòu)建接種前后（接種第0天和第4天）sRNA文庫，利用Illumina二代測序技術(shù)開展miRNA測序，篩選差異表達miRNA并進行靶基因的預(yù)測和初步驗證，為進一步研究辣椒中miRNA介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性機制提供重要依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

選取海南本地收集的象耳豆根結(jié)線蟲抗性小米辣資源CF25為試驗對象。將種子在55"℃溫水中浸泡15 min，28"℃恒溫催芽。種子露白后播種到用滅菌土填充的21孔穴盤中，每穴播種1粒種子。待辣椒苗長出6片真葉，對每株種苗接種1000條象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲，在接種第0天（R0，對照）和第4天（R4）分別選取大小均一的種苗各3株，將根系洗凈，迅速用濾紙吸干水分，投入液氮速凍，送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行sRNA文庫構(gòu)建和高通量測序。

1.2" 方法

1.2.1" miRNA的提取和文庫構(gòu)建 "用Trizol法從樣本中提取總RNA，聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳切膠選擇18～30 nt范圍的條帶，回收sRNA。根據(jù)sRNA的結(jié)構(gòu)特點，分別連接3￠和5￠接頭，對sRNA進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，最后使用PAGE膠回收并純化條帶，完成文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫使用Agilent2100以及ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies）進行質(zhì)量和產(chǎn)量的檢測，合格后上機測序。

1.2.2" miRNA鑒定" 對測序原始數(shù)據(jù)（raw data）進行清洗，去除不帶有3'接頭的、測序效果不好的、不含插入片段或插入片段長度小于18 nt的、70%以上堿基為poly A的低質(zhì)量序列，得到用于后續(xù)分析的純凈序列（clean reads）。將純凈序列與中國辣椒（Capsicum chinense）參考基因組數(shù)據(jù)（http：//peppergenome.snu.ac.kr/download.php）進行比對，得出比對基因組情況。將測序數(shù)據(jù)與miRBase中數(shù)據(jù)進行比對分析得出已知miRNA情況。利用miREvo和mirdeep2軟件預(yù)測樣品中的novel miRNA。

1.2.3" miRNA差異表達分析" 對所有miRNA用TPM進行歸一化處理，以P≤0.05和|log₂（FC）|≥3為標準進行顯著差異表達miRNA的篩選工作。

1.2.4" 靶基因預(yù)測及功能分析" 使用Patmatch_ v 1.2軟件進行miRNA和靶基因的互補配對分析，再通過程序篩選預(yù)測得到最終結(jié)果，同時對miRNA靶基因進行GO分析和KEGG富集分析。將差異表達蛋白向GO數(shù)據(jù)庫（http：//www.gene-ontology.org/）的各term映射，并計算每個term的蛋白數(shù)，從而得到具有某個GO功能的蛋白列表及蛋白數(shù)目。GO功能分析：應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個背景蛋白相比，在差異表達蛋白中顯著富集的GO條目，將計算得到的P值通過校正之后，以corrected-P≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達蛋白中顯著富集的GO term。KEGG富集分析：應(yīng)用超幾何檢驗，找出與背景蛋白相比，在差異表達蛋白中顯著性富集的Pathway，然后經(jīng)過多重檢驗校正后，選擇Q≤0.05的Pathway定義為在差異表達蛋白中顯著富集的Pathway。

1.2.5" miRNA及其靶基因的qRT-PCR驗證" 選取6個顯著差異miRNA及其靶基因進行qRT-PCR驗證，引物序列如表1所示。qRT-PCR反應(yīng)體系為PCR Master Mix 10"μL，上/下游引物（10"μmol/L）各0.4 μL，ddH₂O 8.6 μL，cDNA模板1 μL。擴增條件為：95"℃ 3 min；95"℃ 5 s，60"℃ 30 s，45個循環(huán)。內(nèi)參為U6和Actin。采用2^–ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。使用Microsoft Excel 2016軟件對相對表達量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和作圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" sRNA高通量測序數(shù)據(jù)分析

分別構(gòu)建抗病小米辣種質(zhì)CF25接種象耳豆根結(jié)線蟲第0天（Mi-R0-1、Mi-R0-2、Mi-R0-3）

和第4天（Mi-R4-1、Mi-R4-2、Mi-R4-3）的sRNA文庫，進行高通量測序。由圖1可知，分別從Mi-R0和Mi-R4中獲得39 810 053和34 003 912條原始序列。去污處理后分別得到33"851"394和29"645"658條純凈序列，分別占序列總數(shù)的85%和87%。所有樣品的sRNA總豐度為63 497 052條，其中包括rRNA 10 351 257條（16.3%）、SnRNA 277 536條（0.44%）、snoRNA 87 954條（0.14%）、tRNA 499 442條（0.79%）、exon sense 6 709 635條（10.57%）、已知miRNAs 9 149 130條（14.41%）、新發(fā)現(xiàn)miRNAs 384 833條（0.61%）、genome others 19 396 665條（30.55%）、未注釋序列16 640 600條（26.21%）（圖2A）。將用于后續(xù)分析的clean reads和中國辣椒（Capsicum chinense）參考基因組數(shù)據(jù)進行比對，結(jié)果如圖2B所示?？偙葘β蕿?3.6%，Mi-R0的平均比對率為78.12%，Mi-R4的平均比對率為66.41%，6個文庫的比對率均達到65%以上。綜上，本研究測得的sRNA序列質(zhì)量較好，適合開展后續(xù)miRNA研究工作。

2.2 "miRNA鑒定

對sRNA測序數(shù)據(jù)進行鑒定，共檢測到1023個miRNAs，其中包括已知miRNAs 362個和新發(fā)現(xiàn)的miRNAs 661個。對這些miRNA進行長度分析，發(fā)現(xiàn)其長度主要集中在20～24 nt之間，其中21 nt和24 nt的miRNAs數(shù)量最多，分別為233個和502個（圖3），符合植物miRNA的長度特點。對miRNA的堿基偏好性進行分析，發(fā)現(xiàn)在第1、3、14、15、18、19、24位點更偏好于尿嘧啶（U），均達到了50%以上；在第2、4、8、9、13、16、20、21、22、23位點更偏好于胞嘧啶（C），均達到51%以上；在第5、6、11、12位點更偏好于鳥嘌呤（G），均達到65%以上；在第7、10、17位點更偏好于腺嘌呤（A），均達到66%以上（圖4A）。miRNA的首位堿基偏好是尿嘧啶（U），在

長度18～22 nt的miRNA中占有比例均超過80%。在24"nt長度的miRNA中5￠端首位堿基腺嘌呤 （A）含量較高，占比為60.60%，其次為尿嘧啶（U），占比為2.50%，最后是鳥嘌呤（G），占比為36.86%（圖4B）。

2.3 "接種前后差異表達miRNA分析

為檢測處理組（Mi-R4）和對照組（Mi-R0）之間以及組內(nèi)生物學重復(fù)間變異度大小，對miRNA測序數(shù)據(jù)進行主成分（PCA）分析，得到6個主成分。如圖5A所示，主成分PC1和PC2能解釋miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)55%的差異。處理組和對照組樣本表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，且距離較遠，說明處理組和對照組miRNA的差異比較大。而組內(nèi)各生物學重復(fù)間的miRNA數(shù)據(jù)表現(xiàn)出一定的聚集性，說明組內(nèi)樣品間重復(fù)性相對較好。采用Pearson相關(guān)性系數(shù)對6個樣本的相關(guān)性進行分析，相關(guān)系數(shù)越接近1，代表樣本之間相關(guān)性越高。結(jié)果顯示，組內(nèi)生物學重復(fù)間的相關(guān)性均為1，說明組內(nèi)樣本均一度較高。而組間樣本的相關(guān)性處于0.98～0.99之間，表明存在一定差異（圖5B）。綜上所述，處理組和對照組miRNA相對差異較大，而組內(nèi)差異較小，可進行后續(xù)差異表達miRNA的鑒定工作。

如圖6A所示，處理組與對照組間鑒定出133個差異表達miRNAs，其中上調(diào)表達的為60個，下調(diào)表達的為73個。由此可見，處理組下調(diào)表達miRNA比上調(diào)表達miRNA數(shù)量更多。以P≤0.05和|log₂（FC）|≥3為篩選標準，鑒定出33個顯著差異表達的miRNAs，其中包括19個已知miRNAs和14個新發(fā)現(xiàn)miRNAs（圖6B）。表達差異顯著的19個已知miRNAs中，miR827-x、miR827-y、miR5530-z、miR8010-z、miR10518-z、miR6023-z、miR399-y、miR5261-z、miR399-x、miR399-z、miR5185-y等11個miRNAs為上調(diào)表達，而miR5658-z、miR1448-z、miR8028-x、miR477-x、miR169-y、miR7712-y、miR477-y、miR395等8個miRNAs則表現(xiàn)出下調(diào)表達趨勢（圖6C）。而在新發(fā)現(xiàn)的14個顯著差異表達miRNAs中，上調(diào)表達的miRNAs有5個，分別為novel-m0242-5p、novel-m0617-3p、novel-m0667-5p、novel-m0307-5p和novel-m0253-5p；顯著下調(diào)表達的miRNAs有9個，分別為novel-m0465-5p、novel-m0280-5p、novel-m0548-5p、novel-m0279-3p、novel-m0238- 5p、novel-m0128-3p、novel-m0610-3p、novel- m0395-5p和novel-m0033-3p（圖6D）。

2.4" 差異表達miRNA靶基因預(yù)測

對133個差異表達miRNAs進行靶基因預(yù)測，得到1781個靶基因，其數(shù)量大約是差異表達miRNA數(shù)量的13倍。對33個顯著差異表達的miRNAs進行靶基因預(yù)測，得到373個靶基因，其中在19個已知miRNAs中預(yù)測到296個靶基因。miR5658-z預(yù)測靶基因數(shù)量最多，為83個。其次是miR5185-y，預(yù)測到38個靶基因。miR8028-x預(yù)測到37個靶基因，排名第三。而miR5530-z僅預(yù)測到了個靶基因。miR8010-z和miR399-x沒有預(yù)測到靶基因。新發(fā)現(xiàn)的14個miRNAs中共預(yù)測到77個靶基因。novel-m0238-5p預(yù)測的靶基因最多，為33個。其次為novel-m0617-3p，預(yù)測到17個靶基因。novel-m0253-5p預(yù)測到13個靶基因，排名第三。而novel-m0667-5p和novel-m0610- 3p分別只預(yù)測到1個靶基因（表2）。novel- m0465-3p、novel-m0280-5p、novel-m0548-5p、novel-m0279-3p、novel-m0395-5p、novel-m0033-3p這6個新發(fā)現(xiàn)miRNAs沒有預(yù)測到靶基因（表2）。

2.5" 差異表達miRNA靶基因GO富集和KEGG代謝通路分析

進一步對差異顯著miRNA的靶基因進行GO富集和KEGG代謝通路分析。將靶基因的GO注釋按照生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）分為3類，并將這3類的條目按照注釋到的差異基因數(shù)目由大到小進行排序和繪圖。BP中富集的條目最多，主要集中于細胞過程和代謝過程；其次為MF，主要集中于結(jié)合和催化活性；富集條目最少的為CC，主要集中于細胞解剖實體和蛋白質(zhì)復(fù)合物等（圖7）。富集條目最多的類目依次為結(jié)合、細胞過程、代謝過程和催化活性。

對差異顯著miRNA的靶基因進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)多個代謝通路產(chǎn)生了較大差異。其中，靶基因主要富集于植物-病原體互作途徑（plant-pathogen interaction），其次為MAPK植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（MAPK signaling pathway-plant）、嘌呤代謝（purine metabolism）和單環(huán)類抗生素生物合成（monobactam biosynthesis）等通路（圖8）。富集于植物-病原體互作的靶基因最多，達到了27個。靶基因數(shù)量占第二位是MAPK植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，富集了11個靶基因。對靶基因富集的KEGG通路進行分類，可以得到不同分類層級的通路。這33個顯著差異表達miRNAs通過68個靶基因在58條生命途徑中起作用，其中環(huán)境適應(yīng)（environmental adaptation）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）這2條生命途徑中富集的靶基因最多（圖9）。由此可見，顯著差異miRNA的靶基因主要富集于植物防御反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等KEGG通路或?qū)蛹?，推測CF25抗象耳豆根結(jié)線蟲的分子機理可能主要基于miRNA介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達調(diào)控。

2.6 "差異表達miRNA及其靶基因的表達驗證

為驗證差異表達miRNA及其靶基因間的調(diào)控關(guān)系，利用qRT-PCR對6個差異表達miRNAs（miR1448-z、miR8028-x、miR5658-z、novel- m0128-3p、miR5185-y、novel-m0253-5p）及其對應(yīng)靶基因（CC.CCv1.2.scaffold436.45、CC.CCv1. 2.scaffold876.5、CC.CCv1.2.scaffold703.8、CC. CCv1.2.scaffold785.9、CC.CCv1.2.scaffold19.56）進行表達驗證。如圖10所示，與對照組相比，miR1448-z、miR8028-x、miR5658-z、novel-m0128- 3p在接種象耳豆根結(jié)線蟲后呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，

其靶基因CC.CCv1.2.scaffold436.45（RPS2）、CC. CCv1.2.scaffold876.5（ATAS3）、CC.CCv1.2.scaffold 703.8（CCD7）呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，符合miRNA負調(diào)控靶基因的特點。而miR5185-y、novel- m0253-5p則是呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，其靶基因CC. CCv1.2.scaffold785.9（ADK）、CC.CCv1.2. scaffold19.56（FLS2）呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢。由此可見，所選擇的6個miRNAs以及5個靶基因的qRT-PCR表達驗證結(jié)果與基于RNA-seq的基因表達量分析結(jié)果基本一致，說明測序結(jié)果準確可靠，且這6個miRNAs可能與相關(guān)靶基因存在一定的調(diào)控關(guān)系。

3" 討論

本研究通過高通量測序?qū)共⌒∶桌狈N質(zhì)CF25接種象耳豆根結(jié)線蟲前后的miRNA表達差異進行了探索，篩選出33個表達差異顯著的miRNAs。其中一些miRNA可能與抗病性有一定聯(lián)系。miR5658在接種象耳豆根結(jié)線蟲4 d后呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達趨勢。而miR5658在黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，

CGMMV）侵染黃瓜1dpi時也出現(xiàn)了下調(diào)表達^[21]。在毛果楊中miR1448被認為是與抗病相關(guān)的miRNA^[22]，在本研究中miR1448呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢。miR395可通過調(diào)節(jié)硫酸鹽代謝來提高水稻對病原體的免疫能力^[23]，在本研究中miR395呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢。miR399在抗性品種四季橘（Citrus microcarpa）感染柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas citri subsp.citri）5 d時，表達量顯著增加。在柑橘中過表達miR399可使?jié)儾〔“呙娣e顯著減小，病情指數(shù)顯著降低，這表明miR399與柑橘的抗?jié)儾∶芮邢嚓P(guān)^[24]，在本研究中miR399在抗性辣椒種質(zhì)CF25接種根結(jié)線蟲4 d時也呈現(xiàn)上調(diào)表達。過表達miR827可以提高煙草對辣椒脈斑駁病毒（ChiVMV）感染的抵抗力^[25]，本研究中miR827呈現(xiàn)上調(diào)表達。還有一些本研究中差異顯著的miRNA在非生物脅迫研究中有所報道，如miR169能響應(yīng)干旱、低溫、高鹽和高溫^[26]。miR 10518-z、miR5261-z、miR5530-z、miR7712-y、miR8010-z和新發(fā)現(xiàn)的novel-m0242-5p、novel- m0617-3p雖未見相關(guān)功能的研究報道，但是在小米辣被象耳豆根結(jié)線蟲侵染后出現(xiàn)特異性表達，|log₂（FC）|值分別高達7.73、7.64、8.00、8.71、7.75、9.56、8.19，猜測它們在辣椒抗根結(jié)線蟲這一過程中可能發(fā)揮了重要的作用，值得進一步開展研究。

為了探究miRNA在辣椒抗象耳豆根結(jié)線蟲過程中的機制和作用，本研究對其靶基因進行了預(yù)測和功能分析。miR5658是33個顯著差異表達miRNA中注釋靶基因最多的miRNA。其靶向的可能與抗病性有關(guān)的基因為MYB20、MYB60、MYB306等。MYB家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其成員通過N端保守的MYB結(jié)構(gòu)域與下游基因啟動子區(qū)的特異性位點相結(jié)合，進而調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄^[27-29]，在植物的生長發(fā)育、激素信號傳遞以及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用^[30-31]。在潰瘍病病菌侵染時，MYB20在抗性品種四季橘（Citrus microcarpa）中表現(xiàn)出顯著的差異表達，感病后其表達量上調(diào)了3倍，參與了柑橘對潰瘍病的抗性調(diào)控^[32]。此外，MYB20是木質(zhì)素生物合成途徑的調(diào)節(jié)因子，在次生細胞壁形成過程中調(diào)控木質(zhì)素的生物合成^[33]。木質(zhì)素作為植物細胞壁的關(guān)鍵成分之一，能夠在植物抵御病原物入侵的過程中起到屏障作用^[34]。MYB60、MYB306雖然在植物抗病方面未見報道，但在非生物脅迫中報道較多，如MYB60參與了細胞中活性氧的平衡調(diào)節(jié)過程，并以此影響氣孔開閉，響應(yīng)木薯^[35]和海島棉^[36]的干旱脅迫。而MYB306在燕子花中對低溫脅迫產(chǎn)生了較大的響應(yīng)^[37]。新預(yù)測的14個顯著差異表達的miRNA中，novel-m0238-5p是預(yù)測靶基因最多的miRNA，可靶向ART2基因。ART2是一種C₂H₂型鋅指轉(zhuǎn)錄因子，能在水稻中通過調(diào)控細胞壁相關(guān)蛋白Os01g0827300上調(diào)表達來增強細胞壁的木質(zhì)化，從而提高植物鋁耐受性^[38]。miRNA可通過靶向抗病基因，讓植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。本研究預(yù)測的靶基因主要富集于植物-病原菌互作、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路。而相關(guān)的靶基因主要為FLS2、RPM1、RPS2等。

基于前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，得出CF25接種第0天和第4天的顯著差異表達基因主要富集于代謝途徑、次生代謝物的生物合成等途徑^[20]。結(jié)合本研究miRNA差異表達數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，初步鑒定出19個顯著差異表達miRNA。依據(jù)基因功能，可將這些miRNA關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄組靶基因大體分為五大類。第一類為代謝相關(guān)基因，包括與色素次生代謝相關(guān)的PKS1、氮代謝相關(guān)的GGT1、嘌呤代謝相關(guān)的ADK、色氨酸代謝相關(guān)的ASAT3和脂質(zhì)代謝相關(guān)的AAE2等；第二類為生物合成相關(guān)基因，包括淀粉生物合成酶APS1、海藻糖合成酶TPS11和獨角金內(nèi)酯合成酶CCD7等。第三類為生長發(fā)育相關(guān)基因，如花發(fā)育相關(guān)基因AGL27、生物鐘調(diào)節(jié)基因LHY和DNA復(fù)制相關(guān)基因RFC3等；第四類為與應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的基因，如SBT4.14和SIN2等；第五類為植物抗病基因，如TGA1、RPP13、FLS2和RPS2等。由此可見，FLS2和RPS2可能是CF25在miRNA調(diào)控下防御象耳豆根結(jié)線蟲的重要基因。novel-m0128- 5p在接種后表達量降低了1.37倍，其潛在靶基因是FLS2。鞭毛感知蛋白FLS2（flagellin sensing 2）是屬于XII家族的富亮氨酸重復(fù)受體樣激酶，F(xiàn)LS2可通過識別鞭毛蛋白表位flg22，對病菌入侵做出迅速反應(yīng)^[39]。FLS2是植物免疫系統(tǒng)的重要組成蛋白^[40]，植物體內(nèi)缺失FLS2蛋白會導(dǎo)致植物對病菌的免疫性下降^[41]。FLS2是蒜芥茄（Solanum sisymbriifolium Lam.）響應(yīng)黃萎?。╡ggplant verticillium wilt）脅迫的重要基因^[42]，也是中華獼猴桃抗?jié)儾。?em>Pseudomonas syringae pv. actinidiae， Psa）的候選抗病基因^[43]。在本研究中，基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以看出，抗病小米辣CF25在接種象耳豆根結(jié)線蟲第4天后，FLS2上調(diào)表達，推測novel-m0128-5p通過負調(diào)控靶基因FLS2增強了CF25的免疫系統(tǒng)，從而提高其抗病能力。目前抗病R蛋白大多數(shù)屬于NBS-LRR類^[44]，NB-ARC屬于NBS-LRR類蛋白中的一個分支，可以通過結(jié)合ADP或ATP來參與植物抗病蛋白的構(gòu)象變化，進而激活植物免疫響應(yīng)與病原菌識別^[45]。RPS2是典型的NB-ARC類抗病基因，在擬南芥抗丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）中發(fā)揮重要作用^[46]，此外，RPS2在水稻中過表達后，對真菌病原體稻瘟病菌和細菌病原體水稻白葉枯病菌產(chǎn)生正響應(yīng)^[47]。在本研究中，RPS2關(guān)聯(lián)到了miR6023-z、miR1448和miR8028三個miRNAs，是關(guān)聯(lián)miRNA數(shù)量最多的靶基因。其中，miR1448與其靶基因RPS2^[48]都被認為與抗病有關(guān)，在本研究中，miR1448可能通過下調(diào)表達從而引起RPS2上調(diào)表達發(fā)揮抗病作用。

綜上所述，本研究通過分析抗象耳豆根結(jié)線蟲小米辣資源CF25在接種前后的sRNA測序數(shù)據(jù)，得出miRNA可能調(diào)控了植物抗病及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的基因表達變化，并由此介導(dǎo)了CF25抗病反應(yīng)的發(fā)生。本研究獲得了較多差異表達miRNA，但它們具體如何通過調(diào)節(jié)靶基因在根結(jié)線蟲和寄主的互作中發(fā)揮抗性作用，需要進一步通過試驗來驗證。還可在此基礎(chǔ)上深入挖掘在辣椒與根結(jié)線蟲互作機制中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的miRNA，為后續(xù)輔助抗病育種工作奠定基礎(chǔ)。

4" 結(jié)論

本研究對抗性小米辣材料CF25接種象耳豆根結(jié)線蟲前后的sRNA數(shù)據(jù)進行分析，鑒定出33個表達差異顯著的miRNA。其中包括一些已知與作物抗病性相關(guān)的miRNA，如miR5658、miR1448、miR395、miR399和miR827等。對這33個表達差異顯著的miRNA進行靶基因預(yù)測，得到373個靶基因。經(jīng)GO功能和KEGG代謝通路富集分析，得出靶基因主要富集于植物-病原體互作以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝途徑。推測miRNA可能通過調(diào)控靶基因參與這些代謝通路發(fā)揮抗病功能。本研究為深入了解辣椒中miRNA介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性機制提供有益的參考數(shù)據(jù)。

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