迭代狂犬病疫苗：無(wú)血清狂犬病疫苗的研究進(jìn)展

1 狂犬病

1.1狂犬病概述

狂犬病是一種由狂犬病病毒（Rabiesvirus）所誘發(fā)的疾病，對(duì)哺乳動(dòng)物影響較大，特別是對(duì)狗、狼、狐貍等動(dòng)物的影響非常大，且高度致命。而人類(lèi)被傳染都是因?yàn)楸桓腥镜膭?dòng)物咬傷?？袢《疽坏┌l(fā)作，幾乎必然導(dǎo)致死亡，死亡率達(dá)到了 100% 。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)可知，在全球每年大概有59000人死于狂犬病，而其中大部分病例都出現(xiàn)在亞洲與非洲的發(fā)展中國(guó)家。因?yàn)槿狈τ行У囊呙绾皖A(yù)防措施，這些地區(qū)的狂犬病的負(fù)擔(dān)尤為沉重。

狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病感染的主要工具，無(wú)論是作為預(yù)防性接種還是作為治療性接種都具有重要意義。我國(guó)是目前世界上最大的人用狂犬病疫苗生產(chǎn)國(guó)和使用國(guó)，當(dāng)今“萌寵經(jīng)濟(jì)”的不斷發(fā)展，和狂犬病發(fā)病后無(wú)藥可醫(yī)的現(xiàn)狀推動(dòng)著狂犬病疫苗的不斷研發(fā)和更新迭代。

1.2傳統(tǒng)狂犬病疫苗的局限性

傳統(tǒng)狂犬病疫苗主要分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是基于神經(jīng)組織制備的初代狂犬病減毒疫苗；另一類(lèi)是第二代基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的疫苗，如Vero細(xì)胞疫苗和人二倍體細(xì)胞疫苗。盡管這些疫苗的研發(fā)和推廣在一定程度上降低了狂犬病的發(fā)病率，但它們各自的局限性仍然存在。

神經(jīng)組織疫苗作為人類(lèi)狂犬病預(yù)防領(lǐng)域“元老級(jí)”的免疫制劑之一，其誕生之初的制備工藝是從感染了狂犬病病毒的動(dòng)物腦組織之中提取病毒抗原成分。這一類(lèi)疫苗的生產(chǎn)成本非常低。但是，因其制備環(huán)節(jié)和神經(jīng)組織有著非常密切的聯(lián)系，在注射此類(lèi)疫苗后很容易導(dǎo)致神經(jīng)炎、腦炎等嚴(yán)重不良反應(yīng)，因而在很多國(guó)家和地區(qū)都已被淘汰。

第二代疫苗中的Vero細(xì)胞疫苗是目前全球應(yīng)用最廣泛的狂犬病疫苗之一，其通過(guò)在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）中培養(yǎng)狂犬病病毒來(lái)生產(chǎn)疫苗。盡管Vero細(xì)胞疫苗較為安全，但是其存在的問(wèn)題也不容忽視。首先是在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中殘留的Vero細(xì)胞DNA與蛋白質(zhì)，這些雜質(zhì)可能給接種者帶來(lái)過(guò)敏或其他不良反應(yīng)。其次，這類(lèi)疫苗的生產(chǎn)依賴(lài)大量的動(dòng)物血清作為培養(yǎng)基成分，不僅增加生產(chǎn)成本，還可能會(huì)出現(xiàn)血清源性疾病的傳播問(wèn)題。

人二倍體細(xì)胞疫苗被認(rèn)為是目前最安全的狂犬病疫苗之一，雖然同樣以細(xì)胞為基質(zhì)，但其區(qū)別于其他動(dòng)物細(xì)胞，人源細(xì)胞基質(zhì)使這種疫苗的純度高、雜質(zhì)少、不良反應(yīng)發(fā)生率較低。然而，人二倍體細(xì)胞疫苗的生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，成本高昂，限制了其在發(fā)展中國(guó)家的廣泛應(yīng)用。

1.3無(wú)血清狂犬病疫苗的發(fā)展背景

為解決傳統(tǒng)疫苗的不足，無(wú)血清狂犬病疫苗的設(shè)想應(yīng)運(yùn)而生。無(wú)血清疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中不使用動(dòng)物血清，從而大大降低疫苗的副作用和生產(chǎn)成本，提高了疫苗的安全性和有效性。無(wú)血清疫苗的研發(fā)主要聚焦于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，同時(shí)純化技術(shù)和佐劑方面的研究也為無(wú)血清疫苗的研發(fā)帶來(lái)了幫助。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，無(wú)血清狂犬病疫苗的研發(fā)取得了顯著進(jìn)展，部分產(chǎn)品已進(jìn)人臨床試驗(yàn)階段，顯示出良好的應(yīng)用前景。

無(wú)血清狂犬病疫苗的研發(fā)始于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)依賴(lài)動(dòng)物血清提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，但這種方法存在諸多局限性。自從1996年Gibco推出第一款無(wú)血清培養(yǎng)基（Serum-FreeMedium，SFM）以來(lái)無(wú)血清培養(yǎng)基的研發(fā)從未停歇，這些培養(yǎng)基通過(guò)添加合成生長(zhǎng)因子、激素和微量元素等成分，模擬體內(nèi)環(huán)境，支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和病毒的生產(chǎn)[1]。無(wú)血清培養(yǎng)基的應(yīng)用不僅提高了疫苗的安全性，解決了血清批間的一致性差異問(wèn)題還降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。

此外，科學(xué)家們還在病毒純化工藝方面取得了重要突破。傳統(tǒng)的病毒純化工藝依賴(lài)于超速離心和層析等技術(shù)，近年來(lái)，如膜過(guò)濾技術(shù)和親和層析技術(shù)等一系列的純化技術(shù)漸漸融入了研發(fā)和生產(chǎn)，這些技術(shù)不僅提高了病毒的純度和收率，提高疫苗成品的質(zhì)量，還能簡(jiǎn)化工藝流程，減少批間差異。

新型佐劑的開(kāi)發(fā)也推動(dòng)了無(wú)血清狂犬病疫苗的開(kāi)發(fā)。佐劑是一種能夠增強(qiáng)疫苗免疫效果的輔助物質(zhì)，常見(jiàn)的佐劑包括鋁鹽、脂質(zhì)體和納米顆粒等。無(wú)血清狂犬疫苗的效價(jià)容易出現(xiàn)偏低的情況，通過(guò)新型佐劑的輔助不僅能夠提高疫苗的免疫效果，還能進(jìn)一步降低疫苗的不良反應(yīng)。近年來(lái)如CpG寡核苷酸和TLR激動(dòng)劑等新型佐劑得到了開(kāi)發(fā)，這些佐劑通過(guò)激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。

2無(wú)血清狂犬病疫苗的研究要點(diǎn)

2.1無(wú)血清細(xì)胞基質(zhì)的研發(fā)

無(wú)血清狂犬病疫苗的研發(fā)始于20世紀(jì)末，科學(xué)家們嘗試使用不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)基來(lái)替代傳統(tǒng)動(dòng)物血清的添加。早期的研究主要集中在對(duì)細(xì)胞系的篩選和馴化、對(duì)培養(yǎng)基的選擇和成分的優(yōu)化，以得到能夠在無(wú)血清條件下正常生長(zhǎng)和繁殖的細(xì)胞系。

在早期的研發(fā)過(guò)程中，科學(xué)家們還嘗試使用不同的細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)狂犬病疫苗。常用的細(xì)胞系包括Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞和CHO細(xì)胞等。這些細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)特性，且能夠高效地生產(chǎn)狂犬病病毒。通過(guò)對(duì)比不同細(xì)胞系的病毒產(chǎn)量和疫苗效力，Vero細(xì)胞具有較好的表現(xiàn)，以Vero細(xì)胞為細(xì)胞基質(zhì)的狂犬病疫苗也是現(xiàn)在生產(chǎn)和使用的主流，目前在無(wú)血清狂犬疫苗方向上進(jìn)行的研究也都以Vero細(xì)胞作為基質(zhì)。

在實(shí)際的產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中，還需對(duì)目標(biāo)細(xì)胞系進(jìn)行無(wú)血清馴化，通過(guò)一步法或連續(xù)梯度法篩選馴化，以期得到能夠在無(wú)血清條件下正常生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞株。使用一步法馴化細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞面對(duì)極大的培養(yǎng)基成分差距，通常產(chǎn)生很大壓力，少有細(xì)胞能夠成功接受，連續(xù)馴化使細(xì)胞梯度適應(yīng)培養(yǎng)基成分的變化，在實(shí)際中應(yīng)用更多（見(jiàn)表1）。

表1細(xì)胞連續(xù)馴化方法表

盡管設(shè)置了馴化梯度，當(dāng)從第三階段轉(zhuǎn)變至第四階段時(shí)也非常困難，增加馴化梯度，減小培養(yǎng)基成分變化是常用的手段，細(xì)胞馴化這一工作耗時(shí)長(zhǎng)，問(wèn)題多，需要足夠的時(shí)間與經(jīng)驗(yàn)，是無(wú)血清狂犬病疫苗研發(fā)的難點(diǎn)。

2.2馴化后細(xì)胞系的變化

經(jīng)過(guò)一系列的馴化過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境中正常生長(zhǎng)和增殖的基本要求，但在此過(guò)程中細(xì)胞為適應(yīng)新的生存環(huán)境也做出了改變，包括但不限于細(xì)胞形態(tài)改變、生長(zhǎng)增殖速度變化、培養(yǎng)模式調(diào)整等，近些年的研究中還發(fā)現(xiàn)無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞免疫刺激能力的影響，經(jīng)馴化后細(xì)胞的代謝組學(xué)發(fā)生變化，可能影響其表型和功能這些現(xiàn)象是否指向細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、發(fā)生變化的細(xì)胞是否還適合作為細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行病毒培養(yǎng)是實(shí)踐才能解決的問(wèn)題[2]

2.3大規(guī)模無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)現(xiàn)

在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方面，缺少血清保護(hù)的細(xì)胞貼壁能力減弱且更容易受到細(xì)胞損傷，傳統(tǒng)生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生高剪切力，可能影響細(xì)胞活性[3]，WAVE生物反應(yīng)器的推廣與使用給無(wú)血清疫苗的生產(chǎn)提供更優(yōu)良的條件。WAVE反應(yīng)器通過(guò)波浪式的搖擺進(jìn)行溫和且充分的混合，突破了傳統(tǒng)反應(yīng)器的局限，有效地減小了剪切力對(duì)細(xì)胞的影響，同時(shí)作為一次性反應(yīng)器系統(tǒng)，有效減少了污染風(fēng)險(xiǎn)，給無(wú)血清狂犬病疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.4純化工藝的優(yōu)化

純化工藝是疫苗生產(chǎn)的重要過(guò)程，盡可能地去除中間產(chǎn)品中的雜質(zhì)且保持抗原結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性一直是純化步驟的目標(biāo)。無(wú)血清培養(yǎng)的整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中添加物成分簡(jiǎn)單明確，降低了純化難度，進(jìn)一步降低疫苗中宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的殘留量4，避免高免疫原性和不必要的免疫反應(yīng)，使無(wú)血清疫苗表現(xiàn)出高效和低敏性。但同時(shí)無(wú)血清疫苗常見(jiàn)的效價(jià)較低問(wèn)題也給純化工藝帶來(lái)了挑戰(zhàn)。相信結(jié)合膜過(guò)濾技術(shù)和親和層析技術(shù)等新型純化技術(shù)的使用，未來(lái)將給無(wú)血清疫苗的質(zhì)量帶來(lái)提升。

3無(wú)血清狂犬病疫苗的臨床試驗(yàn)評(píng)估與進(jìn)展

3.1無(wú)血清狂犬病疫苗的臨床評(píng)估要點(diǎn)

在臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)接種者的不良反應(yīng)和免疫反應(yīng)來(lái)評(píng)估無(wú)血清狂犬病疫苗的安全性和免疫原性是首要任務(wù)。不良反應(yīng)包括局部反應(yīng)（如注射部位疼痛、紅腫）和全身反應(yīng)（如發(fā)熱、頭痛）。免疫反應(yīng)主要通過(guò)測(cè)定接種者血液中的抗體水平來(lái)評(píng)估，特別是中和抗體的水平，這些抗體能夠有效中和狂犬病病毒，防止病毒感染。作為傳統(tǒng)有血清狂犬病疫苗的迭代產(chǎn)品，無(wú)血清狂犬病疫苗的效果是否具有同等的效果更是我們關(guān)注的重點(diǎn)。通過(guò)與Vero細(xì)胞有血清疫苗或人二倍體狂犬病疫苗免疫效果和安全性的對(duì)比，證明無(wú)血清狂犬病疫苗的非劣效性，將是其代替?zhèn)鹘y(tǒng)有血清疫苗占領(lǐng)狂犬病疫苗市場(chǎng)的關(guān)鍵。此外，狂犬病疫苗的接種情景包括狂犬病毒暴露的前后，暴露后預(yù)防（PEP）更常見(jiàn)于實(shí)際中，因此模擬PEP臨床試驗(yàn)的結(jié)果也是關(guān)注重點(diǎn)。通常暴露后預(yù)防（PEP）的模擬通過(guò)在疫苗接種前為受試者在遠(yuǎn)離疫苗注射的部位（如大腿前外側(cè)）肌內(nèi)注射人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）來(lái)實(shí)現(xiàn)[5。在暴露前預(yù)防（PrEP）和PEP兩種免疫情況下都能達(dá)到免疫要求是對(duì)無(wú)血清狂犬病疫苗共同的期待。

3.2國(guó)外臨床試驗(yàn)進(jìn)展

早在上世紀(jì)末法國(guó)Sanofi公司就已經(jīng)展開(kāi)了無(wú)血清狂犬病疫苗的研發(fā)工作，并且于2009年成功開(kāi)展了針對(duì)PVRV-NG（新一代、無(wú)血清、無(wú)抗生素、純化的Vero細(xì)胞狂犬疫苗）無(wú)血清狂犬疫苗的首次臨床試驗(yàn)[]。

PVRV-NG的開(kāi)發(fā)基于Pitman-Moore病毒株，Sanofi公司此前使用同一毒株成功研制了人二倍體細(xì)胞疫苗（HDCV）和純化的Vero細(xì)胞狂犬病疫苗（PVRV）。PVRV-NG的生產(chǎn)不涉及任何動(dòng)物源或人源成分。PVRV-NG純度高，殘留DNA含量低（ lt;100pg/ 劑），符合歐洲藥典、世界衛(wèi)生組織和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)。但在針對(duì)其開(kāi)展的第五次臨床試驗(yàn)中（NCT01784874），未能證明其抗原相較于HDCV的非劣效性[8]。此后Sanofi公司對(duì)PVRV-NG配方進(jìn)行了升級(jí)，增加了抗原含量，重新配制為PVRV-NG2，并在隨后的一項(xiàng)I期臨床研究（NCT03145766）和兩項(xiàng)Ⅱ期臨床研究（NCT03965962和NCT04478084）中驗(yàn)證了PVRV-NG2的免疫原性和安全性在。

直至2024年底，Sanofi公司所組織開(kāi)展的相關(guān)臨床試驗(yàn)高達(dá)十項(xiàng)，其實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)包括我國(guó)、美國(guó)、法國(guó)、菲律賓和泰國(guó)等地，受試者涵蓋兒童和青少年以及成人。針對(duì)PVRV-NG2的臨床研究至今仍在進(jìn)行。

3.3國(guó)內(nèi)臨床試驗(yàn)進(jìn)展

相較于國(guó)外，國(guó)內(nèi)對(duì)于無(wú)血清狂犬病疫苗的研究開(kāi)展得較晚。盡管在Sanof公司開(kāi)展早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)就已經(jīng)注意到無(wú)血清狂犬病疫苗的廣闊前景[9-；但直至十年后才得到更廣泛的關(guān)注，并嘗試持續(xù)展開(kāi)對(duì)無(wú)血清狂犬疫苗的研究。

國(guó)內(nèi)狂犬疫苗市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)愈發(fā)激烈，尚無(wú)正式發(fā)售商品的無(wú)血清狂犬疫苗成了多家廠商近年的戰(zhàn)略目標(biāo)。近年來(lái)，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展進(jìn)一步推動(dòng)了無(wú)血清狂犬病疫苗的研發(fā)[]。目前，多款無(wú)血清狂犬病疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，顯示出良好的安全性和免疫原性，不僅能夠快速激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高滴度的中和抗體，且不良反應(yīng)發(fā)生率低，這些進(jìn)展為狂犬病的預(yù)防和控制提供了新的希望。

結(jié)語(yǔ)

無(wú)血清狂犬病疫苗以其提高的安全性和降低的生產(chǎn)成本顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。這類(lèi)疫苗能夠有效避免由動(dòng)物血清引起的過(guò)敏反應(yīng)和血清源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)其更加可控的生產(chǎn)工藝將提高疫苗的質(zhì)量。通過(guò)不斷的技術(shù)創(chuàng)新，無(wú)血清狂犬病疫苗有望成為未來(lái)狂犬病預(yù)防的主流選擇。

盡管無(wú)血清狂犬病疫苗的研發(fā)已取得顯著進(jìn)展，但仍面臨非劣效性、生產(chǎn)復(fù)雜性及公眾接受度等挑戰(zhàn)。優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果仍然是今后研發(fā)的重點(diǎn)。此外，通過(guò)教育和宣傳，提高公眾對(duì)新型疫苗的認(rèn)識(shí)和接受度也是推動(dòng)無(wú)血清疫苗廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

展望未來(lái)，無(wú)血清狂犬病疫苗的研究將繼續(xù)聚焦于提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果。無(wú)血清狂犬病疫苗的研發(fā)不僅是對(duì)傳統(tǒng)疫苗技術(shù)的重大突破，也是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一項(xiàng)重要進(jìn)展。通過(guò)不斷的技術(shù)創(chuàng)新和國(guó)際合作，無(wú)血清狂犬病疫苗有望在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用，為狂犬病的預(yù)防和控制提供有力的保障。未來(lái)，隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，無(wú)血清狂犬病疫苗的研究將不斷深入，為人類(lèi)健康事業(yè)作出更大的貢獻(xiàn)。

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收稿日期：2025-05-19

作者簡(jiǎn)介：黃馨瑩（1997—），女，滿(mǎn)族，碩士研究生。研究方向：生物檢測(cè)工程。