SPE-HPLC法測(cè)定參萎雙心顆粒中人參皂苷Rg₁ 與人參皂苷 Rb₁ 含量

【關(guān)鍵詞】 參萎雙心顆粒；固相萃取-高效液相色譜；人參皂苷 Rg₁ ；人參皂苷 Rb₁ ；含量測(cè)定 【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1007－8517（2025）12-0067-04

DOI： 10.3969/j .issn.1007-8517.2025.12.zgmzmjyyzz202512015

Abstract：Objective To establish a method for the determination of ginsenoside Rg₁ and ginsenoside Rb₁ in Shenlou Shuangxin Granules.MethodThesamplewaspurifiedbyaC18solid-phase extractioncartridge，andtheseparation was cariedoutona Waters Xselect CSH^TMCl8 column （ 250mm×4.6mm ， 5μm ）with a gradient elution using acetonitrile - water as the mobile phase at the flow rate of 1.0mL/min ，the detection wavelength of 203nm ，and the column temperature of 30qC .Result The concentration of ginsenoside Rg₁ ranged from 7.61 to 133.80μg/mL （ r²=1.0000 ），and ginsenoside Rb₁ showed good linear relationship with itspeak area in the range of concentration 5.24-92.21μg/mL （ r²=0.9998 ）. The average recovery of ginsenoside Rg₁ was 101.33% with RSD of 2.01% ，and that of ginsenoside Rb₁ was 95.71% with RSD of 2.82% .Conclusion The method is rapid，simple，accurate and can be used for the quality control of Shenlou Shuangxin Granules.

Key words： Shenlou Shuangxin Granules；SPE-HPLC；Ginsenoside Rg₁ ；Ginsenoside Rb₁ ；Content Determination

參萎雙心顆粒來源于王階教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方參萎雙心方（原名活血安心方），參萎雙心方是一種治療冠心病的新型中藥方劑。經(jīng)實(shí)踐證明，有確切的臨床療效。參萎雙心顆粒對(duì)原方劑型進(jìn)行改良，進(jìn)行中藥1.1類新藥的研發(fā)。參萎雙心顆粒由三七、丹參、黃芪、酸棗仁、瓜萎、薤白、銀杏葉7味中藥組成，具有益氣復(fù)脈、活血化、寧心安神之功效[1]，臨床上用于痰瘀互結(jié)所致的胸痹心痛、憋氣、舌質(zhì)紫暗、苔白膩，冠心病心絞痛見上述證候者。三七為此方中的重要組成部分，人參皂苷 Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 為三七中的有效成分[2]，人參皂苷 Rg₁ 有抗心肌缺血再灌注損傷、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌血管再生、改善心肌細(xì)胞肥厚、抗動(dòng)脈血栓形成等藥理作用[3-5]；人參皂苷Rg₁ 有治療心肌缺血再灌注損傷的藥理作用[。參萎雙心顆粒為中藥新藥，尚無(wú)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的研究，為有效地控制本品的質(zhì)量，保證其臨床用藥的療效，故采用固相萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC）對(duì)人參皂苷 Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 的含量進(jìn)行測(cè)定。

1儀器與試劑

1.1儀器Thermo Scientific Vanquish高效液相色譜儀（四元泵、在線真空脫氣系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、Chromelon網(wǎng)絡(luò)版在線工作站）；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；MS204DU電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；STX1202ZH電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司］；Copure？C18SPE柱（ 500mg/6mL ）。

1.2藥品與試劑參萎雙心顆粒（新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：SL230915、SL230916、SL231101、SLYF231103、SLYF231104、SL230701、SL230702、SL230703、SL230704、SL230705）；參萎雙心顆粒陰性樣品（新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：SLYX231102）；人參皂苷 Rg₁ 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110703-202235，純度： 98.5% ）；人參皂苷 Rb₁ 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110704-202331，純度： 93.8% ）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isherScientificUSA）；甲醇（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）；純化水（自制）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters Xselect CSH^TM 色譜柱（ 4.6mm×250mm ， 5μm ）；柱溫： 30% ：流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫（ 0～20 min， 20% A； 20～33min ， 20%24% ； 33～45 min ， 24%34%A . 45～60min ， 34%38%A ）；檢測(cè)波長(zhǎng)： 203nm ；流速： 1mL/min ；進(jìn)樣量：10μL 。理論板數(shù)按人參皂苷 Rg₁ 峰計(jì)算應(yīng)不低于 4000 。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg₁ 對(duì)照品 11.32mg 、人參皂苷 Rb₁ 對(duì)照品10.24mg分別置于 10mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于容量瓶中，加甲醇制成每 1mL 含人參皂苷 Rg₁33.45μg 、人參皂苷 Rb₁23.05μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取參萎雙心顆粒適量，研細(xì)，過80目篩，精密稱取本品粉末 0.25g 置于錐形瓶中，加入 20mL 甲醇，稱定重量，加熱回流^1h ，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液 10mL ，蒸干，殘?jiān)铀?5mL 溶解后加在C18固相萃取小柱（ 500mg/6mL ，預(yù)先用 5mL 甲醇， 5mL 水活化）上，棄去流出液，用水 10mL 淋洗，棄去淋洗液，用 80% 甲醇 4.5mL 洗脫至5mL容量瓶中，定容至刻度， 0.45μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液的制備稱取處方中不含 三七的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下操作方法制備 陰性供試品溶液。

2.3專屬性考察分別取陰性供試品溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液注入色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)表明陰性樣品無(wú)干擾，專屬性良好。

A.陰性溶液；B.供試品溶液；C.對(duì)照品溶液 1.人參皂苷 Rg₁ ；2.人參皂苷 Rb₁

圖1專屬性色譜圖

2.4線性關(guān)系考察取 1mL 中含有 167.25μg 人參皂苷 Rg₁ 和 115.26μg 人參皂苷 Rb₁ 的混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，依次注人液相色譜儀中，記錄色譜峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷 Rg₁ 回歸方程為 Y=0.052X+0.0112 （ r²=1.0000 ；人參皂苷 Rb₁ 回歸方程 Y=0.0465X+ 0.022 （ r²= 0.9998）。結(jié)果表明人參皂苷 Rg₁ 、人參皂苷 Rb₁ 分別在濃度為 7.61～133.80μg/mL 和 5.24～ 92.21μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度分別為 33.45μg/ mL 、 23.05μg/mL 的人參皂苷 Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果人參皂苷Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 的峰面積RSD分別 1.08% ！0.72% （ n=6 ，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（批號(hào)：SLYF231104）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果測(cè)得6份樣品中人參皂苷 Rg₁ 及人參皂苷 Rb₁ 的平均含量分別 、 950.20μg/g ，RSD分別為2.49% 、 2.90% ，表明此方法重復(fù)性良好。

2.7中間精密度試驗(yàn)由同一實(shí)驗(yàn)室A、B兩位檢驗(yàn)人員，在不同日期取同一樣品（批號(hào)：SLYF231104）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果人參皂苷Rg₁ 與人參皂苷 Rb₁ 含量的RSD分別為 2.76% ？

2.66% （ n=12 ），表明方法中間精密度較好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)將制備好的樣品（批號(hào)：SLYF231104）溶液于室溫下保存，分別于 ^0h 、1h、 3h 、 ^5h 、 ^7h 、 ^14h 、 24h ！ 48h 測(cè)定，計(jì)算人參皂苷 Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 的峰面積RSD分別1.76% 、 1.56% ，結(jié)果表明樣品在 ^48h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收試驗(yàn)精密稱取已知含量的參萎雙心顆粒（批號(hào)：SLYF231104）6份，每份約0.125g ，精密加入適量人參皂苷 Rg₁ 、人參皂苷Rb₁ 混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表1和表2。人參皂苷 Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 的加樣回收率均符合相關(guān)要求，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表1人參皂苷 Rg₁ 回收率試驗(yàn)表

表2人參皂苷 Rb₁ 回收率試驗(yàn)表

2.10含量測(cè)定按“2.2.2”項(xiàng)下樣品溶液制備方法對(duì)10批樣品進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見表3。

表3樣品含量測(cè)定結(jié)果表

表3 （續(xù)）

3討論

該處方中的黃芪、薤白、酸棗仁均含有皂苷類成分[7-9]，且人參皂苷 Rg₁ 和人參皂苷 Rb_r 為末端吸收，干擾峰眾多。目前三萜皂昔的前處理方法主要是用乙醚或三氯甲烷脫脂后用水飽和正丁醇萃取或者通過固相萃取來實(shí)現(xiàn)除雜和皂苷的純化[10]，傳統(tǒng)的液液萃取溶劑用量較大，具有一定的環(huán)境危害性和生理毒性；固相萃取技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的樣品前處理新技術(shù)，與液液萃取法相比，固相萃取法有樣品用量少、操作方便、除雜效果好、目標(biāo)成分回收率高等優(yōu)點(diǎn)[1-12]。本研究采用固相萃取技術(shù)避免使用水飽和正丁醇多次萃取，操作更加方便，實(shí)現(xiàn)了人參皂苷 Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 的除雜與富集。

本研究對(duì)于提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間、物料比、淋洗劑和洗脫劑的選擇進(jìn)行了考察，確定了最佳提取條件。考察了Copure?C18、Copure？HLB、NanoChromSelectCoreHR-C18、綠盟C18，其中綠盟SPE柱未能將目標(biāo)成分萃取出來，可見不同廠家的C18 SPE 柱也存在一定差異，Copure@C18和NanoChrom SelectCoreHR-C18含量無(wú)顯著性差異，均優(yōu)于Copure@HLBSPE柱，綜合考慮成本、含量，選擇Copure@C18 SPE 柱。本方法采用C18固相萃取小柱分離了參萎雙心顆粒中人參皂苷Rg₁ 和人參皂苷 Rb₁ 兩種三萜皂苷，為該類化合物的分離檢驗(yàn)提供了參考。

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（收稿日期：2024-09-23 編輯：劉斌）